ion， Roche公司），抗地高辛-辣根过氧化物酶复合物检测试剂盒（Anti-Digoxigenin-POD，F油化agments，Roche公司），增强原位表达检测信号的TSA信号放大系统灯SA?Biotin System,肥L700试剂盒，Perki址Imer公司），DAB染色试剂盒（北京中山公司），20x巧樣 酸钢缓冲溶液（salinesodiumcitrate,SSC)，硫酸葡聚糖值extransulphate),去离子 甲酯胺值eionizedF'ormamide)，多聚腺巧酸（polyadenylicacid，PolyA),多聚脱氧腺 巧酸（polydeo巧aden}dicacid,化lydA)，变性剪切的娃精DNA(denaturedandsheared salmonspermDM,ssDNA)，酵母转运RNA(yeastt-RNA，tRNA)，二硫苏糖醇值TT)，50x邓 罕氏缓冲液值enhar化s'ssolution),憐酸缓冲液（PBSbuffer),胃蛋白酶K，牛血清白蛋 白度SA)，S乙醇胺灯EA)，TNBBuffeHO.IMTris-HCl，抑7. 5,0. 15MNaCL，0. 5%Blocking Reagent),TNTBuffer(0.IMTris-肥 1，抑7.5,0. 15M化化，0.05%Tween20)，醋酸酢，阻 iff子式齐ll(Blockin邑reagent曰邑ent，Roche&司）。 阳107] 1.3其他主要试剂和材料
[0108] 无水乙醇、90%酒精、70%酒精、50%酒精、松节油、双蒸水、PBS缓冲液（pH7. 2~ 7. 4,化C1 137mmol/L，KC1 2. 7mmol/L，胞2册〇44. 3mmol/L，KH2PO4I. 4mmol/L) ;3 % 甲 醇-双氧水溶液（80 %甲醇和30 %双氧水配置）；0.01mol/L巧樣酸盐缓冲液（citrate buffer,CB，pH6. 0 + 0.l，9ml0. 1M巧樣酸溶液和41ml0. 1M巧樣酸钢溶液加入450ml蒸 馈水中临时配置后再校正工作液抑值）；〇.1%膜蛋白酶；苏木素；1%盐酸酒精（1ml浓盐 酸+99ml70%酒精配置）；封片胶（PTSCureMountII)。Leica低烙点（58°C)石蜡，国 产蜂蜡，无水酒精，二甲苯，10%中性多聚甲醒化01111〇1/1，抑7.4,06口(：双蒸水和口85缓冲 液配制），苏木素，伊红，中性封片树胶，盖玻片，载玻片。
[0109] 1.4标记探针
[0110] 利用3-tailingDIGOli即ucleutideKit进行寡核巧酸探针标记，反应体系如 下。
[0111]lOOpmololigonucleotide+dd&O=9y1(control:controloligonucleutide 5yl+dd&O4y1) 阳112] Reactionbuffer4jil CoCh 4li1 Dig-dUTP dATPIpl Terminaltransferaseipl 阳11引 混匀，稍离屯、。37°C水浴反应30min，加2yl邸TA(0. 2M，PH8. 0)中止反应。
[0114] 1. 5寡核巧酸探针标记后纯化
[0115] 为了增加标记探针的纯度，需对已标记的探针进行纯化，具体操作如下： 阳116] 1)探针反应混合物（22^1)+2.5^14]?11(：1+75^1100%冷乙醇（-20°(：).
