置的CpG岛为第一个CpG岛，到之后的85bp位置 的第15个CpG岛，DACT2基因启动子的CpG岛的识别结构图如图2所示。
[0063] (2)将经步骤（1)提纯的DNA进行亚硫酸氢盐处理，具体如下：
[0064] 基因组DNA的亚硫酸氢钠修饰使用Zymo Research公司的EZ DNA 11161:115^1:;[011-〖01(11^1:，操作参照试剂盒推荐方法进行。具体地，将2(^10嫩加入13(^1 CT转换试剂，混匀，于98 °C孵育lOmin，64°C孵育2. 5h，4°C保存不超过20h。将柱子置于收集 管中，向柱中加入600μ 1 Μ-Binding Buffer，接着加入上述DNA混合液于柱子中，上下颠倒 混匀，离心，弃废液。用Ι100μΙ M-wash Buffer洗涤柱子后加入200μ1 M-Desulphonation Buffer,室温包被15_20min，离心，弃废液。用200μ1 M-wash Buffer洗涤柱子2次后，加 入 10 μ 1 的 M-Elution Buffer 洗脱收集 DNA。
[0065] (3)以经步骤⑵处理的DNA作为模板，使用所述的PCR引物进行PCR扩增，获得 PCR扩增产物。具体如下：
[0066] 使用特异性的PCR引物：
[0067] DACT2-BGS-F(SEQ ID N0. 3) :5' -TGGTTATAGATTTTAGTTTATTTTGG-3'
[0068] DACT2-BGS-R(SEQ ID Ν0· 4) :5, -CAACCCCTACAACTCCTACAAC-3，。
[0069] 以经步骤（2)处理的DNA作为模板，利用上述PCR引物进行PCR扩增。反应 体系为 20μ1，其中含有 10XPCR buffer 2yl，Taq 酶 0·2μ1，2·5μΜ 的（1ΝΤΡ1·2μ1， MgCl21.6y 1，DNA 20ng，10yM的PCR引物各0·3μ 1，灭菌去离子水补齐至20μ 1。PCR反应 条件为95°C预变性10分钟，94°C变性20秒，58°C复性20秒，72°C延伸1分钟，循环40次； 72°C再延伸10分钟。扩增完成后可以用琼脂糖电泳法检测是否扩增成功。
[0070] (4)使用PCR产物纯化试剂对步骤（3)中的PCR扩增产物进行纯化处理，具体如 下：
[0071] PCR产物纯化试剂盒采用ExoSAP-IT，其包含两种酶：Exonuclease I (单链特异性 3' 一 5'核酸外切酶）和Shrimp Alkaline Phosphatase (ife下喊性憐酸酶），以去除PCR产 物中剩余的dNTPs和引物。2 μ 1 PCR扩增产物与0. 8 μ 1 ExoSAP-IT混合后在37°C温育15 分钟，再在80°C温育15分钟，得PCR纯化产物。
[0072] (5)对所述PCR扩增产物进行测序，具体如下：
[0073] 按如下配置测序PCR反应，其中使用DACT2-BGS-F作为测序引物进行测序：
[0074]
[0075] 实施PCR反应：96°C，1分钟；96°C，10秒；50°C，5秒；60°C，4分钟，共35个循环； 4°C，^?。在微量离心柱中加入〇· 75ml约7. 5% (g/ml)的S印hadex-G50的水溶液，以 3000rpm转速离心2分钟。将测序PCR反应产物小心加入刚制备好的Sephadex_G50分离 柱中，以3000rpm转速离心2分钟，即得纯化的测序PCR反应产物。把纯化的测序PCR 反应产物加入含10 μ 1 Hi-Di? Formamide (高度去离子化甲酰胺）的96孔板中，在ABI 2700仪上95°C变性5分钟，之后立即放入冰上冷却直至上机（ABI PRISM 7000Sequence Detection System, Applied Biosystems)。测序结果通过 BioEdit 软件分析。以 HCT116 细胞株为例，其测序结果如图3所示。
