用于检测SFRP2基因CpG岛甲基化的引物、方法和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了检测SFRP2基因CpG岛的CG甲基化的引物、方法和试剂盒，所述引物包括从样本核酸中扩增SFRP2基因CpG岛上与肠癌有关的三个CG位点的DNA片段的特异性引物和对获得的核酸片段进行焦磷酸测序的引物。通过本发明的引物、方法和试剂盒，采用焦磷酸测序技术，可检测出与大肠癌易感性相关的SFRP2基因甲基化的频率，从而筛查出早期大肠癌易感人群，特异性好，准确度高，而且能高通量检测样本。
【专利说明】用于检测SFRP2基因CpG岛甲基化的引物、方法和试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属生命科学和生物【技术领域】，特别涉及用于SFRP2基因甲基化位点检测的方法、引物和试剂盒，采用焦磷酸测序技术，能对SFRP2基因甲基化频率进行检测，特异性好，准确度高，而且可以进行高通量筛查甲基化样本。
【背景技术】[0002]大肠癌是世界上第三位最常见的肿瘤，全世界每年有近100万新发病例，大约49.2万人死于大肠癌。但是在过去十年中，大肠癌的发病率和死亡率呈下降趋势，这可能归功于有效的筛选和监控。结肠上皮细胞从异常增生经腺瘤阶段发展到癌变平均需10年时间，这为早期筛查及预防提供了充分时间。在早期阶段大肠癌是最容易治疗的，但由于大肠癌早期多无症状，且有隐匿性，大约只有40%的患者在肿瘤局限期被检测出来，待出现症状大多已是中晚期。如能发现癌前病变(如腺瘤)，通过及时的内镜下电凝切除可阻止癌变的发生，并且当大肠癌发现在早期临床阶段(如I和II期)，肿瘤尚局限在肠壁中，外科手术治愈率分别为90%和75%，而进展型大肠癌预后较差，有远处转移的患者五年生存率只有5%。通过检测和清除可能发展成为大肠癌的病变可以降低大肠癌的发生率及提高初级预防，并且早期发现大肠癌将增加存活率。因此，对高危人群的早期筛查是防治大肠癌的关键。通过改变大规模人群的生活方式来减少大肠癌的发生率是难以实现的，而筛查可使大肠癌死亡率适度下降，并通过检测和去除大肠腺瘤(较少侵袭性的手术早期处理或内镜切除)而有可能降低大肠癌的发生率。现在大多数早期检测技术如大便潜血试验、气钡灌肠及电子纤维肠镜分别存在精确性低、费用高、侵袭性大、病人依从性不强甚至发生肠出血穿孔严重并发症等缺点，因而这些方法还不适合于筛查。因此，不仅需要在科学的基础上制定合理的筛查程序和宣传健康的饮食结构，更需要我们通过寻求简单、安全、高效、精确性高、非侵袭性的大肠癌筛查工具，从而有效地防治大肠癌，降低大肠癌的死亡率，这将具有重大的科学意义和实用价值。
[0003]大肠癌和其他肿瘤一样，不仅是由渐进性遗传异常包括肿瘤抑制基因与癌基因以及染色体异常突变所驱动的一组疾病，也是由基因转录沉默所引起的表观遗传性疾病。表观遗传(epigenetics)是指不涉及基因组DNA序列改变而在细胞分裂过程中可以遗传给子代细胞的基因组修饰作用，DNA甲基化与组蛋白乙酰化修饰是表观遗传修饰的主要方式。癌基因和/或抑癌基因启动子区域CpG岛的DNA甲基化异常变化而沉默，随之基因表达丧失，成为近年来的研究热点。fct信号在动物发育中调节细胞生长、运动和分化并在成熟的器官中已日益牵涉组织的内环境稳定。异常的fct信号通路在90%的大肠癌中是个早期事件，它促成肿瘤细胞的成长、增殖和凋亡。Wnt拮抗物分泌型卷曲相关蛋白(secretedfrizzled-related protein, SFRPs)具有抗 Wnt/Frizzled 信号的功能，SFRPs 可能通过与fct蛋白相互作用阻止它们结合到FZ蛋白或者与FZ形成无功能的复合物来封闭Wnt信号。据报道，甚至在结肠癌细胞中当APC基因或FZ受体的下游β -catenin突变激活存在时，SFRPs能潜在地抑制整个经典型Wnt信号；SFRPs基因甲基化后的下调作用促成Wnt配体信号和细胞抵抗调亡，激活fct信号并持续整个大肠癌进展过程。因而SFRPs基因被称为是fct信号通路的“看门”基因，它们是起始结肠癌发生过程所必须的。人类有五种SFRP基因，其中SFRP2作为Wnt信号的调控基因，涉及肿瘤的发生和进展。SFRP2基因定位到染色体4q31.3，包含两个内含子和三个外显子，在SFRP2基因的第一个外显子周围有着高密度的CpG岛，这个CpG岛与肿瘤细胞DNA甲基化密切相关。