[0117] 2)-70°(：沉淀6〇111111，〇尸20°(：化。 阳1化]3) 13. 000Xg4°C离屯、15min。
[0119] 4)弃上清，用50ii1冰冷的70% (V/V)乙醇洗涂。
[0120] 5) 13.OOOxg4°C，离屯、5min。 阳121] 6)弃上清，真空4°C干燥。
[0122] 7)用无菌双蒸水重溶探针。 阳123] 1. 6原位杂交检测存档石蜡切片中BART6-化的表达
[0124] 石蜡切片杂交前处理
[01巧]1)4°C保存的石蜡切片置于58°C烤片30min，烙化表面石蜡。
[0126] 2)二甲苯依次脱蜡3X5min。 阳127] 3)梯级酒精洗涂，100 %酒精2X2min- 95 %酒精1X5min- 70 %酒精 1X5min一 50 % 酒精 1X5min一DEPC水洗涂 2X3min一DEPC-PBS洗涂 2X5min。 阳12引 4)滴加300y1胃蛋白酶K(l〇yg/ml)于切片上，37°C消化20min。
[0129] 5)切片入PBS(0. 1MPBS巧mg/ml谷氨酸）洗涂Imin，中止反应。
[0130] 6)切片入0.2N肥以于37°C反应20-30min，增加组织的通透性。 阳13U 7)切片用4%多聚甲醒化1MPBS溶解）后固定lOmin，室溫。
[0132] 8)为了增加组织阳性杂交强度，对切片进行乙酷处理。切片入0.25%乙酸酢 BufferI(0.IMS乙醇胺），室溫lOmin。 阳133] 9) 1MPBS洗涂 2X5min。
[0134] 预杂交和杂交
[0135] 预杂交：-20°C保存的预杂交液，先置于37°C解育60min，预杂交液的用量为 50iil，石蜡膜履盖切片，37°C湿盒中预杂交2小时。（预杂交液成份包括：2XSSC，10% Dextransulphate，IXDenhardt'ssolution，50mMPhosphateBuffer(PH7.0)，50mM DTT, 250y1,100yg/mlpolyA,5jig/mlpolydA, 250yg/mlyeastt-RNA, 500yg/ml ssDNA，47%Deionizedformamide)。
[0136] 1)移去石蜡膜，甩掉预杂交液，切片置于2XSSC中5min。 阳137] 2)杂交反应：37°C杂交过夜（18-20h)。每一切片加入250y1杂交液并用石蜡膜 履盖。预杂交液中加入相应的探针就成为杂交液。杂交液在预杂交时配制，放置37°C解育， 使探针充分溶解于杂交液中，本实验所用杂交液中探针的终浓度为5(K)ng/ml。
[0138] 3)杂交后洗涂，切片浸入2XSSC，10min，掲去石蜡膜。依次于摇床上摇动洗涂， 2XSSC(0. 5%SD巧，2X15min一 0. 25XSSC(0. 5%SD巧，2X15min。
[0139] 杂交后显色检测反应
[0140] 1)采用Anti-Digoxigenin-POD检测地高辛探针与mRNA结合复合物；TSA放大系 统增强原位杂交反应显色反应的阳性信号，DAB显色。 阳141] 2)切片转至TNT缓冲液中，3X5min。 阳1创 3)滴加TNB阻断缓冲液，300y1/TMAs，室溫，30min。
[0143] 4)吸去多余阻断剂，1:100 稀释的Anti-Digoxigenin-POD(TBS+0. 1 %Triton X-100+1 %阻断剂），室溫4小时。
[0144] 5)TNTBuffeHO. 1MTris-CL，pH7. 5,0. 15M化CL，0. 05 %Tween20)洗涂， 3x5min。
[0145] 6)切片上滴加信号放大试剂Biotin}dTyamid，300y1/TMAs，度iotinylTyramid 胆存液：BiotinylTyramid溶解于 0. 2mlDMS0，Biotin}dTyramid工作液：1X稀释液， 1:50稀释Biotin}dTyramid胆存液），室溫10分钟。 阳 146] 7)TNT洗，3X5min。
[0147] 8)切片滴加SA-HRP(链霉卵白素-辣根过氧化物酶），300y1/TMAs，室溫30min。
