猪流行性腹泻病毒重组猪霍乱沙门氏菌基因工程活疫苗及制备与应用的制作方法

专利名称：猪流行性腹泻病毒重组猪霍乱沙门氏菌基因工程活疫苗及制备与应用的制作方法
猪流行性腹泻病毒重组猪霍乱沙门氏菌基因工程活疫苗及制备与应用技术领域
本发明属于动物细菌基因工程技术领域，具体涉及两种不含抗性标记的分别表达猪流行性腹泻病毒保护性抗原基因-COE基因和SD基因的重组的猪霍乱沙门氏菌活疫苗菌株的构建及应用。
背景技术：
沙门氏菌(Salmonellu)是一种胞内寄生的革兰氏阴性肠道杆菌，具有侵袭性，最常见的沙门氏菌属有鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌和肠炎沙门氏菌等。沙门氏菌对人和动物均有较强的致病力，可引起人体和动物的胃肠道疾病，沙门氏菌在外界环境中的生存能力较强，在利用基因工程的方法致弱以后，仍具有较强的侵袭力。
最初预防沙门氏菌的疫苗是全菌灭活苗，但该疫苗只能激发机体的体液免疫，且易引起副作用，另外，还存在着需免疫多次和无交叉保护的缺点，因而不能广泛应用。此后， 研究学者模拟沙门氏菌肠道自然感染的方式，给动物口服减毒的沙门氏菌(如肠炎沙门氏菌Ty21a的口服弱毒苗)，结果发现，可诱导机体产生更好的体液免疫和细胞免疫，因此受到很多研究学者的普遍重视(Gernianier R et al. ,1975)。
由于肠炎伤寒沙门氏菌Ty21a致弱的遗传背景不清晰，各国研究学者，尝试运用基因工程的方法，研究遗传背景清晰的伤寒弱毒基因缺失疫苗株，用于口服免疫研究，例如，aro 基因缺失株(Dougan G et al.，1988)、cya/crp 缺失株(Alper M D et al. ,1978)、 Dam和 phoP/phoQ缺失株(Galan J E et al. , 1989)、asd基因缺失株(徐引弟等,2006)等。
弱毒沙门氏菌除本身可以作为疫苗以外，也可被用作载体来表达外源抗原基因， 近年来，以弱毒沙门氏菌为载体表达肿瘤、病毒、细菌和寄生虫等的外源抗原，研制多价基因工程疫苗成为该领域的研究热点，从而为研制新型基因工程疫苗开辟了新的途径(Zhao Z et al. ,2008)。
近年来，弱毒沙门氏菌为载体的基因工程疫苗成为研究的热点，其优越性主要表现在(徐引弟博士论文，2006)
(I)抗原递呈的有效性，尤其是口服或滴鼻免疫时，效果更佳(Dietrich et al.， 1998)；
(2)可产生特异性细胞毒性T细胞杀伤反应(CTL效应);
(3)可以激发黏膜和系统免疫反应。以弱毒沙门氏菌为载体的疫苗经口服或滴鼻的方式免疫后，可以直接将外源抗原运载至机体的黏膜相关淋巴组织(MALT)，从而激发机体的黏膜和系统免疫反应(Spreng et al.，2006)；
(4)具有免疫佐剂作用。沙门氏菌的LPS是一种内在佐剂，此外，有研究表明，沙门氏菌内部有一个非甲基化的CpG DNA序列，具有较强的免疫刺激活性，可以促进机体内部 Th型为主的免疫应答，因而，被认为是具有应用潜力的免疫增强剂和免疫佐剂(Paglia et al.，1998)；
(5)免疫具有持续性。减毒沙门氏菌载体所携带的质粒不易丢失，且可长期稳定地存在于机体淋巴组织内，从而不需反复多次地加强免疫也可长期地激发机体的免疫应答反
(6)联合免疫作用。减毒沙门氏菌本身所携带的抗原与质粒表达的外源抗原起到了联合免疫的作用，同时，还可以将2个或2个以上的外源抗原基因插入到表达质粒中，免疫宿主后可针对不同的外源抗原产生相应的免疫反应，从而达到一次免疫防治多种疾病的疗效；
(7)所表达的抗原蛋白不需提纯。以减毒沙门氏菌为载体的疫苗，只需过夜培养即可直接免疫，从而省去了诱导剂诱导与纯化蛋白的步骤，制备过程简单、省时，且易于储存运输，因此，可显著降低疫苗制作成本；
(8)接种方式简便，易于操作，适于群体免疫，且安全性好。