[0076] 对实施例1中的8种肠癌细胞进行上述检测后，如图4所示的结果显示，实施例1 中的5种没有DACT2表达的结肠癌细胞系中的DACT2基因启动子的Cp岛呈重甲基化状态， 即：loVo细胞：CpG岛的第1~3、5-11位点的甲基化比例为100%，其余位点的甲基化比例 为50-99% ;lsl80细胞：CpG岛的第1、5-9、11-13位点的甲基化比例为50-99%，其余位点 的甲基化比例为1-49% ;HT29细胞：CpG岛的第14-15位点的甲基化比例为50-99%，其余 位点的甲基化比例为100% ;DLD1细胞：CpG岛的第14位点的甲基化比例为50-99%，其余 位点的甲基化比例为100%;HCT116细胞：CpG岛的15个位点的甲基化比例均为100%)，而 对照正常结肠组织中和有DACT2表达的结肠癌细胞系（Caco-2、SW480和SW620)中，DACT2 基因启动子无甲基化修饰。上述结果表明，结肠癌细胞中DACT2启动子甲基化明显高于正 常细胞，DACT2基因在结肠癌发生过程中，由于启动子区的CpG岛甲基化而表达沉默，DACT2 可作为检测结肠癌的潜在生物标记物。
[0077] 实施例3
[0078] 应用实施例2中的直接亚硫酸氢盐基因组测序法大批量检测结肠癌组织中DACT2 甲基化状态
[0079] 收集结肠癌病人结肠样品进行提取样品基因组DNA，并进行亚硫酸氢钠修饰，具体 方法如实验例2所述。根据测序结果判定标准为：从_4bp位置的CpG岛为第一个CpG岛， 到之后的第15个CpG岛，80%以上的CpG岛甲基化比例大于25%即为甲基化阳性。
[0080] 如图5所示，对67位结肠癌患者组织样品通过直接亚硫酸氢盐基因组测序进行 DACT2甲基化检测。结果发现67个临床患者结肠癌组织样品中有29个为DACT2甲基化阳 性，检测率为43. 3%。
[0081] 我们评估了 DACT2在结肠癌病人预后中的临床应用，分析了 DACT2甲基化和临床 特征的相关性，包括病人年龄、性别、肿瘤阶段和生存数据。C0X多因素分析发现，DACT2甲 基化其与患者年龄、性别、肿瘤阶段没有统计学意义关系。然而，肿瘤组织中存在DACT2甲 基化的患者预后生存时间显著低于非甲基化的患者（P = 〇. 006)。Kaplan-Meier 5年生存 曲线显示肿瘤组织中存在DACT2甲基化的I-III期患者存活率显著低于非甲基化的患者。
[0082] 在图 5 中，以肿瘤样本编号为 T86、T89、T90、T93、T101 为例，normal-l，normal-2、 normal-3分别表示来自3个不同的个体的结肠正常组织，检测结果中T86、T89、T90、T93、 T101全为阳性。
[0083] 图5中的N = 25, N = 29分别表示在??Μ I -III期病人中，DACT2甲基化的病人 为25个，没有甲基化的病人为29个；N = 9，N = 4分别表示在TW IV期病人中，DACT2甲 基化的病人为4个，没有甲基化的病人为9个。
[0084] 从实施例3可知，在43. 3%的结肠癌病人中DACT2呈甲基化状态，但在正常对照中 没有甲基化。多因素分析发现有DACT2甲基化的病人的生存时间显著低于无甲基化病人的 生存时间（P = 〇· 006)。Kaplan-Meier生存曲线显示在TNMI-III期结肠癌病人中，DACT2 甲基化病人的生存时间显著降低。在早期结肠癌病人中，DACT2甲基化是独立的预后因子。 因此，在结肠组织检测DACT2基因甲基化，可作为肿瘤预后评估指标。
[0085] 通过以上实施例中的PCR引物、方法和试剂盒，可检测出与结肠癌病人生存预后 相关的DACT2基因甲基化，从而作为肿瘤预后评估指标，特异性好，准确度高。
