一种花生高油酸性状基因选择方法
【专利摘要】本发明公开了一种花生高油酸性状基因选择方法，包括以下步骤：提取不同花生品种（系）的叶片基因组，采用特异性引物从基因组中扩增AhFAD2A和AhFAD2B基因。将特异扩增条带切胶回收后，进行序列测定，得到基因的序列。对所获得的序列进行翻译，比对分析，查找点突变或插入位点，据此来判断品种（系）油酸含量和油酸/亚油酸（O/L）比值的高低。本发明方法操作简单，能够对丰富多样的花生种质进行分析，可以在苗期确定花生单株的油酸含量，结合单株综合农艺性状选择，能够缩短育种进程，提高高油酸育种的成效。
【专利说明】一种花生高油酸性状基因选择方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及花生高油酸性状基因选择方法，属于花生生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]我国是世界上最大的花生生产、消费和出口国。花生在我国国民经济中具有重要的地位和作用。油酸是花生油脂中的主要脂肪酸，占花生脂肪酸总量的39%-49%之间，在人体脂类代谢中能降低有害胆固醇，但保持有益胆固醇的水平，从而减缓动脉粥样硬化，有效预防冠心病等心脑血管疾病的发生。另外，油酸含量高，抗氧化能力强，产品不易氧化酸败，货架寿命较长，耐储能力也强。因此，世界主要油料作物(大豆、油菜、花生)的育种者都把培育高油酸新品种作为主要的育种目标。
[0003]在花生育种过程中，油酸等内在品质只有通过种子化学测试才能确定其具体含量，因此在分离世代难以对油酸等品质性状进行选择。近红外种子无损伤选择技术的应用解决了分离世代对油酸等内在品质性状选择的问题，但该技术仅能对收获后种子的油酸含量进行预测，有些田间综合性状较差的超高油酸含量的材料容易丢失。发明与油酸含量相关的基因标记，在苗期确定单株的油酸含量，同时结合综合农艺性状选择，可以大大提闻闻油酸育种的成效。
遗传研究表明，花生高油酸性状由两对隐性基因(o77和o7J?)共同控制。研究表明A 12脂肪酸脱氢酶基因(/?/--)是控制花生油酸性状的关键基因。FAD2由位于不同基因组上的两个非等位基因FW2A和/?/--共同编码，oil是突变了的/?/--基因，是突变了的/?/--基因。这两个基因的 突变引起酶结构、酶活性或表达调控的变化，共同导致高油酸性状的产生。
[0004]为了深入了解控制花生高油酸性状的遗传基础，提高花生育种的选育效率，育种者针对一些高0/L比值的花生品种开发了 CAPS、Real-time PCR、AS-PCR(Allele-Specific PCR)等标记方法，但这些方法仅限于特定类型的突变体，无法对丰富多样的花生种质进行分析。本研究通过对不同花生品种(系)的4?/?/--基因进行测序和比对分析，查找点突变或插入位点，寻找与高油酸性状关联的基因位点，为花生高油酸育种提供重要的理论依据。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供方便快捷的花生高油酸性状基因选择方法，在苗期确定单株的油酸含量，同时结合综合农艺性状选择，来提高高油酸育种的成效。
[0006]为达到上述目的，本发明采用以下步骤:
提取不同花生品种(系)的叶片基因组，采用特异性引物从基因组中扩增和基因。将特异扩增条带切胶回收后，进行序列测定，得到基因的序列。对所获得的序列进行翻译，比对分析，查找点突变或插入位点，据此来判断品种(系)油酸含量和油酸/亚油酸(0/L)比值的高低。[0007]具体来说，所述的方法如下:
(1)采用粗提法提取不同花生品种(系)的叶片基因组；
(2)采用特异性引物从基因组中扩增mAhFAD2B基因。将特异扩增条带切胶回收后连接T载体，转化感受态细胞后，筛选阳性克隆送往测序公司进行序列测定，即得到了基因的序列；
(3)对所获得的序列 进行翻译，比对分析，查找点突变或插入位点，据此来判断品种(系)油酸含量和油酸/亚油酸(0/L)比值的高低。
优选地，步骤(2 )所述的特异性引物为FAD2A-F/FAD2A-R和FAD2B-F/FAD2B-R，分别扩增 AhFAD2A 和 AhFAD2B 基因。FAD2A-F 为 5’ -GATTACTGATTAITGACTT-3’，FAD2A-R为 5’-CTCTGACTATGCATCAG-3’ ;FAD2B_F 为 5’-CAGAACCATTAGCTTTG-3’ ， FAD2B-R 为5’-CTCTGACTATGCATCAG-3’ 。