据报道，在大肠癌的标本中，SFRP2基因的表达通过延伸于穿过这个基因外显子5’端CpG岛的超甲基化而受到抑制，SFRP2基因在正常结肠粘膜通常是非甲基化的并且能够表达，但在大肠癌中发生甲基化而沉默。大肠癌是有着高频的基因甲基化的肿瘤之一。基因的后生沉默在大肠癌发生的早期阶段中起着极为重要的作用。检测脱落到粪便中的存在于胃肠道肿瘤细胞代表"特定的"或遗传和/或表观遗传"谱"改变的分子标志物是一个种很有前景的非侵袭性大肠瘤变筛选方法。恶化前的腺瘤及大肠癌都可能用这种方式来检测，肿瘤抑制基因的CpG岛的超甲基化能导致肿瘤抑制基因的转录沉默，是大肠肿瘤发生的最常见的分子改变，许多基因的超甲基化与大肠癌的发生发展密切相关。由于甲基化改变往往发生在肿瘤变化的早期，易于在患者的粪便中检测到，并且DNA甲基化状态改变作为肿瘤标志物用于临床诊断，其特点和操作优于突变的检测。因此，粪便DNA甲基化检测已成为探讨早期筛查大肠癌新的研究热点，它与大肠癌的早期诊断、分期、治疗及预后密切相关，甚至可用于大批人群的筛选。在人类粪便DNA中检测超甲基化的SFRP2基因为检测和研究大肠癌可提供一种新的策略。
[0004]目前检测甲基化的方法主要有甲基化特异性PCR (MS-PCR)，亚硫酸氢盐测序PCR(BSP)，甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析(MS-HRM)，联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法(C0BRA)，荧光定量法(Methylight)等等。PCR方法虽然无需特殊仪器，经济实用，是目前简单便宜得一种检测方法，但灵敏度不够，而且预先需要知道待测片段的DNA序列，引物的设计非常重要。另外，亚硫酸氢盐处理也十分关键，若处理不完全则可能导致假阳性的出现。亚硫酸氢盐测序PCR(BSP)这种方法一度被认为是DNA甲基化分析的金标准。这种方法可靠，且精确度 高，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态，但因为涉及到测序，其结果准确但要求克隆时所挑克隆较多，操作繁琐，不易大批量操作。另外，甲基化程度的定量依赖于挑选克隆的数目，因此这种方法只能算得上是一种半定量的技术方法。甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析(MS-HRM)通过熔解曲线分析可以将单碱基序列的差异转变成熔解曲线的差异，因此DNA样本经过亚硫酸氢盐处理后，甲基化与未甲基化DNA会存在序列差异，这种差异可通过熔解曲线分析来发现。使用该方法进行甲基化分析仅需一对引物，相对简单，不过这种方法对仪器的要求颇高，需要带HRM模块的荧光定量PCR仪，并且在进行实时定量PCR过程中，需要使用饱和的荧光染料。利用MS-HRM技术进行甲基化检测只能对检测片段整体甲基化情况进行分析，并不能明确每个CpG位点的甲基化状态。因此这种技术适用于大量样本的检测，筛选出感兴趣的CPG位点，然后利用其他方法进行单个位点的精确检测及甲基化程度的精确定量。联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法(COBRA)这种方法是将亚硫酸氢盐处理与酶切相结合来进行甲基化检测。这种方法最大的优点就是相对简单，可进行快速定量，且需要的样本量少。然而，它的局限性也十分明显，只能获得特殊酶切位点的甲基化情况，且阴性结果并不能排除样品DNA中存在甲基化的可能。荧光定量法(Methylight)这种技术是在MSP技术上发展起来的，在MSP扩增过程中利用荧光染料进行定量。探针法的应用使得该技术具有更高的精确性。方法最大的优势在于其高敏感性和较高通量，且无需在PCR后电泳、杂交等操作，减少了污染和操作误差。但是探针订购费用较高，适用于少数位点大量样本筛选。
[0005]而本研究采用焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术,充分屏蔽了上述方法的缺陷，即可以高通量筛查，又可以同时检测多个甲基化位点。焦磷酸测序作为一种新的序列分析技术，能够快速地检测甲基化的频率，对样品中的甲基化位点进行定性及定量检测，为甲基化研究提供了新的途径。在序列延伸过程中，根据C和T的掺入量来定量确定单个位点的C-T比例。因此，不同位点的甲基化变异就能被准确检测，并给出精确的甲基化程度的数据。
