检测DACT2基因启动子区CpG岛甲基化的PCR引物、方法和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生命科学和生物医学领域，特别涉及用于检测DACT2 (dapper， antagonist of beta_catenin，DACT)基因启动子区的CpG岛甲基化的PCR引物、方法和试 剂盒。
【背景技术】
[0002] 结肠癌是全世界常见的恶性肿瘤，其病死率位居恶性肿瘤死因的第二位，原因在 于进展后的结肠癌预后不好。根据国际癌症研究组织（IARC)2005年公布的数据显示，大 肠癌的发病率呈明显上升趋势，其中主要为结肠癌，我国结肠癌的标准发病率为13.29/10 万。据调查，2000~2005年我国新增发病人数为12万，发病率呈明显上升趋势。结肠癌的 发生与饮食、环境、遗传等密切相关，是多种基因协同作用的结果。结肠癌的防治研究不断 引起人们的重视，通过对相关基因的检测，对预测结肠癌的发生、发展、治疗效果及预后判 断有一定的临床指导意义。
[0003] 表观遗传修饰的异常改变与癌症有着十分密切的联系，全基因组范围内的表观遗 传修饰改变已经成为癌症的新标记。最新的观点认为，癌症的发生发展不仅仅与遗传改变 相关，表观遗传修饰的异常改变也贯穿于癌症的各个阶段。因此，这就意味着癌症在一定程 度上是一种表观遗传疾病。DNA甲基化作为表观遗传修饰的重要组成部分，其在癌症的早期 诊断、治疗、预后以及预防等方面的研究也取得了相应的成果。
[0004] DACT2是DACT家族成员之一，这个家族蛋白是WNT通路重要调节蛋白。DACT2在 结肠癌肿瘤组织表达下调或沉默，而DACT2在正常结肠组织中呈强表达。DACT2表达沉默是 由于启动子超甲基化导致的。在结肠癌细胞中过表达DACT2,可在体外和体内实验中抑制 肿瘤细胞生长。并且，DACT2过表达可有效抑制结肠癌细胞的肺转移。这些作用是通过对 Wnt/β -catenin通路抑制而发挥的。DACT2与β -catenin, LEF1相互作用，并在细胞核中 抑制β-catenin-LEFl转录复合体形成。而在细胞质中，恢复E-cadherin-0-catenin复 合物在细胞膜上的分布，并阻止β-catenin入核。
【发明内容】
[0005] 为了弥补上述现有技术的不足，本发明提出一种用于检测DACT2基因启动子区的 CpG岛甲基化的PCR引物、方法和试剂盒。
[0006] 本发明的技术问题通过以下的技术方案予以解决：
[0007] -种用于检测DACT2基因启动子区的CpG岛甲基化的PCR引物，所述PCR引物的 碱基序列为：
[0008] 上游引物 SEQ ID N0. 3 :5' -TGGTTATAGATTTTAGTTTATTTTGG-3，
[0009] 下游引物 SEQ ID NO. 4 :5' -CAACCCCTACAACTCCTACAAC-3'。
[0010] 以上技术方案中，利用特异性的PCR引物用于对DACT2基因启动子区的CpG岛DNA 片段进行PCR扩增，并对其进行测序，可同时得到每个CpG岛的甲基化比例，使检测结果更 加具体准确，更好的为结肠癌患者个体化治疗提供有益指导。
[0011] -种对用上述的PCR引物进行扩增反应得到的扩增产物进行测序的测序引物，所 述测序引物的碱基序列为上述的 SEQ ID N0. 3 :5' -TGGTTATAGATTTTAGTTTATTTTGG-3'。
[0012] -种检测DACT2基因启动子区的CpG岛甲基化的方法，包括：
[0013] (1)提取样本中的DACT2启动子基因 CpG岛DNA片段并提纯；
[0014] (2)将经步骤（1)提纯的DNA进行亚硫酸氢盐处理；
