透明质酸酶的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及透明质酸酶的检测方法。
【背景技术】
[0002] 透明质酸酶，英文名称为Hyaluronidase，是一种能够降低体内透明质酸的活性， 从而提高组织中液体渗透能力的酶。在体内，当许多恶性肿瘤的产生往往伴随着透明质酸 酶的含量升高，例如，膀胱癌、直肠癌等。因此灵敏地检测人体内的透明质酸酶的含量对于 临床诊断以及初期肿瘤治疗有很重要的意义。
[0003] 传统的透明质酸酶的检测方法包括浑浊度测定、粘度测量法、比色法等。然而，没 有一种方法有高的选择性与灵敏度。浑浊度测定需要昂贵的抗体以及复杂的清洗步骤。粘 度测量法只适用于定性检测，而不能灵敏地对透明质酸酶进行定量检测。荧光方法因为其 高的灵敏度已经广泛地被应用于许多酶的检测。现在，越来越多的新的检测透明质酸酶的 探针也被设计出来，例如，荧光团标记的透明质酸与金纳米粒子。荧光团的荧光被金纳米粒 子猝灭，当透明质酸酶的加入，透明质酸链的剪断致使荧光团掉落，而使荧光回升。然而，这 种金纳米粒子探针本身在生物高盐环境中会沉淀。因此，高灵敏度的高选择性的以及低背 景的的荧光透明质酸酶探针的设计，对于检测透明质酸酶极为重要。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种透明质酸酶的检测方法，该方法对于透明质酸酶的检测 具有优异的灵敏度同时能够避免背景的干扰。
[0005] 为了实现上述目的，本发明提供了一种透明质酸酶的检测方法，包括：
[0006] 1)在保护气的存在下，将可溶性铁盐、乙二醇水溶液、聚乙烯吡咯烷酮和醋酸钠进 行接触反应，然后进行水热反应、磁性分离以制得Fe 304纳米球；
[0007] 2)将Fe3〇4纳米球分散于乙醇和水的混合体系中，接着加入氨水和正硅酸乙酯的乙 醇溶液进行包硅、磁性分离以制得Fe 3〇4@Si〇2纳米球(Fe3〇4纳米球的表面包裹有Si〇2);
[0008] 3)将Fe3〇4@Si02纳米球分散于乙醇中，接着加入氨水和3-氨丙基三乙氧基硅烷进 行氨基修饰、磁性分离以制得Fe 3〇4@Si〇2_H2纳米球(Fe3〇4@Si〇2纳米球的表面修饰有氨 基)；
[0009] 4)在保护气的存在下，将可溶性镉盐、氨基酸溶于水中，接着加入碱调节pH，然后 依次加入碲氢化钠、硫代乙酰胺进行回流反应、离心纯化以制得L-半胱氨酸修饰的CdTeO CdS核壳结构的量子点（L-半胱氨酸是一种带有氨基的氨基酸，即表不CdTeOCdS核壳结构的 量子点的表面修饰有氨基）；
[0010] 5)将HA(透明质酸)溶于roS缓冲溶液中，接着加入EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基 丙基)碳化二亚胺）、NHS(N-羟基丁二酰亚胺）和L-半胱氨酸修饰的CdTeOCdS核壳结构的量 子点进行接触反应，分离纯化以制得HA-QDs(L-半胱氨酸修饰的CdTeOCdS核壳结构的量子 点的表面枝接有HA);
[0011] 6)将Fe3〇4@Si〇2_H2纳米球加入至HA-QDs中以得到HA-QDs-Fe3〇4复合结构（表示HA 的两端分别枝接有L-半胱氨酸修饰的CdTeOCdS核壳结构的量子点以及Fe3〇4@Si02_H 2纳米 球），接着向多组复合结构中分别加入同体积、不同浓度的HAase (透明质酸酶)溶液进行荧 光反应，然后检测荧光强度并绘制工作曲线；
[0012] 7)将纯化后的人体血清溶液加入至复合结构中进行荧光反应，然后检测荧光强度 并根据工作曲线计算所述人体血清中HAase溶液的浓度。
[0013]通过上述技术方案，如图11所示，本发明通过在偶联剂(EDC和NHS)的存在下，将HA 的羧基进行活化，从而使得活化后的羧基与氨基进行结合形成HA-QDs，接着HA-QDs与Fe3〇4@ Si〇2_H2纳米球通过HA进行连接(HA相当于桥梁的作用)HA-QDs-Fe3〇4复合体系，该复合体 系由于磁性Fe 3〇4的存在，进而能够通过磁铁进行分离和富集。同时，本发明利用癌症标志物 Hyaluronidase(HAase)(透明质酸酶）可对HA(透明质酸）进行剪切，进而使得HA-QDs_Fe3〇4 复合结构被切割成L-半胱氨酸修饰的CdTeOCdS核壳结构的量子点和Fe3〇4@Si02_H 2,然后 利用Fe3〇4的磁性将Fe3〇4@Si〇2@NH2与未切割的HA-QDs_Fe3〇4分离出去。最后，检测L-半胱氨 酸修饰的CdTeOCdS核壳结构的量子点的荧光强度，利用荧光仪器进行检测。检测的L-半胱 氨酸修饰的CdTeOCdS核壳结构的量子点的荧光强度与检测的癌症标志物透明质酸酶的浓 度呈一定比例关系，所以可通过检测量子点的荧光强度来定量检测癌症标志物透明质酸 酶。但是因为未剪切下来的HA-QDs-Fe 3〇4复合结构以及Fe3〇4@Si02_H2都存在于此体系中， 所以会对QDs的检测有背景干扰。因为此复合结构具有磁性，从而我们利用Fe 3〇4的磁性将体 系中的干扰粒子分离出检测体系，因此无背景干扰，所以其检测的灵敏度也很高。