猪霍乱沙门氏菌C500弱毒株是在含醋酸铊的培养基中，连续传代500次致弱的菌株，其具有良好免疫原性，实践也证明了 C500株具有良好的免疫原性，且能激活全身、局部和粘膜免疫系统，具有副作用低、安全性好的特点。其中，最常用的是沙门氏菌Asd-平衡致死系统(Galan J E，et al. 1990)。华中农业大学农业微生物学国家重点实验室徐引弟博士构建了 C500株的asd基因缺失株Aasd C500，经实验证实Aasd C500缺失株的免疫原性，与C500菌株相比，毒力更低，安全性更好(徐引弟等，2006)，且已应用于重组活疫苗的制备，如申请人所在农业微生物国家重点实验室构建了猪传染性胃肠炎的重组沙门氏菌活疫苗，经临床验证，该疫苗具有较好的免疫预防效果，且已申请了中国发明专利(专利申请号为 2009100639279)。
猪流行性腹泻(PED)由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起，一种高度接触性的急性传染病，猪感染PEDV以后，常引起仔猪的急性肠炎及致命性水泻直至脱水死亡，其临床特征主要表现在仔猪呕吐、严重腹泻和脱水；PEDV感染猪，剖检病理变化主要表现为猪的空肠和回肠部分的肠绒毛的萎缩和脱落(Pensaert and Yeo，2006)。PED对猪的危害很大，各种年龄的猪均可发病，但对哺乳仔猪的危害最为严重，2 0日龄以内仔猪死亡率达95%以上 (Timoney J F et al. , 1988),给养猪业带来重大经济损失。
目前，PED在世界范围内广泛流行。在欧洲各国，PED较以前的流行程度已明显降低，但是在亚洲猪场中PEDV的感染率非常高，尤其是在韩国、日本和中国等，从致病机理和临床症状上来看，PEDV与TGEV极为相似，且由于其感染率明显高于TGEV和猪轮状病毒 (PoRV),给养猪业造成了巨大的损失(Cavanagh D et al. , 1997)。
PEDV属于冠状病毒科、冠状病毒属。PED首次发现并报道是在1971年的英国 (Oldham, 1972)。自此以后，该病在欧洲和亚洲大规模发生报道(Puranaveja et al., 2009)，自1976年开始，我国相继报道了 PED的发生，现在PED已成为世界范围内流行的重要的猪病毒性腹泻病之一。1978年，引起该病的病原体-PEDV，在英国和比利时首次得到鉴定(Chasey et al. ,1978),且在1991年国际病毒分类委员会(ICTV)的第五次报告被列为冠状病毒属的可能成员，直到1995年的第六次报告才被列为冠状病毒属的正式成员。
PEDV粒子形态特征与冠状病毒科其它成员的很相似(Chasey et al.，1978)，纤突糖蛋白(S蛋白)、I吴糖蛋白(M蛋白)和包I吴糖蛋白(E蛋白)分布于病毒粒子的表面；核衣壳蛋白(N蛋白)位于病毒粒子内部，PEDV的核衣壳结构是由N蛋白与基因组RNA相互作用而形成的，这使得PEDV与传染性胃肠炎病毒在形态学上很难区别(Pensaert et al.， 1986)。目前为止，研究发现PEDV只存在一个血清型(Witte et al.，1981)。
PEDV S蛋白在介导感染宿主产生中和抗体的过程中发挥重要作用，近年来，国内外研究人员先后对PEDV S基因进行了的研究。2002年Chang等据TGEV S基因的中和表位序列，推测出了 PEDV S基因的一个抗原表位区(499 638aa)，并命名为C0E，经试验证实，该基因具有较好的免疫原性，且也已作为靶基因，应用到转基因植物疫苗和基因工程疫苗的制备之中(Nguyen et al.，2009 ;葛俊伟等，2010)。PEDV是以体液免疫为主的病毒， 因而，B细胞抗原表位在抗PEDV感染中具有重要的意义，Sun等人(2008)通过实验鉴定得知 SI 亚基的 SlD(636-789aa)区中所包含的 S1D5 (744_759aa)和 S1D6 (756_771aa)，可能为 PEDV的两个B细胞表位(Sun D B et al.，2008)，另外SlD区还包括了一个免疫原性较好的高亲和力表位序列SlP3(697-742aa)。
国内外常用的预防PED发生的方法是，将PEDV感染猪的粪便或发病仔猪的肠内容物，人工感染妊娠母猪，刺激产生母源抗体，仔猪吮乳后，获得保护，降低死亡率和缩短PED 流行时间。