[0086] 以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定 本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的技术人员来说，在不脱 离本发明构思的前提下，还可以做出若干等同替代或明显变型，而且性能或用途相同，都应 当视为属于本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种用于检测DACT2基因启动子区的CpG岛甲基化的PCR引物，其特征在于：所述 PCR引物的碱基序列为： 上游引物 SEQ ID NO. 3 ;5, -TGGTTATAGATTTTAGTTTATTTTGG-3' 下游引物沈Q ID NO. 4 ;5' -CAACCCCTACAACTCCTACAAC-3'。2. -种对用权利要求1所述的PCR引物进行扩增反应得到的扩增产物进行测序的测序 引物，其特征在于：所述测序引物的碱基序列为权利要求1中所述的SEQ ID NO. 3 ;5'-TGGT TATAGATTTTAGTTTATTTTGG-3^ 〇3. -种检测DACT2基因启动子区的CpG岛甲基化的方法，其特征在于，包括： (1) 提取样本中的DACT2启动子基因 CpG岛DNA片段并提纯； (2) 将经步骤（1)提纯的DNA进行亚硫酸氨盐处理； (3) W经步骤（2)处理的DNA作为模板，使用权利要求1中所述的PCR引物进行PCR扩 增，获得PCR扩增产物； (4) 使用PCR产物纯化试剂对所述PCR扩增产物进行纯化处理； (5) 对所述PCR扩增产物进行测序； (6) 根据步骤（5)的测序结果，得到CpG岛的甲基化比例。4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于；在所述步骤巧）中，使用权利要求1中的所 述上游引物SEQ ID NO. 3对所述PCR扩增产物进行测序。5. 如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述样本为结肠癌组织或细胞。6. 如权利要求3所述的方法，其特征在于；在步骤（3)中，所述PCR扩增的反应条件为 95 °C预变性10分钟，94 °C变性20砂，58 °C复性20砂，72 °C延伸1分钟，循环40次；72 °C再 延伸10分钟。7. -种用于检测DACT2基因启动子区的CpG岛甲基化的试剂盒，其特征在于；含有权 利要求1中所述的用于检测DACT2基因启动子区的CpG岛甲基化的PCR引物。8. 如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：还包括测序引物，所述测序引物为权利要 求1中的所述上游引物SEQ ID NO. 3。9. 如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于；还包括核酸提取试剂、亚硫酸氨盐处理试 剂、测序纯化试剂盒、PCR扩增试剂和PCR产物纯化试剂中的至少一种。10. 如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：所述亚硫酸氨盐处理试剂为亚硫酸氨 钢；所述测序纯化试剂盒包括Big Dye⑥，5 X Big Dye测序缓冲液和去离子水；所述PCR扩 增试剂包括10 X PCR缓冲液、MgClz、dNTP、Taq酶和去离子水；所述PCR产物纯化试剂包括 单链特异性3' - 5'核酸外切酶和奸碱性磯酸酶。
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测DACT2基因启动子区的CpG岛甲基化的PCR引物、方法和试剂盒，所述用于检测DACT2基因启动子区的CpG岛甲基化的PCR引物的碱基序列为：上游引物：5’-TGGTTATAGATTTTAGTTTATTTTGG-3’，下游引物：5’-CAACCCCTACAACTCCTACAAC-3’。所述方法采用直接亚硫酸氢盐基因组测序法，所述试剂盒包含所述用于检测DACT2基因mRNA表达的PCR引物。通过本发明的PCR引物、方法和试剂盒，可检测出与结肠癌病人生存预后相关的DACT2基因甲基化，特异性好，准确度高。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105567797
【申请号】CN201410632529
【发明人】于君, 沈祖尧, 王世研
【申请人】香港中文大学深圳研究院
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2014年11月11日