[0015] (3)以经步骤⑵处理的DNA作为模板，使用所述的PCR引物进行PCR扩增，获得 PCR扩增产物；
[0016] (4)使用PCR产物纯化试剂对所述PCR扩增产物进行纯化处理；
[0017] (5)对所述PCR扩增产物进行测序；
[0018] (6)根据步骤（5)的测序结果，得到CpG岛的甲基化比例。
[0019] 采用直接亚硫酸氢盐基因组测序法，可检测出与结肠癌病人生存预后相关的 DACT2基因甲基化。
[0020] 优选地，在所述步骤（5)中，使用所述上游引物SEQ ID N0. 3对所述PCR扩增产物 进行测序。
[0021] 优选地，所述样本为结肠癌组织或细胞。
[0022] 优选地，在步骤（3)中，所述PCR扩增的反应条件为95°C预变性10分钟，94°C变性 20秒，58°C复性20秒，72°C延伸1分钟，循环40次；72°C再延伸10分钟。
[0023] -种用于检测DACT2基因启动子区的CpG岛甲基化的试剂盒，其含有所述的用于 检测DACT2基因启动子区的CpG岛甲基化的PCR引物。
[0024] 优选地，还包括测序引物，所述测序引物为所述上游引物SEQ ID N0. 3。
[0025] 优选地，还包括核酸提取试剂、亚硫酸氢盐处理试剂、测序纯化试剂盒、PCR扩增试 剂和PCR产物纯化试剂中的至少一种。
[0026] 优选地，所述亚硫酸氢盐处理试剂为亚硫酸氢钠；所述测序纯化试剂盒包括Big Dye?，5XBig Dye测序缓冲液和去离子水；所述PCR扩增试剂包括10XPCR缓冲液、MgCl2、 dNTP、Taq酶和去离子水；所述PCR产物纯化试剂包括单链特异性3' 一 5'核酸外切酶和虾 碱性磷酸酶。
【附图说明】
[0027] 图1是本发明实施例1中在结肠癌细胞系中的DACT2mRNA的表达水平；
[0028] 图2是本发明实施例2中的DACT2基因启动子的CpG岛的识别结构图；
[0029] 图3是本发明实施例2中的以HCT116细胞株为例的测序结果；
[0030] 图4是本发明实施例2中的DACT2基因启动子区的CpG岛甲基化水平；
[0031] 图5是本发明实施例3中对结肠癌患者的DACT2基因启动子区的CpG岛甲基化水 平以及预后的Kaplan-Meier分析曲线。
【具体实施方式】
[0032] 下面对照附图并结合优选的实施方式对本发明作进一步说明。
[0033] 本发明提供一种用于检测DACT2基因启动子区的CpG岛甲基化的PCR引物，在具 体实施方式中，所述PCR引物的碱基序列为：
[0034] 上游引物 SEQ ID N0. 3 :5' -TGGTTATAGATTTTAGTTTATTTTGG-3，
[0035] 下游引物 SEQ ID NO. 4 :5' -CAACCCCTACAACTCCTACAAC-3'。
[0036] 本发明还提供一种对用上述的PCR引物进行扩增反应得到的扩增产物进行测序 的测序引物，在【具体实施方式】中，所述测序引物的碱基序列为上述的SEQ ID NO. 3 :5'-TGGT TATAGATTTTAGTTTATTTTGG-3'。
[0037] 本发明还提供一种检测DACT2基因启动子区的CpG岛甲基化的方法，在具体实施 方式中，该方法包括：
[0038] (1)提取样本中的DACT2启动子基因 CpG岛DNA片段并提纯；
[0039] (2)将经步骤（1)提纯的DNA进行亚硫酸氢盐处理；
[0040] (3)以经步骤⑵处理的DNA作为模板，使用所述的PCR引物进行PCR扩增，获得 PCR扩增产物；
[0041] (4)使用PCR产物纯化试剂对所述PCR扩增产物进行纯化处理；
[0042] (5)对所述PCR扩增产物进行测序；
[0043] (6)根据步骤（5)的测序结果，得到CpG岛的甲基化比例。
