GGGT-3'
[0078] 测序引物 4 :5'-GTGGCTTGGGCTACTACAG-3'
[0079] MENlexon4 测序引物 5 :5'-GGGCCATCATGAGACATAATG-3'
[0080] 测序引物 6 :5'-CTGCCCCATTGGCTCAG-3'
[0081] MENlexon5/6 测序引物 7 :5'-GATAGGCTAAGGACCCGTTCT-3'
[0082] 测序引物 8 :5'-AGACTGGATGGGCGATACC-3'
[0083] MENlexon7 测序引物 9 :5'-GGCTGCCTCCCTGAGGATC-3，
[0084] 测序引物 10 :5'-CTGGACGAGGGTGGTTGG-3'
[0085] MENlexon8 测序引物 11 :5'-GTGAGACCCCTTCAGACCCTAC-3'
[0086] 测序引物 12 :5'-TGGGAGGCTGGACACAGG-3'
[0087] MENlexon9 测序引物 13 :5'-GGGTGAGTAAGAGACTGATCTGTGC-3，
[0088] 测序引物 14 :5'-TGTAGTGCCCAGACCTCTGTG-3'
[0089] MENlexon10 测序引物 15 :5'-TCTCACCTTGCTCTCCCCAC-3'
[0090] 测序引物 16 :5'-AGAACATGGGCTCAGAGTTGG-3'
[0091] 1.DNA提取（采用天根生物血液基因组DNA提取试剂盒，货号：DP-318-02)
[0092] 1. 1实验前试剂材料准备与检查工作如下：
[0093] (1)使用前先在缓冲液⑶和漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标 签；（2)异丙醇（如无，可用无水乙醇代替）和75%乙醇；（3)高压灭菌有效期内的1.5ml Eppendorf管和各类移液枪头。
[0094] 1. 2处理血液材料：取患者EDTA抗凝血600ul，用细胞裂解液CL处理，具体步骤如 下：在样品中加入1~2倍体积的细胞裂解液CL，颠倒混匀，10,OOOrpm(~11，500Xg)离 心lmin，吸去上清，留下细胞核沉淀（如果裂解不彻底，可重复以上步骤一次），向离心收集 到的细胞核沉淀中加200y1缓冲液GS，振荡至彻底混匀。
[0095] 1. 3 加入 20ulProteinaseK溶液，混勾。
[0096] 1. 4加200 y 1缓冲液GB，充分颠倒混匀，56°C放置lOmin，其间颠倒混匀数次，溶液 应变清亮（如溶液未彻底变清亮，请延长裂解时间至溶液清亮为止）。
[0097] 1. 5加200ul无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀。
[0098] 1. 6将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱CB3放入收 集管中），12, OOOrpm(~13, 400Xg)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入 收集管中。
[0099] 1. 7向吸附柱CB3中加入500 y 1缓冲液⑶（使用前请先检查是否已加入无水乙 醇），12, OOOrpm(~13, 400Xg)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集 管中。
[0100] 1. 8向吸附柱CB3中加入600 y 1漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙 醇），12, OOOrpm(~13, 400Xg)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集 管中。
[0101] 1. 9重复操作步骤1. 8。
[0102] 1. 10. 12, OOOrpm(~13, 400Xg)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放 置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
[0103] 1. 11将吸附柱CB3转入1. 5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50-200 y 1 洗脱缓冲液TB，室温放置2-5min，12, OOOrpm (~13, 400 X g)离心2min，将溶液收集到离心 管中。