与大多数病毒性疾病相同，对PED的防控，主要是以疫苗免疫预防为主。目前，PED 商业化的疫苗主要是灭活苗和弱毒苗两种，两种疫苗在使用后，虽然在一定程度上可以预防PED的发生，但效果不理想。推测其原因为PEDV主要经肠道感染猪，局部肠黏膜免疫系统在抗PEDV感染的免疫过程中发挥了重要的作用(Pospischil A et al.，2002)，因而刺激肠道黏膜产生的特异性slgA，成为防制本病发生和研制PED疫苗关键的问题。然而，现有的商业化灭活苗和弱毒苗在免疫后，只能诱导体液免疫应答，不能激活黏膜免疫系统，即使有较高的血清抗体滴度，仍不能阻止病原经黏膜入侵体内，因而免疫效果不佳。目前，虽已有 PED转基因植物疫苗和基因工程活疫苗的相关研究，但只是处于实验研究阶段，还未实现商业化，因此，开发更加安全、高效、廉价的新型疫苗是世界养猪业的迫切需要。
鉴于减毒沙门氏菌作为疫苗载体具有运送效率高，免疫方法简单，免疫效果较好， 能同时激发全身免疫和局部粘膜免疫等优点，有着良好的应用前景。重组沙门氏菌疫苗的传统构建方法存在很多缺陷，如以前所采用的携带抗性基因的表达质粒，因其所存在的生物安全问题，而不被人们所接受。本研究所使用的猪霍乱沙门氏菌C500asd质粒-载体平衡致死系统具有无抗性标记的优点，此外，还具有免疫原性好、表达量高、外源基因表达稳定和不需纯化等优点，因而，将其开发为表达猪流行性腹泻病毒主要抗原基因的重组活疫苗具有广阔的应用前景。发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，其第一个目的是获得表达猪流行性腹泻病毒保护性抗原蛋白基因-COE基因和SD蛋白基因的重组猪霍乱沙门氏菌株。
本发明的第二个目的是利用上述的重组菌获得一种猪霍乱沙门氏菌和猪流行性腹泻病毒二价基因工程疫苗。
本发明的第三个目的是上述重组菌在制备猪霍乱沙门氏菌和猪流行性腹泻病毒二价基因工程疫苗中的应用。
本发明通过以下技术方案实现
申请人通过基因工程的方法，获得了表达猪流行性腹泻病毒保护性抗原基因-COE 基因和SD基因的重组的猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis) -C501-C0E和 C501-SD，该两菌株已于2011年8月22日送交位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型微生物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号分别为CCTCCNO M2011296 ；CCTCC NO :M2011297。
两个重组的猪霍乱沙门氏菌C501-C0E和C501-SD的制备方法，主要包括下列步骤
I)原核表达质粒pET-32a_C0E和pET_32a_SD的构建从患猪流行性腹泻病 (Porcine epidemic diarrhea, PED)的病猪粪便病料中，扩增猪流行性腹 写病毒COE基因和SD基因，并分别将其亚克隆至原核表达载体pET-32a，构建原核表达质粒pET-32a_C0E和 pET-32a-SD ；
2)重组质粒pYA-COE和pYA_SD的构建将构建正确的原核表达质粒进行双酶切， 并与经过相同双酶切的穿梭质粒PYA3493进行连接，转化Asd-的大肠杆菌x6097，筛选阳性克隆；
3)重组的猪霍乱沙门氏菌C501-C0E和C501-SD的构建将重组质粒pYA_C0E和 ρΥΑ-SD电转化至猪霍乱沙门氏菌C500 Δ crp Δ asd缺失株中，得到保藏编号分别为CCTCC NO M2011296 ；CCTCC NO M2011297 的重组的猪霍乱沙门氏菌 C501-C0E 和 C501-SD。
申请人获得两种猪流行性腹泻病毒主要抗原位点的基因片段COE基因、SD基因， 它们的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :3所示(其制备方法见实施例所示)O
申请人利用所述的重组的猪霍乱沙门氏菌C501-C0E菌液、重组的猪霍乱沙门氏菌C501-SD菌液与明胶保护剂按照适当体积比(见实施例)成功制备一种防治猪霍乱沙门氏菌和猪流行性腹泻的二价基因工程疫苗。