【发明内容】
[0006]针对现有技术的缺陷，本发明除了利用特异性的引物对SFRP2基因CpG岛DNA片段进行常规PCR扩增外，还利用焦磷酸测序引物对PCR扩增片段进行反向测序，不仅能够检测具体甲基化改变情况，也能同时得到每个CG基因的甲基化频率，使检测结果更加具体化，从而能够更好地为肿瘤个体化治疗提供有益的指导。
[0007]在进行焦磷酸测序过程中，四种dNTP (dATP、dTTP、dCTP、dGTP)依序被加入测序反应体系中。在每一轮测序反应中，只加入其中一种。如被加入的dNTP与DNA模板配对，DNA聚合酶可以催化该dNTP与焦磷酸测序引物SFRP2-S的3’端形成共价键，dNTP的焦磷酸基团(PPi)就被释放出来。加入的dNTP和释放出来的PPi的摩尔数是相等的。接着，ATP硫酸化酶(ATP sulfurylase)催化过硫酸铵(ammonium persulfate, APS)和 PPi 形成 ATP,此ATP和PPi的摩尔数也是一致的。利用ATP作为能源，荧光素酶(Iuciferase)可将荧光素氧化为氧化荧光素(oxyluciferin)，进而发出与ATP量成正比的可见光信号。光信号由CCD摄像机检测,并由程序pyrogramTM转为波形讯号。每个波峰的高度(光信号)与反应中加入的核苷酸数目成正比。
[0008]基于这种焦磷酸测序技术，本发明提供用于检测SFRP2基因CpG岛甲基化的引物，所述引物包括从样本核酸中扩增SFRP2基因片段的特异性引物，其碱基序列为:
[0009]SFRP2-F:Biotin-TGGGTTAAGAGATTATGAAGGAGGTGTTG
[0010]SFRP2-R:CTCAACCCAACAAAAAATAAAAAAACAA
[0011]所述焦磷酸测序试剂包括对所获得的核酸扩增片段进行焦磷酸测序的引物，其碱基序列为:
[0012]SFRP2-S:AATATCCCAATAACACTACTTCAT。
[0013]进一步地，弓丨物SFRP2-F的5’端被生物素标记。
[0014]进一步地，所述扩增的反应条件为94°C 2分钟；98°C 10秒，60°C 20秒，68°C 20秒，35个循环；68°C 5分钟。
[0015]本发明还提供了用于检测SFRP2基因CpG岛甲基化的方法，包括:
[0016](I)提取样本中的DNA ；
[0017](2)将提纯的DNA进行亚硫酸氢盐处理；
[0018](3)以步骤⑵中的DNA作为模板，使用一对引物SFRP2-F和SFRP2-R扩增SFRP2基因片段，获得PCR扩增产物；
[0019](4)取步骤(3)中的PCR扩增产物进行琼脂糖电泳，检测是否扩增成功；
[0020](5)若步骤(4)中扩增成功，则利用焦磷酸测序引物SFRP2对步骤(3)中的PCR扩增产物进行测序；
[0021](6)根据步骤(5)中的焦磷酸测序结果，得到每个CG位点的甲基化频率，其特征在于，所述引物序列为:
[0022]SFRP2-F:Biotin-TGGGTTAAGAGATTATGAAGGAGGTGTTG
[0023]SFRP2-R:CTCAACCCAACAAAAAATAAAAAAACAA
[0024]SFRP2-S:AATATCCCAATAACACTACTTCAT。
[0025]进一步地，所述扩增的反应条件为94°C 2分钟；98°C 10秒，60°C 20秒，68°C 20秒，35个循环；68°C 5分钟。
[0026]本发明还提供用于检测SFRP2基因CpG岛甲基化的试剂盒，包括核酸提取试剂、亚硫酸氢盐处理试剂，PCR扩增体系、焦磷酸测序试剂，所述PCR扩增体系包括用于扩增基因SFRP2基因CpG岛片段的特异性引物，其碱基序列为:
[0027]SFRP2-F:Biotin-TGGGTTAAGAGATTATGAAGGAGGTGTTG
[0028]SFRP2-R:CTCAACCCAACAAAAAATAAAAAAACAA
[0029]所述焦磷酸测序试剂包括对所获得的核酸扩增片段进行焦磷酸测序的引物，其碱基序列为:
[0030]SFR P2-S:AATATCCCAATAACACTACTTCAT。
[0031 ] 进一步地，弓丨物SFRP2-F的5’端被生物素标记。
[0032]进一步地，所述核酸提取试剂包括粪便悬浮液。
[0033]进一步地，所述亚硫酸氢盐处理试剂包括IOmM氢醌溶液和3.6mol/LNaHS03。
[0034]进一步地，所述PCR扩增体系还包括2*Buffer、dNTP、KOD酶和纯水。