[0148] 9)TNT洗，3X5min。 阳1例10)蒸溜水洗涂，1XImin。 阳150] 11)DAB显色，显微镜下巧制显色反应。 阳151] 12)苏木素复染， 阳152] 13)酒精梯级脱水，切片干燥。 阳153] 14)滴加封片胶，相应规格的盖玻片盖化紫外灯下交联切片Imin。
[0154] 1.7结果判断及标准
[0155] 应用光学显微镜分别在低倍和高倍镜下进行观察，首先观察目标RNA的阳性表达 信号在观察目标细胞内的定位：位于细胞核、细胞浆或细胞膜。
[0156] 再分别W该检测RNA表达部位阳性信号的强度和阳性表达的细胞数两种标准进 行综合评分，判断标准为：（1)依据阳性细胞染色强度判断：a.细胞无染色，记0分；b.细 胞染成浅栋色为弱阳性，记1分；C.细胞染成栋色且无背景着色，或细胞染成深栋色并有浅 栋色背景为中等阳性，记2分；d.细胞染成深栋色且无背景着色为强阳性，记3分。（2)依 据阳性细胞表达数计分：a.无阳性细胞表达，记0分；b.阳性表达细胞数《25%，记1分； C.25 % <阳性细胞数< 50 %，记2分；d.阳性表达细胞数> 50 %，记3分。 阳157] 为了尽量降低评分结果的主观因素，由两位病理学专家分别按上述标准之一各自 进行判断和评分，再将两者评分相乘，结果为：①0分者最终计为0分，认为阴性表达；②1 分和2分者最终计为1分，认为弱阳性表达；③3分和4分者最终计为2分，认为中等阳性 表达；④6分到9分者最终计为3分，认为强阳性表达。
[0158] 1.8分析和统计软件
[0159] 应用SPSS13.0统计软件对实验结果进行统计学分析，两两比较用x2test或 Fisherexacttest,相关性分析义用Spearmencorrelation方法；P< 0. 05即差异有统 计学意义。生存曲线分析采用Kaplan-Meiermethod及log-ranktest;多变量分析采用 Cox'Sproportionalhazardsmodel;P< 0. 05 即差异有统计学意义。 阳160] 2结果 阳16U 2. 1BART6-化在鼻咽癌中的表达比癌旁对照组织中的表达显著升高
[0162]在40例癌旁鼻咽上皮（Adjacent化ithelialofNPC)中有：34例BART6-化的 表达低化OW)或者基本检测不到（negative),而在115例鼻咽癌（NPC)中57例检测到有 BART6-化的低表达化OW)，其余58例为高表达Oii曲），P<0. 001 (图2和图3)。 阳163] 2. 2BART6-化的表达水平与鼻咽癌转移密切相关性 阳164]我们查询了 115例鼻咽癌患者的临床资料，比如发病年龄、性别、TNM分期等，并 对他们进行了电话随化详细询问了他们的首发时间、治疗情况、有无复发、有无再患其他 疾病、复发及死亡时间等，并登记了生存时间和状态。我们发现在鼻咽癌组织中检测到 BART6-化的表达水平与鼻咽癌患者的远处转移（Distance metastasis)呈负相关关系， 即远处转移组BART6-化的表达水平比原位复发组化ocal relapse)相对较低，（图4， P<0. 0巧。 阳1化]2. 3BART6-化低表达的鼻咽癌患者预后较差
[0166]我们对鼻咽癌组织中BART6-化的表达与病人的生存时间和状态进行的生存分 析，发现鼻咽癌中BART6-化的表达与鼻咽癌患者的预后密切相关，BART6-化高表达化i曲） 的患者生存时间要明显长于BART6-化低表达化OW)的患者（图5)。 阳167] 2. 4BART6-化在胃癌中的表达比癌旁对照组织中的表达显著升高 阳16引在37例胃癌组织中29例检测到有BART6-化的低表达化OW)，另外8例为高表达Oii曲），而在运些胃癌样本对应的癌旁组织中有35例BART6-化的表达低化OW)或者基本 检测不到（negative)，仅2例为BART6-化阳性，P<0. 05 (图6)。
[0169] 2. 5BART6-化低表达的胃癌患者预后较差
[0170] 我们对胃癌组织中BART6-化的表达与病人的生存时间和状态进行的生存分析， 发现胃癌中BART6-化的表达与胃癌患者的预后密切相关，BART6-化高表达化i曲）的患者 生存时间要明显长于BART6-化低表达化0W)的患者（图7)。 阳171]实施例3,