上述的不含抗性标记的表达猪流行性腹泻病毒主要抗原位点的重组猪霍乱沙门氏菌株缺失了沙门氏菌株基因组中必需的细胞壁形成相关基因asd基因(需要含asd基因的质粒存在于菌体内或外源添加DAP的培养基上才能正常生长、繁殖)，同时这两株重组菌株分别含有外源质粒PYA-COE和pYA-SD (均含有asd基因)，这两株重组菌株均保留了亲本菌株C500作为猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株的免疫特性。质粒pYA-COE和pYA-SD均能在该菌株中表达asd基因，且两者能分别表达猪流行性腹泻病毒S蛋白中的COE抗原位点和SD 抗原位点基因。其中，asd基因表达产物提供沙门氏菌株必需的细胞壁形成相关成份。COE 抗原位点和SD抗原位点基因表达产物提供良好的针对猪流行性腹泻病毒的免疫原性。
本发明的不含抗性标记的表达猪流行性腹泻病毒主要抗原位点的重组猪霍乱沙门氏菌株C501-C0E和C501-SD，这两株基因工程菌株均衍生于在中国已经使用了 50年以上的商品化猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株C500。所述的本发明的重组猪霍乱沙门氏菌株 C501-C0E和C501-SD，缺失了 C500菌株基因组中的asd基因，同时添加了含有猪流行性腹泻病毒S蛋白中的COE抗原位点和SD抗原位点基因的质粒pYA-COE和ρΥΑ-SD。由于需要 pYA-COE和pYA-SD的存在重组菌株才能存活，因此大大提高了质粒pYA-COE和ρΥΑ-SD (也就是COE抗原位点和SD抗原位点基因)在重组菌株中的稳定性。COE抗原位点和SD抗原位点基因在重组菌株中的稳定表达，使之具有针对猪传染性胃肠炎病毒很好的免疫保护力。
本发明的基本构建方法是利用本申请人所在的农业微生物国家重点实验室构建好的asd基因缺失的猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株C500 Δ crp Δ asd缺失株(徐引弟等， 2006)构建含有能够原核表达猪流行性腹泻病毒COE和SD基因的质粒pYA-COE和pYA_SD。 将重组质粒分别电转入C500asd基因缺失株中，这样重组质粒与C500asd基因缺失株形成互补，而满足生长需要，进而稳定共存，形成了我们发明的不含抗性标记的能表达猪流行性腹泻病毒保护性抗原的重组菌株C501-C0E和C501-SD。通过大量的生物学实验数据证明本发明制备的重组菌株可用于制备针对猪霍乱沙门氏菌和猪流行性腹泻的二价基因工程疫苗。
本发明的主要优点是
1、本发明的重组菌株表达的猪传染性胃肠炎病毒S蛋白中的A、D抗原位点和N蛋白中的N321抗原位点是猪传染性胃肠炎病毒重要的免疫原性基因片段，本发明的重组菌株表达的猪流行性腹泻病毒保护性抗原基因-COE基因和SD基因是猪流行性腹泻病毒重要的免疫原性基因片段，均具有良好的免疫保护性。由于猪传染性胃肠炎病毒和猪、流行性腹泻病毒危害日益严重，而目前市场上各种商品化猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻疫苗(主要是佐剂灭活苗和弱毒苗)免疫效果普遍较差。因此，用该基因工程菌株制成的疫苗具有广阔的市场应用前景。
2、本发明的重组菌株衍生于在中国已经使用了 50年以上的商品化猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株C500，完全保留了 C500针对猪霍乱沙门氏菌的免疫效力。而且，该重组菌株毒力比C500稍弱，具有更好的生物安全性。
3、本发明的重组菌株可以同时提供针对猪霍乱沙门氏菌、传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻三种病原的保护力。
4、本发明所研制的疫苗，与现有的灭活苗和弱毒苗相比，具有制备过程简单、省时，且易于储存运输的特点，显著降低了疫苗的制作成本。
5、本发明的重组菌株不含抗性标记，完全符合疫苗 生物安全性要求。