[0035]进一步地，单链纯化的具体步骤为:将得到的50ul PCR产物与3ul链亲和素包被的磁珠及47ul结合缓冲液混合，室温孵育10~15min，期间震荡2~3次，然后使用Vaccuumprep tool吸取磁珠,将带有磁珠的Vaccuumprep tool先后放进70% (V/V)乙醇、变性液、I Xffash Buffer中清洗IOs左右，再将Vaccuumprep tool放入含有49ul退火缓冲液及Iul测序引物SFRP2-S的96孔板中，释放磁珠，将该96孔板放置于80°C 2min,再冷却至室温，即得到测序反应所需的单链纯化产物。
[0036]进一步地，所述单链纯化试剂包括链亲和素包被的磁珠、70% (V/V)乙醇、变性液、I XWashBufTer、结合缓冲液、退火缓冲液；所述测序试剂包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、底物APS、荧光素及dNTP。
[0037]本发明将测序技术应用于扩增基因SFRP2基因CpG岛甲基化的检测，设计出将包含SFRP2甲基化位点的扩增引物和焦磷酸测序引物，进行PCR扩增，扩增片段长度为354bp，随后进行焦磷酸测序分析。
[0038]采用焦磷酸测序技术，通过本发明的特异性的扩增引物和焦磷酸测序引物，可检测出与大肠癌预防和治疗相关的SFRP2基因CpG岛甲基化的频率，特异性好，准确度高。可以用于临床作为肿瘤发生的早期预防、早期诊断的辅助性指标及筛选。
【专利附图】
【附图说明】
[0039]图1是亚硫酸盐处理DNA后CpG岛的序列图谱。
[0040]图2是SFRP2弓丨物扩增的354bp DNA片段电泳图。[0041]图3是本发明检测的甲基化位点。
【具体实施方式】
[0042]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法:比如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
[0043]实施例1:检测SFRP2基因CpG岛甲基化的引物和试剂盒
[0044]用于检测SFRP2基因CpG岛甲基化的引物，包括从样本核酸中扩增SFRP2基因片段的特异性引物和对获得的核酸片段进行焦磷酸测序的引物，其中，
[0045]从样本核酸中扩增基因SFRP2基因CpG岛DNA片段的特异性引物，其碱基序列为:
[0046]SFRP2-F:Biotin-TGGGTTAAGAGATTATGAAGGAGGTGTTG[0047]SFRP2-R:CTCAACCCAACAAAAAATAAAAAAACAA
[0048]其中SFRP2-F为5’端生物素标记引物
[0049]所获得的核酸扩增片段进行焦磷酸测序的引物，其碱基序列为:
[0050]SFRP2-S: AATATCCCAATAACACTACTTCAT (反向)。
[0051]采用焦磷酸测序技术，通过特异性的扩增引物SFRP2-F和SFRP2-R以及焦磷酸测序引物，可检测出与肿瘤疾病相关的CpG岛的CG甲基化情况。
[0052]用于检测SFRP2基因CpG岛甲基化的试剂盒，包括核酸提取试剂、亚硫酸氢盐处理试剂、PCR扩增体系、焦磷酸测序试剂、所述PCR扩增体系包括用于扩增基因SFRP2基因CpG岛DNA片段的特异性引物，其碱基序列为:
[0053]SFRP2-F:Biotin-TGGGTTAAGAGATTATGAAGGAGGTGTTG
[0054]SFRP2-R:CTCAACCCAACAAAAAATAAAAAAACAA
[0055]所述焦磷酸测序试剂包括对所获得的核酸扩增片段进行焦磷酸测序的引物，其碱基序列为:
[0056]SFRP2-S: AATATCCCAATAACACTACTTCAT (反向)
[0057]优选地，弓丨物SFRP2-F的5’端被生物素标记。
[0058]优选地，所述PCR扩增体系还包括2*Buffer、dNTP、KOD酶和纯水。
[0059]优选地，所述焦磷酸测序试剂还包括75%乙醇和DMS0。
[0060]优选地，所述核酸提取试剂包括粪便悬浮液。
[0061]优选地,所述亚硫酸氢盐处理试剂包括IOmM氢醌溶液(Hydryquinone)和3.6mol/LNaHSO30
[0062]实施例2 =DNA提取
[0063]DNA提取试剂:粪便悬浮液，粪便DNA抽提试剂盒(TIANGEN公司)。
