表1基于两组别的P值列出了差异最明 显的5个位点的阳性例数及统计学P值。说明：经过初步筛选，选出了5对差异最明显的 MSP引物进一步进行实时PCR的研究。
[0071]表1
[0072]
[0073] 引物序列如下示：
[0074] JAM3-M4的引物：MF: CGTAGTTAGGGTTGGGATTC (沈Q ID NO. 6)
[00巧]MR:GAAATCCGACGACTATCCGA(SEQ ID N0:7)，
[0076] JAM3-U4的引物：UF:TGTAGTTAGGGTTGGGATTT(沈Q ID NO. 18)
[0077] UR:CAAAATCCAACAACTATCCA(SEQ ID NO. 19)，
[0078] CADM1-M2的引物：MF:GTTTTTCGTTATTTGTTGTTTTC(SEQ ID NO. 8)
[0079] MR:GAAACCGCGAAATACGAACG(SEQ ID NO. 9)，
[0080] CADM1-U2的引物：UF:GTTTTTTGTTATTTGTTGTTTTTG(沈Q ID NO. 20)
[0081] UR:AAAACCACAAAATACAAACA(SEQ ID NO. 21),
[0082] CADM1-M8的引物：MF:GTCGTCGTATATTGGGATTC(沈Q ID NO. 10)
[0083] MR:TCTCATTAACTATCCGCTCG(SEQ ID NO. 11)，
[0084] CADM1-U8的引物：UF:GTTGTTGTATATTGGGATTT(沈Q ID NO. 22)
[0085] UR:TCTCATTAACTATCCACTCA(SEQ ID NO. 23),
[0086] DAPK1-M2的引物：MF:CGTTTGTAGGGTTTTTATTGGTC(SEQ ID NO. 12)
[0087] MR:CTACCGCTACGAATTACCGA(SEQ ID NO. 13)，
[0088] DAPK1-U2的引物：UF:TGTTTGTAGGGTTTTTATTGGTTG(沈Q ID NO. 24)
[0089] UR:CCTACCACTACAAATTACCA(SEQ ID NO. 25),
[0090] DAPK1-M3的引物：MF:GTTTTTATTGGTCGTTTGTC(SEQ ID NO. 14)
[0091] MR:GACGTTAACTCGATCCGACT(SEQ ID NO. 15)，
[0092] DAPK1-U3的引物：UF:TTTTATTGGTTGTTTGTTGG(SEQ ID NO. 26)
[0093] UR:CCCAACATTAACTCAATCCA(SEQ ID NO. 27)。
[0094] 二、在宫颈无瘤变-癌前病变-癌患者中的验证
[0095] 1) 5个初步筛选出位点的验证-QMSP
[0096] 在齐鲁医院妇产科口诊阴道镜室收集了宫颈无瘤变-癌前病变-癌患者的脱落细 胞，其中包括慢性宫颈炎53例，CIN159例，CIN271例，CIN363例及宫颈鱗癌20例。从W上 所述的样品中提取DNA后，对其进行亚硫酸氨盐修饰作为QMSP的模板。MSP筛选出了癌与 正常组织中甲基化频率差异度最大的5个位点一CADM1-M2、CADM1-M8、DAPK1-M2、DAPK1-M3 及JAM3-M4,通过QMSP进一步验证其在早期诊断和筛查中的应用价值。随病变程度加重，基 因位点的甲基化程度逐渐升高，WJAM3-M4尤为明显，在诊断分组间的差异明显，如图2所 /J、-〇
[0097] 2)焦憐酸测序验证JAM3-M4在宫颈无瘤变-癌前病变-癌患者脱落细胞的甲基化 水平
[009引从实时PCR的样本各个分组中随机选出NILM(n= 8)，CIN1(n= 10)，CIN2QMSP阴 性（QM-)(n= 9)，CIN2QMSP阳性（QM+)(n= 8)，CIN3(n= 10)，canceHn= 9)样本进行 焦憐酸测序，对JAM3-M4位点的甲基化水平更进一步地量化和验证（图3A和B)。为了跟 之前的实时PCR的结果分析一致，跟临床需要阴道镜处理的组织学诊断相符，CIN1-，CIN2， CIN3+分类的焦憐酸测序统计学分析如图3C。