更详细的技术方案见实施例所述。


序列表SEQ ID NO :1是本发明克隆的猪流行性腹泻病毒保护性抗原基因COE的核苷酸片段。
序列表SEQ ID NO 3是本发明克隆的猪流行性腹泻病毒保护性抗原基因SD的核苷酸片段。
图1 :本发明制备的能够原核表达的猪流行性腹泻保护性抗原基因片段构建流程图。
图2 :本发明制备的能够原核表达的COE基因和SD基因的序列比对图。其中，图 2A :能够原核表达的COE基因与其它毒株相应序列的比对；图2B :能够原核表达的SD基因与其它毒株相应序列的比对。
图3 :本发明制备重组沙门氏菌所用穿梭质粒PYA3493的图谱。
图4 :本发明制备重组质粒pYA-COE和pYA_SD的PCR鉴定图片。其中
图 4A pYA-COE PCR 鉴定图片。其中，M DNA Marker (DL2000) ；1~2 pYA-COE ；3 阳性对照；4 :阴性对照；
图 4B pYA-SD PCR 鉴定图片。其中，M DNA Marker (DL2000) ；1~2 pYA-SD ;3 :阳性对照；4 :阴性对照。
图5 :本发明制备重组质粒pYA-COE和pYA-SD的酶切鉴定结果电泳图。其中， Ml DNA Marker(DL2000) ；M2 DNA marker (DL15000) ；1 pYA3493/EcoR I ；2 :pYA_C0E/ EcoRI+Hindlll ；3 pYA-SD/EcoRI+Sal I。
图6 :本发明制备的重组菌C501-C0E和C501-SD的构建流程图。
图7 :本发明制备的重组菌C501-C0E和C501-SD的PCR鉴定图。其中，
图7A :重组菌 C501-C0E PCR 鉴定图片。其中，M DNA Marker (DL2000) ； 1-2 C501-C0E ；3 :阳性对照；
4:阴性对照；
图7B :重组菌 C501-SD PCR 鉴定图片。其中，M :DNA Marker(DL2000) ；1~2 C501-SD ；3 :阳性对照；
4:阴性对照。
图8 :本发明制备的重组菌株C501-C0E和C501-SD中沙门氏菌invA基因的扩增图片。其中，
M DNA Marker (DL2000) ；1 :阳性对照；2 :C501_C0E 中 invA 基因扩增；3 :501_SD 中invA基因扩增。
图9 :利用Western blotting方法检测本发明制备的重组菌C501-C0E和C501-SD 中蛋白的分泌表达。其中
图9A:含有COE蛋白在重组菌C501-C0E中的分泌表达。其中，M :Prestained Protein Ladder ；
图9B :含有SD蛋白在重组菌C501-SD中的分泌表达。其中，M :Prestained Prote in Ladder。
图10 :利用间接免疫荧光实验检测本发明制备的重组菌C501-C0E和C501-SD中表达蛋白在细菌中的定位。其中，图10A C501-C0E ;图10B :C501_SD ;图10C :C501_pYA。
图11 :本发明制备的重组菌C501-C0E和C501-SD的生长曲线图。
图12 :本发明制备的重组菌C501-C0E和C501-SD的遗传稳定性实验结果。其中
图12A :重组菌C501-C0E的遗传稳定性鉴定结果。其中，M DNA Marker (DL2000)； 1-6 :分别为重组菌C501-C0E传代50次、40次、30次、20次、10次和第I代的PCR鉴定结果;
图12B :重组菌C501-SD的遗传稳定性鉴定结果。其中，M DNA Marker (DL2000)； 1-6 :分别为重组菌C501-SD第I代及传代20次、30次、40次和50次后的PCR鉴定结果。
图13 :本发明制备的重组菌C501-C0E和C501-SD在免疫BalB/C小鼠后针对外源抗原的的黏膜slgA抗体水平。其中
图13A :重组菌C501-C0E免疫小鼠后的抗COE蛋白的黏膜slgA抗体水平；
图13B :重组菌C501-SD免疫小鼠后的抗SD蛋白的黏膜slgA抗体水平。