[0014] 本发明的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
【附图说明】
[0015] 附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具 体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0016] 图1是检测例1中的荧光光谱图；
[0017] 图2是依据检测例2中小浓度的的荧光光谱绘制出的工作线性；
[0018] 图3是检测例3中Fe3〇4的透射表征图；
[0019] 图4是检测例4中Fe3〇4@Si02的透射表征图；
[0020] 图5是检测例5中HA-QDs-Fe3〇4的透射表征图；
[0021]图6是检测例6中HA-QDs的透射表征图；
[0022] 图7是检测例7中HA-QDs-Fe3〇4的红外光谱图；
[0023] 图8是检测例8中Fe3〇4、Fe3〇4@Si〇2以及Fe3〇4@Si〇2_H2的X射线衍射谱图；
[0024] 图9是检测例9中Fe3〇4、Fe3〇4@Si〇2以及Fe3〇4@Si〇2_H2的磁滞表征谱图；
[0025] 图10是检测例9中Fe3〇4的X射线光电子能谱；
[0026]图11是透明质酸酶的检测原理图；
[0027]图12是应用例1中的样品图；
[0028]图13是应用例1中的工作曲线图；
[0029]图14是应用例3中的结果统计图。
【具体实施方式】
[0030]以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体 实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0031 ]本发明提供了 一种透明质酸酶的检测方法，包括：
[0032] 1)在保护气的存在下，将可溶性铁盐、乙二醇水溶液、聚乙烯吡咯烷酮和醋酸钠进 行接触反应，然后进行水热反应、磁性分离以制得Fe304纳米球；
[0033] 2)将Fe3〇4纳米球分散于乙醇和水的混合体系中，接着加入氨水和正硅酸乙酯的乙 醇溶液进行包硅、磁性分离以制得Fe3〇4@Si02纳米球；
[0034] 3)将Fe3〇4@Si02纳米球分散于乙醇中，接着加入氨水和3-氨丙基三乙氧基硅烷进 行氨基修饰、磁性分离以制得Fe3〇4@Si02@NH2纳米球；
[0035] 4)在保护气的存在下，将可溶性镉盐、氨基酸溶于水中，接着加入碱调节pH，然后 依次加入碲氢化钠、硫代乙酰胺进行回流反应、离心纯化以制得L-半胱氨酸修饰的CdTeO CdS核壳结构的量子点；
[0036] 5)将HA(透明质酸)溶于roS缓冲溶液中，接着加入EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基 丙基)碳化二亚胺）、NHS(N-羟基丁二酰亚胺)和CdTeOCdS核壳结构的量子点进行接触反应， 分离纯化以制得HA-QDs;
[0037] 6)将Fe3〇4@Si02_H2纳米球加入至HA-QDs中以得到HA-QDs-Fe 3〇4复合结构，接着向 多组复合结构中分别加入同体积、不同浓度的HAase(透明质酸酶)溶液进行荧光反应，然后 检测荧光强度并绘制工作曲线；
[0038] 7)将纯化后的人体血清溶液加入至复合结构中进行荧光反应，然后检测荧光强度 并根据工作曲线计算人体血清中HAase溶液的浓度。
[0039] 在本发明的步骤1)中，各物料的用量可以在宽的范围内选择，但是为了提高Fe3〇4 纳米球的产率，优选地，在步骤1)中，相对于〇 . 5406g的可溶性铁盐，乙二醇的用量为15-25ml，聚乙烯吡咯烷酮的用量为1.5-2.5g，醋酸钠的用量为l-2g;接触反应至少满足以下条 件:反应温度为110-130 °C，反应时间为0.5-2.5h;水热反应至少满足以下条件:反应温度为 180-220 °C，反应时间为10_14h。
[0040] 在本发明的步骤1)中，聚乙烯吡咯烷酮以及保护气的具体种类可以在宽的范围内 选择，但是为了提高Fe30 4纳米球的产率，优选地，在步骤1)中，聚乙烯吡咯烷酮的重均分子 量为30000-50000,保护气为氮气、氢气和氩气中的一种或多种。
[0041] 在本发明的步骤1)中，原料的添加顺序可以在宽的范围内选择，但是为了提高 Fe3〇4纳米球的产率，优选地，在步骤1)中，原料的添加顺序为:先将可溶性铁盐溶于乙二醇 水溶液中，接着加入聚乙烯吡咯烷酮于110_130°C下反应0.5-1.5h，然后加入醋酸钠，停止 加热并继续搅拌20-40min，最后将体系于180-220°C下进行水热反应10_14h。
[0042