[0099]S、JAM3-M4在临床中的应用分析
[0100] 1)JAM3-M4单独应用于临床早期筛查
[0101]目前在临床上广泛用于早期筛查的检验方法是细胞学和HPV，将JAM3-M4的检验 效能（敏感性、特异性、阳性预测值及阴性预测值）与运两者比较，如表2,提示与HPV和细 胞学相比，尽管敏感性和阴性预测值有轻微下降，但是特异性和阳性预测值有显著提高，在 WCIN3为界值时表现尤为明显。
[010引表2
[0103]
[0104] 2)与细胞学结合的应用一联合筛查和分流筛查
[0105] 宫颈液基细胞学筛查利用己氏染色法步骤：
[0106] (1)将固定后的涂片入水、苏木精染核、盐酸酒精分化、返蓝同临床病理常用的肥 染色。
[0107] (2) 70%、80%、95%酒精逐级脱水各：1分钟。
[0108] (3)澄黄-G63-5 分钟。
[0109](4) 95 %酒精I、II缸洗各1分钟。
[0110] (5)EA365 分钟。
[0111] (6)95%酒精I、II缸洗各1分钟。
[0112] (7)无水酒精I、II缸洗各1分钟。
[0113] 做二甲苯I、II缸透明各1分钟。
[0114] (9)中性树胶封固。
[0115] 结果己氏染色法将胞核染为深蓝色；鱗状上皮底层、中层及表层角化前细胞胞质 染绿色，表层不全角化细胞胞质染粉红色，完全角化细胞胞质呈枯黄色；高分化鱗癌细胞可 染成粉红色或枯黄色；腺癌胞质呈灰蓝色；中性粒细胞和淋己细胞、吞隧细胞胞质均为蓝 色；红细胞染粉红色，粘液染成淡蓝色或粉红色。
[0116] ①联合筛查即在早期筛查时，同时应用细胞学和甲基化检测，其检验效能及与目 前常用的细胞学与HPV联合筛查的对比如表3所示，尽管敏感性和阴性预测值有轻微下降， 但是特异性和阳性预测值有显著提高，在WCIN3为界值时表现尤为明显。
[0117]表 3 [011引
[0119] ②分流筛查即在早期筛查时，首先应用细胞学检查，然后对细胞学诊断异常的患 者，进行甲基化检测，对其进行分流，决定是否进行阴道镜检并处理，JAM3-M4的分流效能及 与常用的HPV分流的对比如表4所示；鉴于细胞学诊断为服IL的特异性较高，分流的意义 不大，故将JAM3-M4分流细胞学诊断为LSIL和ASCUS的患者进行单独分析，如表5所示，对 于分流细胞学诊断为LSIL的效能分析，特异性和阳性预测值显著升高，而敏感性和阴性预 测值未有影响；对于分流细胞学诊断为ASCUS的效能分析，特异性和阳性预测值显著提高， 敏感性和阴性预测值有一定程度下降。但是对于年龄小于30岁（HPV高感染率的年龄段） 的细胞学诊断为ASCUS患者，7例均为HPV阳性，5例为CIN1-，JAM3-M4均为阴性，提示分流 意义更大。
[0120] 表 4
[0121]
[012引表5
[0123]
[0124] 3)与HPV结合的应用一联合筛查和分流筛查
[01巧]HPV是由肥2试剂盒（QiagenGmbH,Germany)完成检测，待测样本> 1.Opg/ml，相 当于5000拷贝/次，即判为阳性。
[0126] ①联合筛查即在早期筛查时，同时应用HPV和甲基化检测，其检验效能及与目前 常用的细胞学与HPV联合筛查的对比如表6所示，尽管敏感性有轻微下降，但是特异性、阳 性预测值显著提高，阴性预测值在CIN3+/CIN1-和CIN3+/CIN2-诊断学分组轻度升高，在 CIN2+/CN1-略微下降。
[0127]表6 [012引
[0129] ②分流筛查即在早期筛查时，首先应用HPV检查，然后对HPV阳性的患者，进行甲 基化检测，对其进行分流，决定是否进行阴道镜检并处理，JAM3-M4的分流效能及与常用的 细胞学分流的对比如表7所示；特异性和阳性预测值显著升高，敏感性轻微下降，阴性预测 值略有上升。
[0130]表7
[0131]
[0132] 4)ROC曲线分析JAM3-M4甲基化的临床诊断效能