图14 :本发明制备的重组菌C501-C0E和C501-SD在免疫BalB/C小鼠后针对外源抗原的血清IgG抗体水平。其中
图14A :重组菌C501-C0E免疫小鼠后的抗COE蛋白的血清IgG抗体水平；
图14B :重组菌C501-SD免疫小鼠后的抗SD蛋白的血清IgG抗体水平。
图15 :本发明制备的重组菌C501-C0E和C501-SD在免疫BalB/C小鼠后针沙门氏菌的抗体水平。其中
图15A :重组菌C501-C0E和C501-SD免疫小鼠后的抗沙门氏菌的血清IgG抗体水平；
图15B :重组菌C501-C0E和C501-SD免疫小鼠后的抗沙门氏菌的黏膜slgA抗体水平。
图16 :本发明制备的重组菌C501-C0E和C501-SD在小鼠体内诱导的IFN- YmRNA 上的差异水平比较。其中；
图16A :重组菌C501-C0E诱导的IFN- y mRNA水平与空质粒对照菌的对照结果；
图16B :重组菌C501-SD诱导的IFN- y mRNA水平与空质粒对照菌的对照结果。
图17 :本发明制备的重组菌C501-C0E和C501-SD在小鼠体内诱导的IFN- Y蛋白表达水平的差异比较。其中
图17A :重组菌C501-C0E诱导的IFN- Y蛋白表达水平与空质粒对照菌的对照结果;
图17B :重组菌C501-SD诱导的IFN-Y蛋白表达水平与空质粒对照菌的对照结果O具体实施方式
以下结合说明书附图对本发明作进一步的说明。
实施例1 :制备能够原核表达的猪流行性腹泻保护性抗原COE和SD蛋白的基因片段
(I)制备原核表达质粒pET-32a_C0E和pET_32a_SD所需的引物设计，其序列如表 I所述。
表I制备原核表达质粒pET-32a_C0E和pET_32a_SD所需的引物序列
引物名称引物序列酶切位点用途EPlGMGAATTmGCATGAkCAGCCAhTnCEcoR I扩增Ρ^ν COE基HP2GGG^6tT7GATAGTATACTTGGTACACACATCCHindIII因(480bp)SDElGACi^mATGACAGACGTTTCTTTTATGACTCEcoR I扩增P0)V SD基090]SDS2GGG^^iMTACTCATACTAAAGTTGGTGGGSal I因(462 bp)
表I中引物的下划线部分为酶切位点。
(2)制备能够原核表达的COE和SD片段
利用张坤报道的猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪A群轮状病毒多重 RT-PCR检测方法(张坤，2010)，检测送检的临床病料。从猪流行性腹泻病毒感染的阳性粪便病料中，提取基因组RNA (采用BioFlux公司的总RNA提取试剂盒，按照该公司提供的试剂盒说明书操作)，然后进行反转录。以反转录所得到的cDNA为模板，分别以表I所示的 EP1/HP2和SDE1/SDS2为引物，PCR扩增带有EcoR I,HindIII酶切位点的PEDV COE基因和带有ECOR1、Sal I酶切位点的SD基因片段，扩增体系如下所述
COE基因片断和SD基因片段的PCR扩增条件95°C预变性4min后，进行如下循环 94°C变性 40s, 58. 1°C退火 45s, 72°C延伸 50s, 30 个循环，最后 72°C IOmin。
扩增完成后，取PCR产物8 μ L，加入IyLlOXLoading Buffer，用O. 8%琼脂糖凝胶进行电泳，EB染色，观察电泳结果。电泳后用BioFlux公司胶回收试剂盒进行目的基因的纯化(按照该试剂盒的说明书操作)。将纯化后的COE基因片段与原核表达载体pET-32a 分别进行EcoR I和HindIII双酶切后跑胶回收，利用T4DNA连接酶连接后转化大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3);将纯化后的SD基因片段与原核表达载体pET-32a分别进行EcoR I和 Sal I双酶切后跑胶回收，利用T4DNA连接酶连接后转化大肠杆菌表达宿主菌BL21 (DE3)。 经PCR、双酶切和测序鉴定，最终得到能够原核表达的猪流行性腹泻COE和SD基因片段。能够原核表达的基因片段的制备流程如图1所示。测序结果与其它毒株序列的比对结果如图 2所示。
