用于鉴定甜瓜果肉颜色的高通量分子标记及其专用引物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，设及一种用于鉴定甜瓜果肉颜色的高通量分子标记 及其专用引物。
【背景技术】
[0002] 甜瓜（化cumismeloL.)是葫芦科黄瓜属甜瓜种的重要经济作物。甜瓜的主要食 用部分中、内果皮，统称为果肉，果肉颜色性状是甜瓜比较重要的商品性状，独特的颜色往 往会更受消费者欢迎。甜瓜果肉颜色具有丰富的变异类型，主要有橘红色、浅橘色、绿色、白 色和运些颜色的混合色（Watan油eK，SaitoLHirotaSJakahashiBJujishitaN. 1991. Carotenoidpigmentsinorange,lightorange，greenandwhitefleshcoloredfruits ofmelon(CucumismeloL. ).JournaloftheJapaneseSocietyforFoodScienceand Technology, 38 :153 - 159.)。果肉颜色的多样性使甜瓜育种朝着多元化的方向发展，增加 市场对不同类型甜瓜的需求。
[0003] 甜瓜果肉颜色受两个基因控制：绿肉基因（gf)和白肉基因（wf，对橘红色果肉 呈隐性），其中白肉基因对绿肉基因具有显性上位作用。甜瓜橘红肉（Gf)对绿肉（gf)为 显性；当携带有奸奸基因时，甜瓜果肉呈现为呈现绿肉（Wf-奸奸）或白肉（wfwfgfgf) (Hughes,!. (1948)TheinheritanceoftwocharactersofCucumismeloandtheir interrelationship.Proc.Am.Soc.Hortic.Sci. 59, 399 - 402. ；Clayberg,C. (1992) InteractionandlinkagetestoffleshcolorgenesinCucumismeloL.Rep. CucurbitGenet.Coop. 15, 53.)。
[0004] 近年来，有研究者通过遗传图谱构建、基因组文库构建和的'L定位等方法，定位了 控制果肉颜色的基因位点。化evas等（2009)将1个与果肉颜色形成有关的P-胡萝h素 合成基因定位到甜瓜第9连锁群。Haral-Beja等（2010)在其构建的甜瓜图谱第2、6、8连 锁群上找到了 3个与果肉颜色有关的QTL;王贤磊等（2011)利用日本"安农2号"和新疆哈 密瓜"K413"杂交得到的F2群体，将果肉颜色有关的giL定位到了第9连锁群上，并找到了 与果肉颜色遗传距离分别为12. 8cm和7. 4cm的两侧翼标记。杨光华等（2014)也将果肉颜 色的基因定位在了第9号染色体上。由于早期研究所用的实验材料和标记不同，定位到的 与甜瓜果肉颜色性状相关的的'L数量和位置不同，不能与相应的染色体对应，在不同图谱 间比较就很困难。加之甜瓜果肉颜色性状遗传背景复杂，采用传统的杂交、回交和表型选择 进行育种周期长、成本高，分子标记辅助育种可W从基因型上筛选种质资源，极大地提高育 种效率，分子标记辅助育种已经被大量应用到育种实践中，取得较好的效果。目前有关甜瓜 果肉颜色的分子标记与目标基因的距离较远，通用性和准确性不高，无法在实际育种工作 中发挥作用，运在一定程度上限制了针对甜瓜果肉颜色相关性状进行改良的育种进程。获 得与甜瓜果肉颜色控制基因连锁的分子标记，特别是针对目标基因的关键突变位点开发的 功能性分子标记是利用分子标记辅助甜瓜果肉颜色性状转育，实现种质创新的前提条件。 阳0化]随着甜瓜基因组测序的完成并对外公布，特别是基于甜瓜基因组信息开发的大量 的SSR和SNP标记，加快了甜瓜果肉颜色相关性状基因的定位和克隆。Tzuri等（2015)根据 前人对果肉颜色相关基因的定位研究结果结合甜瓜基因组信息，找到了控制甜瓜果肉颜色 性状的CmOr基因，甜瓜果肉颜色控制基因CmOr的克隆使得基于目标基因序列开发功能型 分子标记成为可能，然而由于针对CmOr基因的SNP位点开发CAPS(dCAP巧标记需要对PCR 产物进行酶切，再利用聚丙締酷胺凝胶对目标片段进行分离检测等步骤，过程较为繁琐，使 得针对SNP开发的CAPS(dCAP巧标记在甜瓜果肉颜色性状转育的分子标记辅助育种方面的 应用具有一定的局限性。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的是提供一种用于检测甜瓜CmOr基因的KASP引物。