[0008]优选地，步骤(2)所述的基因扩增是通过PCR方法，扩增所用的聚合酶为LATaq?DNA polymerase (TaKaRa)，在 25 ii L 体系中加入以下成分:2.5 uL IOX PCR buffer(含 MgCl2) ；2.5 u L IOmM dNTPs ；1 u L cDNA 模板；0.5 y L LA polymerase 和 17.5 y LddH20。PCR 反应条件为:(a)94 °C，5min ；(b) 94 °C，30s ；58 °C，lmin40s ；72 °C，90s ；共30cycles ； (c) 72°C, IOmin0 PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳分离后用胶回收试剂盒(Axygen)进行纯化,纯化产物连接pMD18_T Easy vector (Takara),转化T0P10感受态细胞后，筛选阳性克隆送往测序公司(Sangon, Shanghai)测序。
[0009]优选地，步骤(3)中测序得到的普通花生品种中4?/?/--基因长度为1228bp，AhFAD2B基因为1220bp，开放阅读框均为1140bp，编码379个氨基酸。通过比对不同品种(系)中获得的AhFAD2A和AhFAD2B基因的核苷酸序列和氨基酸序列，查找点突变或插入位点,据此来判断品种(系)油酸含量和油酸/亚油酸(0/L)比值的高低。
[0010]我们克隆了不同油酸含量的3152份花生的AhFAD2A和AhFAD2B基因，结合油酸含量和油酸/亚油酸(0/L)比值分析表明AhFAD2A基因存在G448A点突变和4?/?/--基因存在442A点插入的花生是超高油酸(70%以上)材料或品种，0/L值超过7.0。只存在点突变或点插入的花生是高油酸(49%以上)材料或品种，0/L值在1.5-7.0之间。因此，4?/?/--和AhFAD2B是高油酸性状的标记基因。
【具体实施方式】
[0011]实施例1
对3个花生品种(系)花育30、鲁花12和E 11，取花生新生叶I片(约IOmg),置于1.5mLEP管中，加入液氮，用塑料小研磨棒将叶片迅速研磨成粉末；加入400 u L提取液(包含浓度200mmol/L 的 Tris-HCl 溶液(PH8.0)，浓度 250mmol/L 的氯化钠溶液，浓度 25mmol/L 的 EDTA溶液，浓度0.5%的SDS溶液，经高压蒸汽灭菌后使用。使用前加入浓度为1%的P -巯基乙醇溶液。)，震荡混匀，静置IOmin ;加入200 ii L 5mol/L的醋酸钾溶液(pH5.0或不调pH)，震荡混匀，静置15min ;12000r/min转速离心2min，取上清液400 y L移入另一个1.5mL EP管中，加入等体积异丙醇；轻轻混匀后于室温下静置2分钟，12000r/min转速离心5min，弃上清液，沉淀再用75%酒精洗漆1-2次，12000r/min转速离心5min ;在室温下开盖放置15min,加入10 y L蒸馏水，溶解沉淀，即得到花生叶片基因组粗提液。提取的基因组产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，能看到明显的基因组条带，表明基因组提取成功。采用基因特异的引物 FAD2A-F/FAD2-R 和 FAD2B-F/FAD2-R 通过 PCR 方法分别扩增 AhFAD2A 和 AhFAD2B 基因。FAD2A-F 为 5’ -GATTACTGATTATTGACTT-3’，FAD2B-F 为 5’ -CAGAACCATTAGCTTTG-3’，FAD2_R 为5’-CTCTGACTATGCATCAG-3’。扩增所用的聚合酶为 LA Taq? DNA polymerase (TaKaRa)，在25 ii L 体系中加入以下成分:2.5 u L IOX PCR buffer (含 MgCl2);2.5 u L IOmM dNTPs ；I u L cDNA 模板；0.5 u L LA polymerase 和 17.5 u L ddH20。PCR 反应条件为:(a)94°C，5min ；(b)94°C,30s ；58°C, lmin40s ；72°C,90s ;共 30cycles ； (c) 72°C, IOmin0 PCR 产物经过1%琼脂糖凝胶电泳分离后用胶回收试剂盒(Axygen)进行纯化，纯化产物连接pMD18_TEasy vector (Takara),转化TOPlO感受态细胞后，筛选阳性克隆送往测序公司(Sangon,Shanghai)测序。对测序结果的核苷酸序列和氨基酸序列进行比对，发现这3个品种(系)中，必/?/--和必/?/--皆不存在基因突变。必/?/--基因长度为1228bp，AW^iM9基因长度为1220bp，开放阅读框均为1140bp，编码379个氨基酸。这3个品种(系)花育30、鲁花
12、E 11的籽仁油酸含量分别为45.5%, 44.1%, 43.5%，0/L比值分别为1.40，1.35，1.30。
实施例2