[0064]操作步骤:称取粪便样本180_220mg至2ml离心管中，并将管子置于冰上并加入粪便悬浮液0.5ml，再向样本中加入1.4ml缓冲液GSL，间歇振荡I分钟至样本混匀，70°C孵育5分钟，涡旋15秒，13000rpm离心I分钟。转移上清液1.2ml至新的2ml离心管，加入一个抑制剂吸附片InhibitEX，振荡至吸附片彻底打开重悬，室温孵育I分钟，使吸附片能充分作用，然后13000rpm离心3分钟，将所得上清液转移至新的1.5ml离心管，13000rpm离心3分钟，转移所得上清液200 μ I至新的1.5ml离心管，加入15 μ I蛋白酶K，再加入200 μ I缓冲液GB涡旋15秒，70°C孵育10分钟，加入200 μ I无水乙醇，涡旋混匀。注意简短离心以收集管壁及管盖上的液滴，将混合溶液加入到一个吸附柱CR2中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CR2放入收集管中。向吸附柱CR2中加入500 μ I缓冲液⑶(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，OOOrpm(~13，400Xg)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CR2放入收集管中。向吸附柱CR2中加入700 μ I漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，OOOrpm(~13，400 Xg)离心30秒，倒掉废液，吸附柱CR2放入收集管中。向吸附柱CR2中加入500μ I漂洗液PW，12，000rpm(~13，400Xg)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CR2放回收集管中，12，OOOrpm(~13，400Xg)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CR2置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液，然后将吸附柱CR2转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μ I洗脱缓冲液，室温放置2-5分钟，12，OOOrpm(~13，400Xg)离心2分钟，将溶液收集到离心管中。就是我们需要的样本DNA。
[0065]实施例3 =DNA亚硫酸氢钠处理
[0066]DNA经亚硫酸钠处理后，CpG 二核苷酸对中未甲基化的胞嘧啶被转化为胸腺嘧啶(C —Τ)，而甲基化的5’甲基胞嘧啶则不受亚硫酸钠处理的影响，仍为5’甲基胞嘧啶。
[0067]操作步骤:将实施例2提取的基因组DNA与1.5mlEP管中使用双蒸水稀释至50ul加5.5ul新鲜配制的3MNa0H溶液，42°C水浴30min ;水浴期间配制以下溶液:10mM氢醌溶液(Hydryquinone):取 55mg 氢醌于 50ml 水中溶解；3.6moI/LNaHSO3:取 18.8g NaHSO3 加入40ml水中，并以3MNa0H溶液调节溶液PH至5.0，最终定容至50ml。加30ull0mM氢醌溶液和520ul3.611101/1似肥03至上述水浴后溶液中，EP管外包裹以铝箔纸避光，轻柔颠倒混匀溶液，管内加IOOul石蜡油，短暂离心使石蜡油盖住液面，防止水浴过程中水分的蒸发并限制氧化50°C避光水浴16h ; 水浴完后将移液器枪头伸入石蜡油层下，先轻轻加压使其中一小段石蜡油排出，然后小心吸取约580ulDNA溶液至洁净的1.5mlEP管中，使用PCR产物回收试剂盒回收DNA，所得到的DNA溶于50ul去离子水，加5.5ul新鲜配制的3MNa0H，室温放置15min,然后加33ullOM乙酸铵中和NaOH,使溶液PH=7,也加入4ull0mg/ml葡萄糖作为沉淀位置指示剂，加入270ul冰无水乙醇，至于_20°C，过夜沉淀后，4°C，12000rpm离心，30min,倒掉上清液，收集沉淀，加入500ul70%乙醇,洗剂沉淀,4? 12000rpm, 5min离心两次；倒掉上清，室温干燥至沉淀由不透明变为半透明或透明时，依DNA沉淀多少加入30-50ul双蒸水溶解沉淀。获得处理后的DNA，对于SFRP2基因CpG岛处理后DNA序列如图1所示。