[0133]R0C曲线是临床检验常用的一种统计方法，能够比较不同诊断试验对疾病识别能 力。针对不同的人群一一图4(A)所有收集的病例、度）细胞学诊断异常的病例、（C)细胞学 诊断为ASCUS的病例、做细胞学诊断为LSIL的病例、似HPV阳性的病例，通过R0C曲线 (曲线下面积为衡量指标）分析研究了JAM3-4甲基化的临床诊断效能；曲线下面积提示对 临床的分流均较有意义。
[0134] 5)分流CIN2的指示意义
[0135] 鉴于W上分析，WCIN3为界值的临床诊断效能均高于CIN2+/CIN1-。苔萃文献分 析，CIN病变可W分为复制型（CIN1和CIN2)及转化型（CIN2和CIN3)病变。复制型和转 化型的CIN2通过形态学观察无法区分，2014版WK)的指南提出用组织学切片进行免疫组化 P16的染色，根据阳性阴性将CIN分流为服IL和LS比，代表性的CIN2病例的免疫组化染色 及焦憐酸测序如图5示。所有的CIN2病例中，P16的阳性率为69. 78%，而JAM3-M4的阳 性率为48. 84%.两者的相符率为60.47%(p= 0.119)，虽然统计学意义不显著，但是还是 存在一定分流指示意义。
[0136] 上述虽然结合附图对本发明的【具体实施方式】进行了描述，但并非对本发明保护范 围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不 需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围W内。
【主权项】
1. 一种基于HPV-DNA检测与DNA甲基化筛查早期宫颈癌的试剂盒，其特征是：包括 HPV-DNA检测的试剂，检测基因JAM3-M4甲基化的试剂，所述基因JAM3-M4的序列如SEQID No. 1所示。2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征是：所述HPV-DNA检测是由HC2试剂盒完成。3. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征是：所述检测基因JAM3-M4甲基化包括QlAamp DNAMiniKit试剂盒，QIAampEpiTectBisulfiteKits试剂盒。4. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征是：还包括PCR反应液。5. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征是：还包括扩增基因JAM3-M4的正向引物序列 如SEQIDNo. 6所示，反向引物序列如SEQIDNo. 7所示。6. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征是：还包括所扩增P-actin的正向引物序列如 SEQIDNo. 16所示，反向引物序列如SEQIDNo. 17所示。7. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征是：还包括ddH20。
【专利摘要】本发明公开了一种基于HPV-DNA检测与DNA甲基化筛查早期宫颈癌的试剂盒，其特征是：包括HC2试剂盒、QlAamp？DNA？Mini？Kit试剂盒，QIAamp？EpiTect？Bisulfite？Kits试剂盒，JAM3-M4的正向引物序列如SEQ？ID？No.6所示，反向引物序列如SEQ？ID？No.7所示，β-actin的正向引物序列如SEQ？ID？No.16所示，反向引物序列如SEQ？ID？No.17所示，PCR反应液。本发明用于宫颈癌早期筛查的试剂盒，检测灵敏性、特异性、阳性预测值及阴性预测值经临床组织样本的初步以及大量的宫颈脱落细胞学的进一步验证，达到临床诊断的要求。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105200147
【申请号】CN201510706415
【发明人】孔北华, 殷爱军, 苑存忠, 乔云波
【申请人】山东大学齐鲁医院
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年10月27日