[0104] 1. 12溶解后用Nano-Space紫外分光光度计进行核酸浓度测定，核酸浓度大于 50ng/ul视为合格。
[0105] 1 ? 13保存核酸标本至4°C冰箱；
[0106] 2?聚合酶链式反应
[0107] 2. 1在试剂准备区配制50ul PCR扩增体系（模版添加除外），各组分及添加量如 下表：
[0108] 10XPCR 缓冲液 5.0ul
[0109] dNTP 3. Oul
[0110] 上游引物〇.5ul
[0111] 下游引物0. 5ul
[0112] rTaq 0. 5ul
[0113] 水 38.5ul
[0114] 2. 2在标本制备区对盛有gDNA模版短暂离心后添加2. Oul至扩增体系中，在PCR 管壁标记唯一性标识，冠盖上标记检测项目代号。PCR管震荡混匀，桌面离心机短暂离心；
[0115] 2. 3在扩增区进行PCR扩增反应，按照下面的循环参数设置扩增仪（ABI7900);
[0116] MENlexon2
[0117] 95°C 5min预变性；然后依次在95°C 30s，58°C 30s，72°C 30s，进行35个循环；再 72°C保持10min，最终保持在12°C，得扩增产物。
[0118] MENlexon3
[0119] 95°C 5min预变性；然后依次在95°C 30s，56°C 30s，72°C 30s，进行35个循环；再 72°C保持10min，最终保持在12°C，得扩增产物。
[0120] MENlexon4
[0121] 95°C 5min预变性；然后依次在95°C 30s，58°C 30s，72°C 30s，进行35个循环；再 72°C保持lOmin，最终保持在12°C，得扩增产物。
[0122] MENlexon5/6
[0123] 95°C 5min预变性；然后依次在95°C 30s，60°C 30s，72°C 30s，进行35个循环；再 72°C保持lOmin，最终保持在12°C，得扩增产物。
[0124] MENlexon7
[0125] 95°C 5min预变性；然后依次在95°C 30s，60°C 30s，72°C 30s，进行35个循环；再 72°C保持10min，最终保持在12°C，得扩增产物。
[0126] MENlexon8
[0127] 95°C 5min预变性；然后依次在95°C 30s，58°C 30s，72°C 30s，进行35个循环；再 72°C保持10min，最终保持在12°C，得扩增产物。
[0128] MENlexon9
[0129] 95°C 5min预变性；然后依次在95°C 30s，60°C 30s，72°C 30s，进行35个循环；再 72°C保持10min，最终保持在12°C，得扩增产物。
[0130] MENlexon10
[0131] 95°C 5min预变性；然后依次在95°C 30s，58°C 30s，72°C 30s，进行35个循环；再 72°C保持10min，最终保持在12°C，得扩增产物。
[0132] 2. 4设置仪器后，在操作界面点击"start"开始仪器运行。
[0133] 3.Sanger测序
[0134] PCR结束后，产物直接进行测序，测序过程委托北京六合华大基因科技股份有限公 司完成，测序反应为正方双向测序，提供测序引物如上所述。
[0135] 4.测序结果分析
[0136] 应用DNAStat5. 0(LasergeneInc.)软件包Seqman软件进行分析。将测序得到序 列与NCBI检索到的标准序列进行比对，找到突变序列，发现突变位点。对样本检测MEN1基 因的编码序列exon2、exon3、exon4、exon5、exon6、exon7、exon8、exon8、exon10， 结果如图1、图2、图3、图4、图5、图6、图7、图8所示，如发现影响氨基酸编码的突变位点， 即可判断为存在MEN1多发性内分泌瘤患病风险。如实施例lexon9c. 1288G>T位点发生 点突变，使得突变编码谷氨酸的密码子变成终止密码子（Glu430Stop)，终止密码子过早出 现，造成多肽链合成的提前终止，肽链长度缩短，影响MEN1基因编码蛋白活性与功能，MEN1 多发性内分泌瘤患病风险人群。
[0137] 综上，本发明所选取的靶序列，以及应用本发明的试剂盒能够实现快速、简洁、准 确、高效、实用、经济的检测MENlexon2、MENlexon3、MENlexon4、MENlexon5、MENlexon 6、MENlexon7、MENlexon8、MENlexon9、MENlexon10基因多态性，能够满足临床对多发性 内分泌瘤I筛查。
