瘤 体积（V)，V= 4 3i/3*(L/2*W/2*H/2)。根据肿瘤大小绘制移植瘤生长曲线。35天后处死裸 鼠，取出移植瘤组织用10%的甲醒固定。 阳巧引2.结果 阳巧4] 2. 1裸鼠"尾静脉注射-肺转移"模型进一步证实转染BART6-化或特异性针对 L0C553103的RNA干扰序列后，肿瘤细胞转移能力降低 阳巧5] 在鼻咽癌细胞5-8F中转染BART6-化或特异性针对LO巧53103的RNA干扰序 列后，与转染阴性对照（Scramble序列，NC)相比，在裸鼠"尾静脉注射-肺转移"模型中BART6-化W及LO巧53103两组裸鼠肺脏中转移瘤的数目明显减少（图17和图18)，表明过 表达BART6-化或抑制LO巧53103的表达确实可W抑制肿瘤细胞的侵袭转移。 阳巧6] 2. 2裸鼠皮下移植瘤模型进一步证实转染BART6-化或特异性针对LO巧53103的 RNA干扰序列后肿瘤细胞增殖速度减慢 阳巧7] 在鼻咽癌细胞5-8F中转染BART6-化或特异性针对LO巧53103的RNA干扰序列 后，与转染阴性对照（Scramble序列，NC)相比，BART6-化W及LO巧53103两组裸鼠皮下移 植瘤的生长增殖速度明显减慢（图19,图20)。 阳巧引实施例7,表达BART6-化或用RNA干扰法抑制肿瘤细胞中LO巧53103的表达可W改变肿瘤细胞中细胞骨架的完整性
[0259] 1.材料方法
[0260] 1. 1细胞培养与转染 阳261] 鼻咽癌细胞系5-8F购自中南大学细胞中屯、，细胞培养所用RPMI1640培基和胎牛 血清，及消化细胞所用的膜蛋白酶均为美国G化CO公司产品。 阳％2] 在5-8F细胞中过表达BART6-化的方法同实施例3; 阳％3] 在5-8F细胞中转染特异性针对L0巧53103的RNA干扰序列W抑制细胞内 L0C553103表达的方法同实施例5。
[0264] 1. 2免疫巧光实验 阳2化]1)细胞接种：将消毒好的盖玻片（75%消毒酒精浸泡2小时，并在紫外照射1小 时）置于六孔板的孔内，将过表达BART6-化或转染特异性针对L0巧53103的RNA干扰序列 的5-8F细胞W及阴性对照细胞（转染Scramble序列）分别加到六孔板中的盖玻片上，后 置于细胞培养箱培养24小时；取出细胞培养板，37°C预热的PBS溫和地摇洗3次；自然风 干； 阳％6] 2) 37 °C预热的4 %多聚甲醒在37 °C固定15min，预热的PBS溫和摇洗3次，每次 5min； 阳267] 3)将FITC-phalloidin(购自Sigma公司，用于标记F-actin) 1:500 稀释，37°C解 育50min，预热的PBS洗S次； 悦68] 4)DAPI染色5min，预热的PBS清洗3次；
[0269] 5)清水洗3次去掉PBS，惊干封片，激光共聚焦显微镜下观察拍照。 阳270] 2.结果 阳27U 免疫巧光结果显示FITC标记的F-actin(细胞骨架）呈绿色，分布在胞浆内，DAPI 标记的核酸呈蓝色，分布在细胞核内。对照组细胞形状规则，细胞骨架清晰明亮，含量丰富， 呈纤维放射状沿细胞长轴排列，应力纤维层次清晰，胞核被染成深蓝色；BART6-化组（图 21)及LO巧53103干扰组（图22)细胞骨架解聚，细胞微丝变短，排列稀疏，应力纤维数目明 显减少变细，细胞核暗淡无光，细胞皱缩变圆，细胞核暗淡无光，细胞间的桥梁状骨架连接 纤维减少或消失，提示过表达BART6-化或干扰L0巧53103的表达后细胞骨架组装受到了明 显抑制，并影响了肿瘤细胞的生长、增殖W及侵袭转移能力。 阳272]实施例8,实时巧光定量PCR法检测证实L0巧53103在鼻咽癌和胃癌中表达下调阳273] 1.材料与方法：
[0274] 收集5例正常鼻咽上皮组织和18例鼻咽癌组织W及18对胃癌组织及相应的癌旁 对照组织用Trizol(invitrogen公司产品）抽提总RNA，2ygRNA用逆转录试剂盒（Qiagen公司产品）逆转录成cDNA后，用如antiTectSYBRGreenPCR试剂盒（Qiagen公司产品） 进行实时巧光定量PCR检测L0巧53103及内参基因GAPDH的表达。PCR引物及扩增方法同 实施例4。 阳275] 反应结束后确认实时巧光定量PCR的扩增曲线和烙解曲线，各基因的表达强度根 据CT值（t虹esholdcyclevalues)、内参基因（GAPDH)标化后，义用groupt-test检验计 算P值。
