0s，72°C延伸40s，72°C后延伸10min，40个循环。
[0094] 3、PCR反应结束后，取5μ1扩增产物到质量分数为2%的琼脂糖凝胶，于5V/cm的电 场中进行电泳，经GoldView染色后，于凝胶成像系统上观察拍照。（26S rRNA D1/D2区扩增 产物电泳图参见图2; ITS2区序列扩增产物电泳图参见图3)
[0095](五）·测序
[0096] 1、将PCR扩增产物分别使用DNA纯化试剂盒进一步纯化，纯化后的DNA产物送DNA测 序公司进行测序。测序引物为PCR扩增引物。
[0097] 2、26S rDNA基因 D1/D2区域扩增产物序列Seql如下：
[0098] GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACCGGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAGAGCTCAAAT TTGAAAGCTGGCTCCTTCGGAGTCCGCATTGTAATTTGCAGAGGATGCTTTGGGTGCGGCCCCCGTCTAAGTGCCCT GGAACGGGCCGTCAGAGAGGGTGAGAATCCCGTCTTGGGCGGGGTGTCCGTGCCCGTGTAAAGCTCCTTCGACGAGT CGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAATGGGTGGTAAATTTCATCTAAAGCTAAATACTGGCCGGAGACCGATAGCG CACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTTAAACAGCACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAG CGCTTGCGACCAGACTCGCCCGCGGGGTTCAGCCGGCATTCGTGCCGGTGTACTTCCCCGTGGGCGGGCCAGCGTCG GTTTGGGCGGCCGGTCAAAGGCCCCTGGAATGTAGTACCCTCCGGGGTACCTTATAGCCAGGGGTGCAATGCGGCCA GCCTGGACCGAGGAACGCGCTTCGGCACGGACGCTGGCATAATGGTCGTAAACGACCCGTCTTGAAACACGGACC
[0099] 3、ITS2区扩增产物序列Seq2如下：
[0100] GCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACG CACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGTT GGGTCGCCGTCCCCCTCTCCGGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGATCCTCGAGCGTATGGG GCTTTGTCACATGCTCTGTAGGATTGGCCGGCGCCTGCCGACGTTTTCCAACCATTCTTTCCAGGTTGACCTCGGAT CAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA
[0101] (六）·序列分析
[0102] 1、将测试菌株1的26S rDNA基因 D1/D2区域扩增产物序列Seql提交到GenBank基因 序列数据库，与库中所有真菌的同源序列进行相似性比较。与其相似度最高的菌种有： Aspergillus niger、Aspergillus ochraceus、Aspergillus tubingensis和Aspergillus heteromorphus，且相似度都是 100%。
[0103] 2、再将测试菌株2的ITS2区扩增产物序列Seq2提交到GenBank基因序列数据库，与 这几种菌种的同源序列进行相似性比较。比对结果为只与Aspergillus niger的相似度最 高，为100%，鉴定结果正确。
[0104] 实施例2
[0105]测试菌株2:来自皮衣上生长的霉菌 [0106] (一菌株的培养与收集
[0107] 将皮衣上的真菌孢子接种到Η)Α平板上活化培养4~5天，温度25°C，光照12L:12D。 挑选单菌落到新的PDA平板上继续培养4~5天。当菌丝长满培养基表面并未产孢时，直接从 平板上刮取菌丝。
[0108] (二）· DNA提取(改良CTAB法）
[0109] 1、将菌丝用MQ液洗2遍
[0110] 2、加入500yL 5XCTAB(含1%β-巯基乙醇），液氮中速冷30s，立即65°C30s，反复3 次
[0111] 3、加入1/3体积的玻璃珠，漩涡振荡器上高速振荡4min~5min
[0112] 4、加入蛋白酶K，65°C保温30min，每隔lOmin摇匀1次
[0113] 5、加入等体积酸:氯仿:异戊醇(25:24:1，V/V/V)，12000r/min离心10min
[0114] 6、将上清液移入到新的离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇（24: 1，V/V)， 12000r/min离心 lOmin。
[0115] 7、在上清中加入2倍体积预冷的无水乙醇，-20°C静置20min-30min，12000r/min离 心10min〇
[0116] 8、倒掉上清，加70 %的酒精200yL洗沉淀，室温干燥
[0117] 9、加入 lOOyLTE 使 DNA 完全溶解 10、加入 1?他864(1〇1^/1^)，65°(3保温3〇1^11以上11、 重复步骤7~9，最后DNA溶于50yLddH20中。
[0118] (三）.DNA样品的检测
[0119] 1、取5ulDNA溶液到质量分数为2%的琼脂糖凝胶中，在电泳缓冲液为1 XTBE，电压 为120V的条件下电泳40min，用GoldView染色，在凝胶成像仪上观察DNA分子的大小、完整性 及电泳条带的清晰度，进行拍照(参见图4)。
[0120] 2、使用紫外分光光度计检测提取的DNA的吸光值A260和A280,其A260/A280比值为 1.83/1.82，按以下公式计算DNA浓度：
[0121] c=A*N*50
[0122] C 一 DNA 浓度，单位为 ng/yL;
[0123] A-260nm处的吸光值
[0124] N-DNA稀释倍数
[0125] 获得DNA产物浓度为245ng/yL和296ng/yL，DNA浓度稀释到lOOng/yL。
[0126] (四）.PCR 扩增
[0127] 分别扩增测试菌株2的26S rRNA D1/D2区和ITS2区序列
[0128] 1、PCR反应管中加入反应体系：2XTaq PCR Mix.........25μ1
[0129] 上游引物 10μΜ............ΙμL
[0130] 下游引物 10μΜ............ΙμL
[0131] DNA 模版.....................6μ1
[0132] ddH20 至 50μ1............17μ1
[0133] 扩增时，应设立空白对照(不含DNA模板，以水代替）。
[0134] 2、将PCR反应管放入PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增:95°C预变性3min，95°C 变性30s，55°C退火30s，72°C延伸40s，72°C后延伸lOmin，40个循环。
[0135] 3、PCR反应结束后，取5μ1扩增产物到质量分数为2 %的琼脂糖凝胶，于5V/cm的电 场中进行电泳，经GoldView染色后，于凝胶成像系统上观察拍照。（26S rRNA D1/D2区扩增 产物电泳图参见图5; ITS2区序列扩增产物电泳图参见图6)
[0136] (五）·测序
[0137] 1、将PCR扩增产物分别使用DNA纯化试剂盒进一步纯化，纯化后的DNA产物送DNA测 序公司进行测序。测序引物为PCR扩增引物。
[0138] 2、26S rDNA基因 D1/D2区域扩增产物序列Seq3如下： GGAAAAGAAACCAACCGGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAGAGCTCAAATTTGAAATCTGGCCCCTC CGGGGTCCGAGTTGTAATTTGCAGAGGATGCTTCGGGTGCGGCCCCTGTCTAAGTGCCCTGGAACGGGCCGTCAGAG AGGGTGAGAAT