[0044] 为更详细地了解本发明，以下通过优选的实施例对本发明作进一步的阐述。
[0045] 实施例1
[0046] 用于检测DACT2基因 mRNA表达的PCR引物的碱基序列为：
[0047] 上游引物 SEQ ID NO. 1 :5' -GCTGAGACAACAGGACATCG-3'
[0048] 下游引物 SEQ ID NO. 2 :5, -ACCGTCGCTCATCTCGTAAA-3,。
[0049] 检测DACT2基因 mRNA表达的过程具体如下：
[0050] 利用 Trizol 法提取细胞的总 RNA 并经 Applied Biosystems 公司 cDNA Reverse Transcription试剂盒反转录为cDNA，操作均按试剂盒推荐方法进行。根据人DACT2核苷 酸序列设计用于半定量PCR的上游引物DACT2-F(SEQ ID NO. 1)和下游引物DACT2-R(SEQ ID NO. 2)，引物序列如下：
[0051] 引物 DACT2-F: 5，-GCTGAGACAACAGGACATCG-3，
[0052] 引物 DACT2-R: 5，-ACCGTCGCTCATCTCGTAAA-3 '
[0053] 以β-actin为内参，其扩增引物为：
[0054] 上游引物 β-actin-F(SEQ ID N0. 5) :5, -GTCTTCCCCTCCATCGTG-3,；
[0055] 下游引物 P-actin-R(SEQ ID N0.6) :5' -AGGGTGAGGATGCCTCTCTT-3'。
[0056] 其中，细胞为 8 种肠癌细胞系：Cac〇-2、DLD-l、HCT116、HT-29、L0V0、LS180、SW480、 SW620〇
[0057] 使用半定量PCR法同时检测以上8种肠癌细胞系中的DACT2基因的mRNA表达水 平，如图1所示的检测结果显示在8条结肠癌细胞中，有5条细胞株DACT2基因的mRNA水 平低于正常肠粘膜对照组织的水平，即L0V0、LS180、HT-29、DLD-1、HCT116表达沉默。
[0058] 实施例2
[0059] (1)提取结肠癌细胞中的DACT2启动子基因 CpG岛DNA片段并提纯，可以用分光光 度计检测DNA纯度与含量。具体如下：
[0060] 结肠癌细胞的基因组DNA提取使用QIAGEN公司的基因组DNA提取试剂盒，操作参 照试剂盒进行。具体地，离心收集细胞，用200 μ 1缓冲液PBS洗涤细胞一次，细胞重悬于 200 μ 1缓冲液PBS中。剧烈颠倒充分混匀后加入20 μ 1浓度为20mg/ml蛋白酶Κ溶液，充 分混匀后56°C放置lOmin。冷却后加入200 μ 1异丙醇，颠倒充分混匀，出现絮状沉淀，然后 加入一个吸附柱AC中，6000g离心3min，弃废液。分别用750μ 1抑制物去除液AWl、700l·! 1 漂洗液AW2和500 μ 1漂洗液WB洗涤吸附柱AC，20000g离心lmin，最后加入200 μ 1洗脱缓 冲液ΑΕ洗脱收集基因组DNA，得到的DACT2启动子基因 CpG岛DNA片段（SEQ ID NO. 7)如 下：
[0061] 5 ' -TGGCCACAGATTCCAGCCCACCTTGGCGACCTGCGGAGCCGGGGGCGGAGAGAGGAGGCGCAGGAG GACCCGCGACACAGCTCGGGATCCGCGCGCGCTGGGCCTCCGGCGCCGCTCGTGGGGTTCGGGAGGCCGGGACCCTG CCCGGGAGATGTGGACGCCGGGCGGACCCCCGGGGTCCGCGGGCTGGGACCGCCGTAGGTTGGGCGCGAGGTTGCGC GCGGCGTTCGCGGGGCTGCAGGAGCTGCAGGGGCTG-3'
[0062] 从DACT2启动子基因的-4bp位