PF/ CmOr-SNPR进行PCR扩增所得特异性扩增产物中具有引物CmOr-SNPF所示序列的DM链的 核巧酸序列如序列表中序列4所示；W橘红肉甜瓜材料M285的基因组DNA为模板，采用引 物对CmOr-SNPF/CmOr-SNPR进行PCR扩增所得特异性扩增产物中具有引物CmOr-SNPF所示 序列的DNA链的核巧酸序列如序列表中序列5所示。经DNAMAN软件比对发现上述CmOr基 因扩增特异片段（序列4和序列5)在162bp处（对应于CmOr基因的第323位核巧酸）存 在的G-A单碱基突变位点，根据该SNP设计高通量KASP分子标记。 W64] 用于高通量筛选的KASP标记引物序列如下： 阳0化]CmOr-F1 :5 '-TCCATATGCAAGAAAATTTTGTTTCGA里-3 ' ；
[0066] Cm0r-F2:5 '-TCCATATGCAAGAAAATTTTGTTTCGA C-3 '；
[0067]CmOr-R: 5 ' -ATAGAGGGACCGGAAACAGTACAAG-3 '。
[0068] 由于CmOr基因中上述G-A单碱基突变位点所在的DM链恰好与CmOr基因中具有 上游引物CmOr-Fl或Cm0r-F2所示序列的DNA链反向互补，针对SNP位点，上游引物CmOr-Fl 和Cm0r-F2的3'端为等位变异碱基（粗体下划线部分的T或C，将CmOr-Fl和Cm0r-F2在 5'端加上相应的通用接头序列（巧光标签序列），如下：
[0069] CmOr-Fladaptor:5' -GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3'(FAM巧光标签序列）；
[0070] Cm0r-F2adaptor:5' -GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3'(肥X巧光标签序列）。
[0071] 得到相应的CmOr基因高通量分子标记引物序列：
[0072]CmOr-Allele-Fl:
[0073] 5' -GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCCATATGCAAGAAAATTTTGTTTCGAT： 3'(序列 1，其中 下划线部分为FAM巧光标签序列）；
[0074]Cm0r_Allele-F2 ： 阳0巧]5 '-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCCATATGCAAGAAAATTTTGTTTCGA亿 3 '(序列 2,其 中下划线部分为肥X巧光标签序列）；
[0076]Cm0r-R:5' -ATAGAGGGACCGGAAACAGTACAAG-3'(序列3)。
[0077] 上述引物由上海生工公司北京合成部合成。
[0078] 实施例2、利用高通量KASP标记检测甜瓜CmOr基因的方法的建立
[0079] 一、提取基因组DNA
[0080] 参见实施例1步骤一。 W81]二、PCR扩增
[0082]W步骤一提取的基因组DNA为模板，用实施例1开发的用于检测甜瓜CmOr基因的 KASP标记的专用引物分别进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0083]KASP基因分型PCR反应体系：
[0084] 96 孔板：10ng基因组DNA，5ylKASPV4. 02XMasterMix,0. 14KASP 72Xassaymix,加（1地2〇 至 10y1。 阳0 化]384 孔板：5ngDNA，2. 5ylKASPV4. 02XMasterMix, 0.07ylKASP72Xassay mix,加(1地2〇 至 5y1。
[0086] 1536孔板：5ngDNA，2. 5y1KASPV4. 02XMasterMix，0. 07y1KASP72Xassay mix,加(1地2〇 至 5y1。