实施例2 :重组质粒pYA-COE和pYA_SD的构建与鉴定
将带有EcoR1、HindiII酶切位点的重组质粒pET-32a_C0E和带有ECOR1、 Sal I酶切位点的pET-32a-SD进行双酶切回收，然后与同样经过双酶切回收的穿梭质粒 pYA3493(质粒构建图谱见图3)连接，连接产物转化asd基因缺失的大肠杆菌x6097 (来源 美国华盛顿大学Dr.Roy Curtiss III教授惠赠)，筛选阳性克隆，提取质粒，经PCR和双酶切鉴定，得到构建正确的重组质粒pYA-COE和pYA-SD(如图4和图5所示)。其中，PCR扩增体系及扩增条件如实施例1，(2)所述。
实施例3 :表达猪流行性腹泻病毒COE和SD融合蛋白的重组沙门氏菌菌株 C501-C0E和C501-SD的构建与鉴定
(I)鉴定重组的沙门氏菌C501-C0E和C501-SD所需的引物的设计，其DNA序列如表2所示
表2鉴定重组的沙门氏菌C501-C0E和C501-SD所需的引物的DNA序列
PCR反应体系总体积反转录产物 dNTPs (2.5mmol/mL) 上游引物(20#mL) 上游引物(20μιη/πιυ LATaqDNA聚合酶 IOXLATaqBufFer 灭菌ddH20
权利要求
1.一种重组的猪霍乱沙门氏菌C501-C0E和C501-SD，其特征在于，所述的猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis) C501-C0E和C501-SD保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号分别为CCTCC NO M2011296和CCTCC NO :M2011297，所述的猪霍乱沙门氏菌C501-C0E和C501-SD分别含有表达猪流行性腹泻病毒保护性抗原基因COE和SD，它们的蛋白质的序列如序列表SEQ ID NO :2和4所不。
2.—种重组的猪霍乱沙门氏菌C501-C0E和C501-SD的制备方法，它包括下列步骤1)分别构建重组质粒pET-32a-C0E和pET_32a_SD，用如下所示的两个引物对从患猪流行性腹湾病(Porcine epidemic diarrhea)的病猪粪便病料中分别扩增猪流行性腹湾病毒COE基因和SD基因，所述的COE基因和SD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :1和SEQ IDNO 3所示所用引物对的DNA序列分别如下所示COE 正向引物GATGAATTCATGCATGAACAGCCAATTTC (5' — 3')，COE 反向引物GGGAAGCTTGATAGTATACTTGGTACACACATCC(5/ — )；SD 正向引物GACGAATTCATGACAGACGTTTCTTTTATGACTC (5' — 3')，SD 反向引物 KGGGTCGACAATACTCATACTAAAGTTGGTGGGC — 3')；分别将其亚克隆至原核表达载体pET-32a上，构建重组质粒pET-32a-C0E和pET-32a-SD，其中重组质粒pET-32a-C0E包含如序列表SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列；所述的重组质粒pET-32a-SD包含如序列表SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列；2)分别构建重组质粒pYA-COE和pYA-SD，将构建正确的原核表达质粒pET-32a_C0E和pET-32a-SD分别进行双酶切，并与经过相同双酶切的穿梭质粒pYA3493进行连接，转化asd基因缺失的大肠杆菌X6097，筛选阳性克隆；3)分别构建重组猪霍乱沙门氏菌C501-C0E和C501-SD，将重组质粒ρΥΑ-COE和pYA_SD电转化至猪霍乱沙门氏菌C500 Λ crp Λ asd缺失株中，分别得到保藏编号为CCTCC NO M2011296 和 CCTCC NO M2011297 的猪霍乱沙门氏菌 C501-C0E 和 C501-SD。