对3个花生品种花育19，花育23和鲁花14，取花生新生叶I片(约10mg)，置于1.5mLEP管中，加入液氮，用塑料小研磨棒将叶片迅速研磨成粉末；加入400 u L提取液(包含浓度200mmol/L 的 Tris-HCl 溶液(PH8.0)，浓度 250mmol/L 的氯化钠溶液，浓度 25mmol/L 的 EDTA溶液，浓度0.5%的SDS溶液，经高压蒸汽灭菌后使用。使用前加入浓度为1%的P -巯基乙醇溶液。)，震荡混匀，静置IOmin ;加入200ii L 5mol/L的醋酸钾溶液(pH5.0或不调pH)，震荡混匀，静置15!^11;1200017^11转速离心2111111，取上清液4001^移入另一个1.5 mL EP管中，加入等体积异丙醇；轻轻混匀后于室温下静置2分钟，12000r/min转速离心5min，弃上清液，沉淀再用75%酒精洗漆1-2次，12000r/min转速离心5min ;在室温下开盖放置15min,加入10 y L蒸馏水，溶解沉淀，即得到花生叶片基因组粗提液。提取的基因组产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，能看到明显的基因组条带，表明基因组提取成功。采用基因特异的引物 FAD2A-F/FAD2-R 和 FAD2B-F/FAD2-R 通过 PCR 方法分别扩增 AhFAD2A 和 AhFAD2B 基因。FAD2A-F 为 5’ -GATTACTGATTATTGACTT-3’，FAD2B_F 为 5’ -CAGAACCATTAGCTTTG-3’，FAD2_R 为5’-CTCTGACTATGCATCAG-3’。扩增所用的聚合酶为 LA Taq? DNA polymerase (TaKaRa)，在25 ii L 体系中加入以下成分:2.5 u L 10X PCR buffer (含 MgCl2);2.5 u L IOmM dNTPs ；I u L cDNA 模板；0.5 u L LA polymerase 和 17.5 u L ddH20。PCR 反应条件为:(a)94°C，5min ；(b)94°C,30s ；58°C, lmin40s ；72°C,90s ;共 30cycles ； (c) 72°C, IOmin0 PCR 产物经过1%琼脂糖凝胶电泳分离后用胶回收试剂盒(Axygen)进行纯化，纯化产物连接pMD18_TEasy vector (Takara),转化T0P10感受态细胞后，筛选阳性克隆送往测序公司(Sangon,Shanghai)测序。对测序结果的核苷酸序列和氨基酸序列进行比对，发现这3个品种中，4?/?/--没有发生基因突变，基因长度为1220bp，开放阅读框为1140bp，编码379个氨基酸。而4?/?/--突变成为它的等位基因o77，基因开放读码框的第448bp处的碱基G突变为A (G448A)，导致相应氨基酸由天冬氨酸(D)突变为天冬酰胺(N，D150N)，基因长度仍为1228bp，开放阅读框为1140bp，编码379个氨基酸。这3个品种花育19，花育23和鲁花14的籽仁油酸含量分别为54.02%，49.3%, 51.0%，0/L比值分别为1.97，1.54，1.57。
[0012] 实施例3对3个花生品种(系)E18、花育32号和E16，取花生新生叶I片(约10mg)，置于1.5mLEP管中，加入液氮，用塑料小研磨棒将叶片迅速研磨成粉末；加入400 u L提取液(包含浓度200mmol/L 的 Tris-HCl 溶液(PH8.0)，浓度 250mmol/L 的氯化钠溶液，浓度 25mmol/L 的 EDTA溶液，浓度0.5%的SDS溶液，经高压蒸汽灭菌后使用。使用前加入浓度为1%的P -巯基乙醇溶液。)，震荡混匀，静置IOmin ;加入200 u L 5mol/L的醋酸钾溶液(pH5.0或不调pH)，震荡混匀，静置15!^11;1200017^11转速离心2111111，取上清液4001^移入另一个1.5 mL EP管中，加入等体积异丙醇；轻轻混匀后于室温下静置2分钟，12000r/min转速离心5min，弃上清液，沉淀再用75%酒精洗漆1-2次，12000r/min转速离心5min ;在室温下开盖放置15min,加入10 UL蒸馏水，溶解沉淀，即得到花生叶片基因组粗提液。提取的基因组产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，能看到明显的基因组条带，表明基因组提取成功。采用基因特异的引物 FAD2A-F/FAD2-R 和 FAD2B-F/FAD2-R 通过 PCR 方法分别扩增 AhFAD2A 和 AhFAD2B 基因。FAD2A-F 为 5’ -GATTACTGATTATTGACTT-3’，FAD2B_F 为 5’ -CAGAACCATTAGCTTTG-3’，FAD2_R 为 5’-CTCTGACTATGCATCAG-3’。