一种辅助检测肉乳兼用牛胴体组成性状的方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明提供一种辅助检测肉乳兼用牛禍体组成性状的方法，同时还提供了其专用 试剂盒，用于牛PSAP基因作为辅助选择标记的筛查体系和条件，属于检测试剂盒领域。
【背景技术】
[0002] 中国西口塔尔牛是我国于20世纪五十年代引进后自主培育的大型肉乳兼用品 种，W其独特的生产性能和良好的肉用特点在中国平原、草原、山区等地区被广泛推广，并 表现出其作为新的肉乳兼用型牛品种的巨大优势和发展潜力，成为国内饲养最多，范围最 广的兼用牛品种，是目前我国肉牛产业化生产中的主导品种。随着人们生活水平的提高，对 牛的产肉性能的要求越来越高，对优质高档牛肉的需求也越来越大，因此优质牛肉带来的 可观经济效益决定了肉牛育种中肉质性状选择的重要性。禍体性状作为由微效多基因控制 的数量性状，由于无法活体测定而且受到传统育种方法的限制，因此从基因水平，利用新分 子遗传标记筛查应用对肉乳兼用牛禍体组成性状进行研究成为主要技术手段，实现对优良 种牛选育和改良目的。
[0003] 銷脂激活蛋白原（prosaposin，PSA巧基因含有15个外显子，编码4个W串联形式 排列，处于同一通读框中的4种銷脂激活蛋白：saposinA、saposinB、saposinC、saposinD。 在小鼠、大鼠和人中均存在=种PSAPmRNA的剪接本：不含外显子8、含化p的外显子8和 含9bP完整的外显子8。而牛的机体中仅存在两种PSAPmRNA的剪接本：不含外显子8和 含完整外显子8。PSAP基因的选择性剪接具有组织特异性，不同形式的剪接体存在于不同 的组织中。PSAP蛋白通过水解酶加工形成四种saposin蛋白，后者主要作用于溶酶体区室， 促进銷脂的分解代谢。另外在神经W及其它质膜上也有分布，细胞质膜上的銷脂分解产生 亲脂性中间体，中间体参与把细胞外信号传入细胞内的调控过程。PSAP蛋白在生命活动中 发挥重要功能，因此PSAP基因的遗传标记可能作为肉牛育肥前筛选优良禍体组成性状的 分子标记。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一种辅助检测肉乳兼用牛禍体组成性状的方法及试剂盒，解决当前 对肉牛禍体性状和肉质性状相关的重要分子遗传标记筛查的难题。
[0005] 本发明所述的一种辅助检测肉乳兼用牛禍体组成性状的方法，解决方案如下： W中国西口塔尔牛PSAP基因特异性SNP位点设计一对引物，进行严格的PCR反应体系 进行样品的PCR扩增和电泳，并根据测序结果筛查出SNPs遗传标记，进行单倍型分析，判定 出阳性个体。
[0006] 本发明所述的一种辅助检测肉乳兼用牛禍体组成性状的的方法，其特征在于中国 西口塔尔牛特异性SNPs位点为： 如核巧酸序列如序列表SeqIDNO. 1所示，在序列表SeqIDNO. 1第132bp处的SNP位点G〉A(rs42143937)，第 229bp处的SNP位点C〉T(rs381104888)，第:Mlbp处的 C〉T (rs385887193)，第380bp处的SNP位点C〉T (rs209315330)，第480 bp处的SNP位点C〉T(rs432651539)，第486 bp处的SNP位点C〉G(rsl3：M41330)。
[0007] 本发明所述的一种辅助检测肉乳兼用牛禍体组成性状的的方法，其特征在于中国 西口塔尔牛PSAP基因的特异性引物为： 正向引物F:5'-TTACTGCGAGGTGTGCGAGTT-3'; 反向引物R:5' -CCTCGGCATCACACGGACT-3'。
[0008] 本发明还公开了一种牛禍体和肉质性状选择的的分子检测试剂盒，本试剂盒包括 上述一对特异性引物和PCR扩增引物及与牛禍体性状高度相关的单倍型判定标准。
[0009] 本发明的积极效果在于：可用于种用肉牛早期选择，进行针对乳肉兼用牛禍体性 状的遗传标记筛选。只需要采集少量牛血液或组织(尾部亦可)，进行基因组DNA提取，使用 该分子检测试剂盒检测，测序后可鉴定肉牛样本群体中禍体和肉质性状的SNPs遗传标记， 进行单倍型分析后，PSAP基因功能作用区域的6个SNPs位点及其单倍型组合可W作为一 种辅助检测肉乳兼用牛禍体性状的有效分子遗传标记。PSAP基因引物片段及SNPs位点单 倍型组合Hap2和Hap6能够作为检测和预示乳肉兼用牛禍体组成性状的专用试剂盒。可W 作为肉乳兼用牛种质资源创制中优良个体的早期选择和产业化生产中入栏前育肥牛的筛 查和生产。
【附图说明】
[0010] 图1为中国西口塔尔牛PSAP基因引物对PCR扩增产物电泳图； 图2为本中国西口塔尔牛资源群体测序获得的PSAP基因SNPs。
【具体实施方式】
[0011] 通过W下实施例进一步举例描述本发明，并不W任何方式限制本发明，在不背离 本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改 动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。
[001引 实施例1 中国西口塔尔牛PSAP基因片段的获得及功能区域多态性检测方法的建立。
[0013] 1. 1试验材料：380头28月龄中国西n塔尔牛公牛来自内蒙古通迂市宝龙山肉牛 育肥场。颈静脉采血，所采血样均为10mL/头，用ACD抗凝剂抗凝，-20°c冻存。用血液基 因组DNA提取试剂盒(天根生化公司）从血样中提取基因组DNA。
[0014] 1.2弓I物设计及PCR扩增：选择中国西口塔尔牛为试验材料，为了尽可能多的检 巧。SNPs位点，选取SNP密度较高的片段，根据选取的牛PSAP基因序列设计W下引物对： P正向引物F: 5'-TTACTGCGAGGTGTGCGAGTT-3'， P反向引物R:5' -CCTCGGCATCACACGGACT-3'; 用上述引物对在中国西口塔尔牛基因组中进行PCR扩增。PCR扩增反应为50iiL体系， 包括：上、下游引物（10ymol/L)lyL;Mix(天根）25yL;DNA模板（50ng/yL)2 化； 超纯水21yL。PCR扩增反应程序：94°C变性5min;94°C变性30S，63°C退火30s，72°C 延伸40S，进行30个循环；最后72°C延伸10min。
[0015]PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后获得目的基因片段，长度为683bp(图1 示)。凝胶回收、纯化目的片段进行测序和序列比对分析。PSAP基因共包含6个SNPs位点：I10-65G〉A、I10-162OT、I10-274OT、I10-313OT、E11-870T、E