3.—种能够原核表达猪流行性腹泻病毒主要抗原位点的基因片段C0E，该片段的核苷酸序列如下所示 CATGAACAGCCAATTTCTTTTGTTACTTTGCCATCATTCAATGATCATTCTTTTGTTAATATTACTGTCTCTGCGGCTTTTGGTGGTCATAGTGGTGCCAACCTCATTGCATCTGACACTACTATCAATGGGTTTAGTTCTTTCTGTGTTGACACTAGACAATTTACCATTACACTGTTTTATAACGTTACAAACAGTTATGGTTATGTGTCTAAGTCACAGGATAGTAATTGCCCTTTCACCTTGCAATCTGTTAATGATTACCTGTCTTTTAGCAAATTTTGTGTTTCAACCAGCCTTTTGGCTGGTGCTTGTACCATAGATCTTTTTGGTTACCCTGAGTTCGGTAGTGGTGTTAAGTTTACGTCCCTTTATTTTCAATTCACAAAGGGTGAGTTGATTACTGGCACGCCTAAACCACTTCAAGGTGTCACGGACGTTTCTTTTATGACTCTGGATGTGTGTACCA AGTATACTATC一种能够原核表达猪流行性腹泻病毒主要抗原位点的基因片段SD，该片段的核苷酸序列如下所示ACAGACGTTT CTTTTATGAC TCTGGATGTG TGTACCAAGT ATACTATCTATGGCTTTAAAGGTGAGGGTATTATTACCCTTACAAATTCTAGCTTTTTGGCAGGTGTTTATTATACATCTGATTCTGGACAGTTGTTAGCCTTTAAGAATGTCACTAGTGGTGCTGTTTATTCTGTTACGCCATGTTCTTTTTCAGAGCAGGCTGCATATGTTGATGATGATATAGTGGGTGTTATTTCTAGTTTGTCTAACTCCACTTTTAACAATACCAGGGAGTTGCCTGGTTTCTTCTACCATTCTAATGATGGCTCCAATTGTACAGAGCCTGTGTTGGTGTATAGTAACATAGGTGTCTGTAAATCTGGCAGTATTGGCTATGTCCCACTTCAGGATGGCCAAGTCAAGATTGCACCCATGGTTACTGGGAATATTAGTATTCCCACCAACTTTAGTATGAGTATT。
4.一种猪霍乱沙门氏菌和猪流行性腹泻二价基因工程疫苗，其特征包括，该疫苗含有权利要求1所述的猪霍乱沙门氏菌C501-C0E和C501-SD，按照体积比，猪霍乱沙门氏菌C501-C0E和C501-SD的菌液与明胶保护剂比例为2:1。
5.权利要求1所述的重组猪霍乱沙门氏菌在制备猪霍乱沙门氏菌和猪流行性腹泻二价基因工程疫苗中的应用。
全文摘要
本发明属于动物细菌基因工程技术领域，具体涉及一种不含抗性标记的表达猪流行性腹泻病毒主要抗原位点的重组的猪霍乱沙门氏菌菌株C501-COE和C501-SD的构建、疫苗制备及应用。本发明得到一种不含抗性标记的表达猪流行性腹泻病毒主要抗原位点的重组猪霍乱沙门氏菌C501-COE和C501-SD，其保藏号分别为CCTCC NOM2011296；CCTCC NOM2011297，这两株重组菌株缺失了猪霍乱沙门氏菌生长所必需的asd基因，并含有能够在该菌株中表达asd基因和猪流行性腹泻病毒COE基因片段、SD基因片段的质粒。还公开了利用该重组菌制备猪霍乱沙门氏菌和猪流行性腹泻疫苗的方法及应用。本发明的疫苗可以刺激猪产生抵抗猪霍乱沙门氏菌和猪流行性腹泻病毒的保护性免疫反应，有效防止猪霍乱沙门氏菌和猪流行性腹泻病毒的感染。
文档编号A61K39/112GK103013895SQ20111028696
公开日2013年4月3日 申请日期2011年9月23日 优先权日2011年9月23日
发明者何启盖, 徐丽丽, 库旭钢, 李燕, 李娜娜, 张坤, 陈焕春, 郭爱珍, 徐高原 申请人:华中农业大学, 武汉科前动物生物制品有限责任公司