【主权项】
1. 一种筛查多发性内分泌瘤I型即MEN-I的基因诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒 包括如下引物： 扩增引物，包括： MENl exon2上游引物及下游引物，其序列如SEQ ID NO. 1和9所示； MENl exon3上游引物及下游引物，其序列如SEQ ID NO. 2和10所示； MENl exon4上游引物及下游引物，其序列如SEQ ID NO. 3和11所示； MENl exon5/6上游引物及下游引物，其序列如SEQ ID NO. 4和12所示； MENl exon7上游引物及下游引物，其序列如SEQ ID NO. 5和13所示； MENl exon8上游引物及下游引物，其序列如SEQ ID NO. 6和14所示； MENl exon9上游引物及下游引物，其序列如SEQ ID NO. 7和15所示； MENl exonlO上游引物及下游引物，其序列如SEQ ID NO. 8和16所示；以及 测序引物，包括： Menl exon2测序引物，其序列如SEQ ID NO. 17和18所示； Menl exon3测序引物，其序列如SEQ ID NO. 19和20所示； Menl exon4测序引物，其序列如SEQ ID NO. 21和22所示； Menl exon5/6测序引物，其序列如SEQ ID NO. 23和24所示； Menl exon7测序引物，其序列如SEQ ID NO. 25和26所示； Menl exon8测序引物，其序列如SEQ ID NO. 27和28所示； Menl exon9测序引物，其序列如SEQ ID NO. 29和30所示； Menl exonlO测序引物，其序列如SEQ ID NO. 31和32所示。2. -种检测多发性内分泌瘤I型即MEN-I基因多态性的方法，其特征在于，包括： 提供权利要求1所述的筛查多发性内分泌瘤I型即MEN-I的基因诊断试剂盒； 以从个体血液或组织提取的DNA为模版，通过基因诊断试剂盒针对Menl基因外显子2、 3、4、5、6、7、8、9、10序列进行卩〇?反应； 将得到的PCR产物进行测序分析，将所得标本序列与正常人基因序列进行比对，确认 是否有突变； 根据以上结果判断待测个体是否为MENl基因突变导致患多发性内分泌瘤风险。3. 根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：采用50ul PCR扩增体系，包括： 10XPCR缓冲液5ul，dNTP 3. Oul，上游引物0? 5ul，下游引物0? 5ul，rTaq 0? 5ul，水38. 5ul， 模版2. Oul ;按照下面的的循环参数设置基因扩增仪：95 °C 5min预变性；然后依次在 95°C 30s，56-60°C 30s，72°C 30s，进行 35 个循环；再 72°C保持 10min，最终保持在 12°C，得 扩增产物。
【专利摘要】本发明涉及一种筛查多发性内分泌瘤的基因诊断试剂盒，特别是一种利用MEN1基因外显子突变检测的试剂盒。本发明所述的基因诊断试剂盒包括：扩增引物，包括：MEN1exon2上游引物及下游引物；MEN1exon3上游引物及下游引物；MEN1exon4上游引物及下游引物；MEN1exon5/6上游引物及下游引物；MEN1exon7上游引物及下游引物；MEN1exon8上游引物及下游引物；MEN1exon9上游引物及下游引物；MEN1exon10上游引物及下游引物；以及测序引物，包括：Men1exon2测序引物；Men1exon3测序引物；Men1exon4测序引物；Men1exon5/6测序引物；Men1exon7测序引物；Men1exon8测序引物；Men1exon9测序引物；Men1exon10测序引物。本发明所述的试剂盒能实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测多发性内分泌瘤I型早期筛查及临床诊断。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105063227
【申请号】CN201510575020
【发明人】徐克成, 牛立志, 陈继冰, 李家亮, 穆峰, 李海波, 朴相浩, 何丽华
【申请人】广州复大医疗股份有限公司复大肿瘤医院
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年9月10日