[0276] 2.结果 阳277] L0C553103在正常鼻咽上皮（图23)或胃癌癌旁对照组织中表达较高（图24)，而 在鼻咽癌组织（图23)或胃癌组织（图24)中表达较低。
[0278]实施例9,原位杂交检测发现L0巧53103在鼻咽癌和胃癌中的表达与患者预后相 关 悦79] 1.材料方法 阳280] 1. 1设计并合成杂交探针 阳281] 为了采用原位杂交方法检测L0巧53103的表达情况，我们设计了针对原位杂交检 测L0巧53103表达的寡核巧酸探针及阳性对照（GAPDH)原位杂交寡核巧酸探针。 阳282] L0C553103 探针序列-1 :5' -CAGAAAAUAAAGUCACAGAGCUCCUGGAAC-3' 阳283] L0C553103 探针序列-2 :5' -ACUGUUUCCUCUCUGCCUUGAUUGAAAUUC-3' 阳284] L0C553103 探针序列-3 :5' -ACACUUUGAAAUUUUUGUCACCUCCCUUGA-3' 阳285]阳性对照探针（检测看家基因GAPDH): 阳286] GAP畑探针序列-1 :5' -CCACUUUACCAGAGUUAAAAGCAGCCCUGG-3, 阳287] GAP畑探针序列-2 :5' -CAGUAGAGGCAGGGAUGAUGUUCUGGAGAG-3, 阳288] GAP畑探针序列-3 :5' -GUCAGAGGAGACCACCUGGUGCUCAGUGUA-3, 阳289] 采用化学合成方法合成上述设计的各基因特异性寡核巧酸探针序列，合成过程中 探针序列中尿喀晚已标记生物素化io-U)。 阳290] 1. 2寡核巧酸探针标记试剂盒和原位杂交检测方法、结果判定及统计方法等同实 施例2 阳291] 2结果 阳292] 2. 1L0C553103在鼻咽癌中的表达比癌旁对照组织中的表达显著降低 阳293]在40例癌旁鼻咽上皮（AdjacentEpithelialofNPC)中有36例L0C553103的表 达较高（图25左），而在115例鼻咽癌（NPC)中57例L0巧53103的表达较低（图25右） P<0. 001。L0C553103的表达与BART6-化呈显著负相关。 阳294] 2.化0C553103表达高的鼻咽癌患者预后较差 阳295] 我们对鼻咽癌组织中L0巧53103的表达与病人的生存时间和状态进行的生存 分析，发现鼻咽癌中LO巧53103的表达与鼻咽癌患者的预后密切相关，L0C553103低表达 (Low)的患者生存时间要明显长于LO巧53103高表达Oii曲）的患者（图26,P= 0. 03)。 阳296] 2.化0C553103在胃癌中的表达比癌旁对照组织中的表达显著降低 阳297] 在37例胃癌组织中29例检测到有L0巧53103的低表达（图27右），其余8例为 高表达，而在运些胃癌样本对应的癌旁组织中有35例L0巧53103的表达较高（图27左）， P<0.05。 阳29引 2.化0C553103高表达的胃癌患者预后较差 阳299] 我们对胃癌组织中L0巧53103的表达与病人的生存时间和状态进行的生存分析， 发现胃癌中L0巧53103的表达与胃癌患者的预后密切相关，L0C553103高表达（化曲）的患 者生存时间要明显短于L0巧53103低表达化OW)的患者（图28,P<0. 05)。
【主权项】
1.长链非编码RNA基因L0C553103的应用，其特征在于，L0C553103用于制备监测胃癌 复发转移和预后预测的制剂；胃癌组织中L0C553103的表达水平与胃癌的复发转移呈正相 关关系；该基因在NCBI中的序列号：NR_110997。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的监测胃癌复发转移和预后预测的 制剂为实时荧光定量PCR检测制剂或原位杂交检测制剂。