[0068]实验证明，相比于常规的方法，利用本发明所述的DNA亚硫酸氢钠处理试剂和方法，可以获得更高的DNA回收率，高转化率，同时DNA降解率和片段化率均很低，从而提高了PCR扩增和后续分析技术的灵敏度。
[0069]实施例4 =PCR扩增
[0070]对实施例3中所提取的DNA利用PCR扩增体系进行常规PCR扩增，获得扩增DNA片段产物。
[0071]对用于检测SFRP2基因CpG岛甲基化的DNA片段进行扩增所用的PCR扩增体系为2*Bufferl0y 1，dNTP4 μ 1，KOD 酶 0.4 μ 1，上游引物 SFRP2-F1 μ 1，下游引物 SFRP2-R1 μ 1，纯水2.6 μ I,加I μ I模板DNA到19 μ I扩增体系中，总体积为20 μ I。
[0072]常规PCR扩增反应条件为94°C 2分钟；98°C 10秒，60°C 20秒，68°C 20秒，35个循环；68°C 5分钟。
[0073]实施例5:琼脂糖凝胶电泳
[0074]取实施例4中的扩增产物3 μ I进行琼脂糖凝胶电泳，检测是否扩增成功，对清晰较亮的目的条带进行后续焦磷酸测序反应。如图2所示的是依照实施例5所示方法对送检的10例粪便样本处理后得到的电泳图。
[0075]实施例6:焦磷酸测序获得甲基化频率
[0076]焦憐酸测序试剂:75%乙醇，DenaturationSolution,Annealing Buffer,BindingBuffer,I Xffash Buffer, Streptavidin Sepharase High Performance (bead), PyroMarkGold Q96Reagents (E\S\dNTP)，DMSO(二甲基亚砜)，焦磷酸测序引物SFRP-2，其中除焦磷酸测序引物之外，均采购自美国QIAGEN公司。
[0077]焦磷酸测序步骤:利用焦磷酸测序试剂，对经过实施例5中的电泳方法确认扩增成功的PCR扩增产物进行焦磷酸测序，具体测序步骤按照PyroMark Gold Q96(美国QIAGEN公司)操作说明书进行。其中利用焦磷酸测序引物SFRP2-S对PCR产物进行反向测序，根据测序结果，测序仪自动得出每个CG位点在样本中的甲基化百分数，即CG的甲基化频率。根据我们对大量正常标本的检测，得出正常个体也有可能会少量甲基化，从而得出甲基化小于10%，认为个体甲基化为阴性。
[0078]单链纯化试剂还可以选用包括链亲和素包被的磁珠、70% (V/V)乙醇、变性液、I Xffash Buffer、结合缓冲液、退火缓冲液；所述测序试剂包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、底物APS、荧光素及dNTP。单链纯化的方法还可以为:将得到的50ul PCR产物与3ul链亲和素包被的磁珠及47ul结合 缓冲液混合，室温孵育10~15min,期间震荡2~3次,然后使用Vaccuum prep tool吸取磁珠,将带有磁珠的Vaccuumprep tool先后放进70% (V/V)乙醇、变性液、I XWash Buffer中清洗IOs左右，再将Vaccuumprep tool放入含有49ul退火缓冲液及Iul测序引物SFRP2-S的96孔板中，释放磁珠，将该96孔板放置于80°C 2min，再冷却至室温，即得到测序反应所需的单链纯化产物。
[0079]实施例7:临床样本检测
[0080]临床标本检测
[0081]取送检的粪便样本共10例，其中3份样本来自于临床已确证为大肠癌的病人，其余样本为4例可能为大肠癌样本和3例正常样本，按实施例2所述方法提取粪便DNA、按实施例3进行DNA处理，将处理后的DNA进行PCR扩增，对扩增产物进行焦磷酸测序主要检测与大肠癌相关的三个CG位点，如图3:Y1，Y2，Y3，得到这三个CG位点的甲基化频率。
[0082]对每份样本而言，同时做阳性、阴性、空白对照实验各一次，一台焦磷酸测序仪可以同时检测96个样本,时间为60分钟。
[0083]实验结果与特检的QPCR方法的报告结果相比较，确定样本检测的准确率。结果如下表1:
[0084]表1:
[0085]
【权利要求】
1.用于检测SFRP2基因CpG岛甲基化的引物，其特征在于，所述引物其碱基序列为:
SFRP2-F: Biotin-TGGGTTAAGAGATTATGAAGGAGGTGTTG
SFRP2-R: CTCAACCCAACAAAAAATAAAAAAACAA 以及对所获得的核酸扩增产物进行焦磷酸测序的引物，其碱基序列为:
SFRP2-S: AATATCCCAATAACACTACTTCAT。
2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述扩增的反应条件为94°C2分钟；98°C10 秒，60°C 20 秒，68°C 20 秒，35 个循环；68°C 5 分钟。
3.一种用于检测SFRP2基因CpG岛甲基化的方法，包括: (1)提取样本中的DNA； (2)将提纯的DNA进行亚硫酸氢盐处理； (3)以步骤(2)中的DNA作为模板，使用一对引物SFRP2-F和SFRP2-R扩增SFRP2基因片段，获得PCR扩增产物； (4)取步骤(3)中的PCR扩增产物进行琼脂糖电泳，检测是否扩增成功； (5)若步骤⑷中扩增成功，则利用焦磷酸测序引物SFRP2对步骤(3)中的PCR扩增产物进行测序； (6)根据步骤(5)中的焦磷酸测序结果，得到每个CG位点的甲基化频率，其特征在于，所述引物序列为:
SFRP2-F: Biotin-TGGGTTAAGAGATTATGAAGGAGGTGTTG
SFRP2-R: CTCAACCCAACAAAAAATAAAAAAACAA
SFRP2-S: AATATCCCAATAACACTACTTCAT。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述扩增的反应条件为94°C2分钟；98°C10 秒，60°C 20 秒，68°C 20 秒，35 个循环；68°C 5 分钟。
5.用于检测SFRP2基因CpG岛甲 基化的试剂盒，包括核酸提取试剂、亚硫酸氢盐处理试剂、PCR扩增体系、PCR产物的单链纯化、焦磷酸测序试剂，其特征在于，所述PCR扩增体系包括用于扩增基因SFRP2 CpG岛DNA片段的特异性引物，其碱基序列为:
SFRP2-F: Biotin-TGGGTTAAGAGATTATGAAGGAGGTGTTG
SFRP2-R: CTCAACCCAACAAAAAATAAAAAAACAA 所述焦磷酸测序试剂包括对所获得的核酸扩增片段进行焦磷酸测序的引物，其碱基序列为:
SFRP2-S: AATATCCCAATAACACTACTTCAT。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸提取试剂包括粪便悬浮液。
7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述亚硫酸氢盐处理试剂包括IOmM氢醌溶液和 3.6mol/LNaHS03。
8.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增体系还包括2*Buffer、dNTP、K0D酶和纯水。
9.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，单链纯化的具体步骤为:将得到的50ulPCR产物与3ul链亲和素包被的磁珠及47ul结合缓冲液混合，室温孵育l(Tl5min，期间震荡2~3次,然后使用Vaccuum prep tool吸取磁珠,将带有磁珠的Vaccuumprep tool先后放进70% (V/V)乙醇、变性液、I XWash Buffer中清洗IOs左右，再将Vaccuumprep tool放入含有49ul退火缓冲液及Iul测序引物SFRP2-S的96孔板中，释放磁珠，将该96孔板放置于80°C 2min，再冷却至室温，即得到测序反应所需的单链纯化产物。
10.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述单链纯化试剂包括链亲和素包被的磁珠、70% (V/V)乙醇、变性液、I XWash Buffer、结合缓冲液、退火缓冲液；所述测序试剂包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、 荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、底物APS、荧光素及dNTP。
【文档编号】C12N15/11GK103882119SQ201410059868
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年2月21日 优先权日:2014年2月21日
【发明者】王淑一, 李文静, 周晓犊 申请人:郑州艾迪康医学检验所（普通合伙）