[0087] 其中，KASPV4. 02XMasterMix为LGC公司产品，其种用于96/384孔板的KASP V4. 02XMasterMix的产品目录号为邸S-1016-002 ;用于 1536孔板的KASPV4. 02XMaster Mix的产品目录号为邸S-1016-011。KASP2XMasterMix由巧光探针A、巧光探针B、 泽灭探针A和泽灭探针B，W及高保真的Taq酶，dNTP等组成。巧光探针A的序列为 5 ' -GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3 '，5 '末端连接1个巧光基团FAM;巧光探针B的序列 为5' -GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3'，5'末端连接1个巧光基团肥X;泽灭探针A的序列 为5 ' -AGCATGAACTTGGTCACCTTC-3 '，3 '末端连接泽灭基团B册；泽灭探针B的序列为 5' -AATCCGTTGACTCCGACCTTC-3'，3'末端连接泽灭基团B册。
[0088]KASP72Xassaymix由实施例 1 获得的引物Cm0r_Allele-Fl、Cm0r_Allele-F2和 CmOr-R分别稀释至浓度为100yM后，将CmOr_Allele-Fl稀释液、CmOr_Allele-F2稀释液 和CmOr-R稀释液与dd&O按12:12:30:46的体积比混合得到。
[0089] KASP基因分型PCR扩增反应的反应程序为：
[0090] 阶段 1 :94°C预变性 15min;阶段 2 :94°C20s，61-55°C(每个循环降 0. 6°C)Imin， 共循环10次；阶段3 :94°C20s，55°CImin，共循环26次。其中PCR水浴热循环为 Hy化ocycler16-32高通量热循环系统，适用于96、384和1536孔板。 阳0川实验同时设置反应体系中不添加模板DNA的空白对照，每个PCR板设置2个空白 对照。 阳09引 S、PCR扩增产物的巧光扫描
[0093] 采用双向单激发读板仪P肥RAstar对PCR扩增产物进行扫描，FAM激发波长为 485nm，发射波长为520nm，肥X激发波长为528nm，发射波长为560nm，系统参比巧光R0X激 发波长为575皿，发射波长为610皿。
[0094] 每个PCR扩增产物样本设置至少3个重复。 阳0巧]四、等位基因分型
[0096] 采用Kraken?软件对读板仪P肥RAstar扫描数据分析（具体操作方法参考 Kraken?软件说明书，公众可W直接从LGC公司购买，见网址ht化://www.Igcgroup.com/ products/genotyping-software/kraken/#.化。日191(18_]\1)，根据分析结果按照如下确定待 测甜瓜CmOr基因的具体基因型：聚合在接近X轴的显示蓝色的样本的基因型为连接FAM巧 光标签序列的等位基因型，聚合在接近Y轴上的显示红色的样本的基因型为连接肥X巧光 标签序列的等位基因型，中间显示绿色的样本的基因型为两种等位基因的杂合型，显示粉 色的样本可能由于DNA质量不好或浓度过低，扩增产物没有被明确分型，左下角显示黑色 的样本为空白对照。
[0097] 具体而言，如下：若所述待测甜瓜的扩增产物的巧光信号数据经Kraken软件分 析在所得分型聚类图中呈现蓝色，则所述待测甜瓜的CmOr基因为A:A基因型；若所述待 测甜瓜的扩增产物的巧光信号数据经Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现红色，贝U 所述待测甜瓜的CmOr基因为G:G基因型；若所述待测甜瓜的扩增产物的巧光信号数据经 Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现绿色，则所述待测甜瓜的CmOr基因为A:G基因 型。
[0098] 实施例3、高通量KASP标记检测甜瓜CmOr基因的验证及在育种中的应用
[0099] 一、供试材料
[0100] 供试体材料包括：W橘红肉甜瓜品种M285(A:A基因型）为供体亲本，白肉甜瓜品 种伊丽莎白（G:G基因型）为轮回亲本，对甜瓜果肉颜色性状进行回交转育。M285和伊丽莎 白杂交得到相应的F1代，F1代自交得到F2群体，F1与轮回亲本伊丽莎白回交得到BC群 体。选择橘红肉甜瓜品种PI414723 (A:A基因型）和V6化antaiS(A:A基因型），绿肉甜瓜品 种绿宝（G:G基因型）、亲本伊丽莎白（G:G基因型）和M285(A:A基因型）作为分子标记辅 助标记筛选的对照。对照甜瓜的CmOr基因的基因型已经测序验证。
[0101]W上BC、F2代分离群体于2013年秋在海南培育、采种，于2014年4月在溫室 中育苗，定植于北京市农林科学院蔬菜研究中屯、四季青试验基地，其中父本、母本、 PI414723、V6化antais、绿宝、各定植20株