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的实时荧光定量PCR检测制剂包括： L0C553103正向引物：5' -ACAGTAGTGCGATCAAGGCT-3'； L0C553103反向引物：5' -TCACCACCTCCCTGITCTTC-3'。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的实时荧光定量PCR检测制剂还包 括：内参基因GAPDH特异性PCR引物： 正向引物5 ' -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 ' 反向引物5 ' -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的原位杂交检测制剂包括： L0C553103探针序列-1 :5' -CAGAAAAUAAAGUCACAGAGCUCCUGGAAC-3' L0C553103探针序列-2 :5' -ACUGUUUCCUCUCUGCCUUGAUUGAAAUUC-3' L0C553103探针序列-3 :5' -ACACUUUGAAAUUUUUGUCACCUCCCUUGA-3'。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的原位杂交检测制剂还包括：阳性对 照探针： GAPDH探针序列-1 :5' -CCACUUUACCAGAGUUAAAAGCAGCCCUGG-3， GAPDH探针序列-2 :5' -CAGUAGAGGCAGGGAUGAUGUUCUGGAGAG-3， GAPDH探针序列-3 :5' -GUCAGAGGAGACCACCUGGUGCUCAGUGUA-3'。7. 根据权利要求2或5或6所述的应用，其特征在于，所述的原位杂交检测试剂为试剂 盒。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，试剂盒还包括： 地高辛寡核苷酸加尾试剂、抗地高辛-辣根过氧化物酶复合物检测试剂、DAB染色试 剂； 其它常规生物化学试剂，包括20xSSC，硫酸葡聚糖，去离子甲酰胺，多聚腺苷酸，多聚 脱氧腺苷酸，变性剪切的鲑精DNA，酵母转运RNA，二硫苏糖醇，50xDenhardts'ssolution， PBSbuffer，胃蛋白酶K，牛血清白蛋白，三乙醇胺，醋酸酐， 丁陬缓冲液卬117.5的0.1]\11^18-(：1+0.1511恥(：1+0.5%阻断试剂； TNT缓冲液：pH7. 5的0? IM Tris-Cl+0. 15M NaCl+0. 05% Tween 20〇9.用于制备监测胃癌复发转移和预后预测制剂的实时荧光定量PCR检测制剂的引物， 包括： L0C553103正向引物：5' -ACAGTAGTGCGATCAAGGCT-3'； L0C553103反向引物：5' -TCACCACCTCCCTGITCTTC-3'。10. 用于制备监测胃癌复发转移和预后预测的制剂的原位杂交检测试剂的原位杂交探 针，序列如下： L0C553103探针序列-1 :5' -CAGAAAAUAAAGUCACAGAGCUCCUGGAAC-3' L0C553103探针序列-2 :5' -ACUGUUUCCUCUCUGCCUUGAUUGAAAUUC-3'
【专利摘要】本发明公开了一个长链非编码RNA基因LOC553103的应用。基因LOC553103用于制备监测胃癌复发转移和预后预测的制剂；胃癌组织中基因LOC553103的表达水平与胃癌的复发和转移呈正相关关系；该基因在NCBI中的序列号：NR_110997。LOC553103表达高的患者生存时间更短，提示LOC553103可作为胃癌复发和转移的预测分子标志。本发明为胃癌的辅助诊断和预后预测提供了强有力的分子生物学工具，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105200156
【申请号】CN201510727895
【发明人】李桂源, 曾朝阳, 熊炜, 石磊, 李夏雨, 李小玲, 张文玲, 龚朝建, 何宝玉, 孛昊, 周鸣, 唐珂
【申请人】中南大学
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年10月30日