[0007] 本发明所提供的用于检测甜瓜CmOr基因的KASP引物，由引物1、引物2和引物3 组成；所述引物1为自5'端到3'端依次为标签序列A和序列表中序列1的第22-49位的 单链DNA;所述引物2为自5'端到3'端依次为标签序列B和序列表中序列2的第22-49位 的单链DNA;所述引物3为核巧酸序列如序列表中序列3所示的单链DNA。 阳00引进一步，所述标签序列A的核巧酸序列为序列表中序列1的第1-21位；所述标签 序列B的核巧酸序列为序列表中序列2的第1-21位。
[0009] 更加具体的，所述引物1为核巧酸序列如序列表中序列1所示的单链DNA;所述引 物2为核巧酸序列如序列表中序列2所示的单链DNA。
[0010] 本发明的第二个目的是提供一种用于检测甜瓜CmOr基因的试剂盒。 W11] 本发明所提供的用于检测甜瓜CmOr基因的试剂盒，含有所述KASP引物。
[0012] 所述试剂盒中还含有巧光探针A、巧光探针B、泽灭探针A和泽灭探针B;
[0013] 所述巧光探针A的核巧酸序列与所述标签序列A的核巧酸序列一致，5'末端连接 巧光基团A;所述泽灭探针A的核巧酸序列与所述标签序列A的核巧酸序列反向互补，3'末 端连接泽灭基团；
[0014] 所述巧光探针B的核巧酸序列与所述标签序列B的核巧酸序列一致，5'末端连接 巧光基团B ;所述泽灭探针B的核巧酸序列与所述标签序列B的核巧酸序列反向互补，3'末 端连接泽灭基团。 阳01引在本发明中，所述巧光基团A为FAM;所述巧光基团B为肥X;所述泽灭基团为B册。
[0016] 在本发明中，所述巧光探针A、所述巧光探针B、所述泽灭探针A和所述泽灭探针B 是存在于KASP V4. 02XMaster Mix中的，其中所述KASP V4. 02XMaster Mix为英国LGC 公司产品，其产品目录号为邸S-1016-002(适用于96/384孔板）或邸S-1016-011(适用于 1536孔板）。
[0017] 所述KASP引物或所述试剂盒在如下任一中应用也属于本发明的保护范围：
[0018] (A)检测或辅助检测甜瓜CmOr基因的基因型；
[0019] 做检测或辅助检测待测甜瓜果肉颜色；
[0020] 似甜瓜果肉颜色性状转育。
[0021] 本发明的第S个目的是提供一种检测或辅助检测甜瓜CmOr基因的基因型的方 法D
[0022] 本发明所提供的检测或辅助检测甜瓜CmOr基因的基因型的方法，具体可包括如 下步骤所述待测甜瓜的基因组DM为模板，采用所述试剂盒中的所述KASP引物（所述 巧光基团A为FAM;所述巧光基团B为肥讶进行PCR扩增，将所得扩增产物进行巧光信号 扫描，采用Kraken软件对扫描数据进行分析，根据分析结果按照如下确定所述待测甜瓜的 CmOr基因的基因型：若所述待测甜瓜的扩增产物的巧光信号数据经Kraken软件分析在所 得分型聚类图中呈现蓝色，则所述待测甜瓜的CmOr基因为A:A基因型；若所述待测甜瓜的 扩增产物的巧光信号数据经Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现红色，则所述待测 甜瓜的CmOr基因为G:G基因型；若所述待测甜瓜的扩增产物的巧光信号数据经Kraken软 件分析在所得分型聚类图中呈现绿色，则所述待测甜瓜的CmOr基因为A:G基因型；
[0023] 其中，所述A:A基因型是所述CmOr基因CDS序列的第323位核巧酸为A的纯合型； 所述G:G基因型是所述CmOr基因CDS序列的第323位核巧酸为G的纯合型；所述A:G基因 型是所述CmOr基因CDS序列的第323位核巧酸为A和G的杂合型。 W24] 相应的，所述A:A基因型是指W待测甜瓜基因组DNA为模板，采用引物对CmOr-SNPF/CmOr-SNPR进行PCR扩增所得特异性扩增产物中具有引物CmOr-SNPF所示序列 的DNA链的核巧酸序列的第162位为A的纯合型（即扩增产物单一，如序列5所示）；所述 G:G基因型是指W待测甜瓜基因组DNA为模板，采用引物对CmOr-SNPF/CmOr-SWR进行PCR