扩增所用的聚合酶为 LA Taq? DNA polymerase (TaKaRa)，在25 ii L 体系中加入以下成分:2.5 u L IOX PCR buffer (含 MgCl2);2.5 u L IOmM dNTPs ；I u L cDNA 模板；0.5 u L LA polymerase 和 17.5 u L ddH20。PCR 反应条件为:(a)94°C，5min ；(b)94°C,30s ；58°C, lmin40s ；72°C,90s ;共 30cycles ； (c) 72°C, IOmin0 PCR 产物经过1%琼脂糖凝胶电泳分离后用胶回收试剂盒(Axygen)进行纯化，纯化产物连接pMD18_TEasy vector (Takara),转化TOPlO感受态细胞后，筛选阳性克隆送往测序公司(Sangon,Shanghai)测序。对测序结果的核苷酸序列和氨基酸序列进行比对，发现这3个品种中，AhFAD2A和必/?/--都发生基因突变。AhFAD2A基因开放读码框的第448bp处的碱基G突变为A (G448A)，导致相应氨基酸由天冬氨酸(D)突变为天冬酰胺(N，D150N)，基因长度仍为1228bp，开放阅读框为1140bp，编码379个氨基酸。4?/?/--基因序列在起始密码子后第442bp处有碱基A的插入，基因长度增长lbp，导致编码区提前终止，编码一个截短的蛋白(164个氨基酸)，丢失了一个膜结合蛋白保守的组氨酸框。这3个品种(系)E18、花育32号和E16的籽仁油酸含量分别为83.7%, 77.8%, 73.21%，0/L比值分别为41.85，12.3,7.0。
【权利要求】
1. 一种花生高油酸性状基因选择方法，包括以下步骤: (1)采用粗提法提取不同花生品种(系)的叶片基因组； (2)采用特异性引物从基因组中扩增必/?/--和必/?/--基因； 将特异扩增条带切胶回收后连接T载体，转化感受态细胞后，筛选阳性克隆送往测序公司进行序列测定，即得到了基因的序列； (3)对所获得的序列进行翻译，比对分析，查找点突变或插入位点，据此来判断品种(系)油酸含量和油酸/亚油酸(0/L)比值的高低.卿2A基因存在G448A点突变和/?/--基因存在442A点插入的花生是超高油酸(70%以上)材料或品种，0/L值超过7.0;只存在点突变或点插入的花生是高油酸(49%以上)材料或品种，0/L值在1.5-7.0之间，不存在点突变或点插入的花生是普通花生，油酸含量在49%以下，0/L值小于1.5。
2.根据权利要求1所述的一种花生高油酸性状基因选择方法，其特征在于，步骤(2)所述的特异性引物为FAD2A-F/FAD2A-R和FAD2B-F/FAD2B-R，分别扩增4?/?/--和基因；
FAD2A-F 为 5’-GATTACTGATTATTGACTT-3’ ， FAD2A-R 为 5’-CTCTGACTATGCATCAG-3’ ；FAD2B-F 为 5’-CAGAACCATTAGCTTTG-3’，FAD2B-R 为 5’-CTCTGACTATGCATCAG-3’。
3.根据权利要求1所述的一种花生高油酸性状基因选择方法，其特征在于，步骤(2)所述的基因扩增是通过PCR方法，扩增所用的聚合酶为LA Taq?DNA polymerase (TaKaRa)，在25 ii L 体系中加入以下成分:2.5 u L IOX PCR buffer (含 MgCl2);2.5 u L IOmM dNTPs ；IuL cDNA 模板；()? 5 u L LA polymerase 和 17.5 u L ddH20 ； PCR 反应条件为:(a) 94 °C, 5min ；(b)94 °C，30s ；58 °C，lmin40s ；72 °C，90s ；共30cycles ； (c) 72°C, IOmin ； PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳分离后用胶回收试剂盒(Axygen)进行纯化，纯化产物连接pMD18_T Easy vector (Takara),转化TOPlO感受态细胞后,筛选阳性克隆送往测序公司(Sangon, Shanghai)测序。
4.根据权利要求1所述的一种花生高油酸性状基因选择方法，其特征在于，步骤(3)中测序得到的普通花生品种中必/?/--基因长度为1228bp，必/?/--基因为1220bp，开放阅读框均为1140bp，编码379个氨基酸，通过比对不同品种(系)中获得的4?/?/-- MAhFAD2B基因的核苷酸序列和氨基酸序列，查找点突变或插入位点，据此来判断品种(系)油酸含量和油酸/亚油酸(0/L)比值的高低。
【文档编号】C12Q1/68GK103525931SQ201310482957
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月16日 优先权日:2013年10月16日
【发明者】禹山林, 迟晓元, 杨庆利, 陈娜, 潘丽娟, 陈明娜, 王通, 王冕, 杨珍 申请人:山东省花生研究所