专利名称：：一种提高动物繁殖力的抑制素dna疫苗及制备与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及动物抑制素DM疫苗的构建及应用，特别是涉及一种无抗生素基因残留的提高动物繁殖力的猪霍乱沙门氏菌抑制素DNA疫苗及制备方法与应用。
背景技术：
：抑制素(inhibin—INH)是由卵巢分泌的糖蛋白质激素，能抑制垂体促卵泡素(FSH)的分泌，对于卵泡发育的调节具有重要作用。许多实验证明，应用INH主动或被动免疫动物，均能促进卵泡发育、诱导多排卵、提高产仔数，并能诱导单胎动物孪生(MedanMS，等.Theeffectofactiveimmunizationagainstinhibinongonadotropinsecretionsandfolliculardynamicsduringtheestrouscycleincows.JReprodDev.2006，52(1):107-13;MedanMS等.EffectofactiveimmunizationagainstinhibinonhormonalconcentrationsandsemencharacteristicsinShibabucks.Theriogenology-2006,65(4):691-702;MedanMS等.Passivei鹏uno-neutralizationofendogenousinhibinincreasesovulationrateinminiatureShibagoats.JR印rodDev.2004,50(6〉705-10)。众所周知免疫原制备很困难对于天然的免疫原，目前仍存在分离纯化困难的问题；人工合成或重组的抑制素免疫原存在工作量大，成本高的难题。为解决这些困难，申请人自1998年开始，开始了抑制素DNA疫苗的研究，先后构建了7种I朋真核表达质粒，并比较了各种疫苗的免疫效果和安全性(姜勋平，等.抑制素基因免疫对小鼠生殖的影响.中国兽医学报，2002，22(4):368-9;茆达干，等.抑制素a(1-32)基因免疫对大鼠卵泡发育和生殖激素的影响..中国农业科学，2003,36(12):1554-9:张德坤，等.抑制素基因免疫诱导单胎绵羊孪生的研究.中国农业大学学报，2004，9(4):40-5参考文献)。但是，由于以前构建的抑制素融合表达质粒(pCIS)中①含有卡那霉素基因或氨苄青霉素基因等抗性基因；②克隆后的质粒DNA必须提取、纯化才能用于免疫，提纯的成本很高；③免疫途径局限于肌肉注射，使用不太方便，只能用于实验研究，而不能用于产品开发。针对卵泡抑制素(INH)基因免疫和其他基因疫苗研究中存在的共性问题，本项目利用天冬氨酸半乳糖脱氢酶基因(asd)-减毒沙门氏菌载体-宿主平衡致死系统(以下简称平衡致死系统)替换现有抑制素真核表达质粒中的抗性基因，构建不含抗性基因的真核表达质粒得到一种新型抑制素咖A疫苗。本发明对于提高卵泡抑制素基因免疫的安全性和效果，降低生产成本，简化使用程序等，均具有重要意义。
发明内容本发明的任务在于克服5见有技术的缺陷，研制一种提高动物繁殖力的无抗生素基因残留的猪霍乱沙门氏菌抑制素DNA疫苗。本发明的目的还包括获得一种无抗性基因的真核表达质粒和将上述DNA疫苗应用于动物(小鼠)上，以提高其繁殖力，其中包含产仔数'泌乳力以及仔鼠成活率等关键技术指标的提高。本发明是这样实现的申请人通过制备，获得了一株含有抑制素真核表达质粒PXAIS的猪霍乱沙门氏菌(5a/mweLae加erj'casv.OoJe2-ses"i59C500/pXAIS'该菌株于加08年10月30日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCCNO:M208195。申请人:利用上述保藏的菌株直接生产出猪霍乱沙门氏菌抑制素DNA疫苗。在本发明的技术方案中，表达猪抑制素融合基因IS的表达质粒pXAIS是这样构建的首先将质粒pVAXl用pWII内切酶进行消化，从质粒PYA3493中扩增得到天冬氨酸半乳糖脱氢酶基因的核苷酸序列插入到pVAXl质粒中，得到不含卡那霉素的真核表达质粒载体pYAX—asd,将抑制素融合表达质粒PCIS中酶切回收得到乙肝表面抗原和抑制素a(1-32)的融合基因，再将该融合基因插入到真核表达质粒载体pVAX-asd中，得到抑制素真核表达质粒pXAIS。申请人建立一种提高动物繁殖力的猪霍乱沙门氏菌抑制素DNA疫苗的制备方法，其步骤如下(1)将质粒pVAXl用pVUII内切酶进行消化，从质粒PYA3493中扩增得到天冬氨酸P-半乳糖脱氢酶基因的核苷酸序列插入到pVAXl质粒中，得到不含卡那霉素的真核表达质粒载体pVAX—asd;(2)将抑制素融合表达质粒PCIS中酶切回收得到乙肝表面抗原和抑制素a(1-32)的基因，将该融合基因插入到真核表达质粒载体pVM—asd中，得到抑制素真核表达质粒pXAIS;(3)用抑制素真核表达质粒pXAIS转化猪霍乱沙门氏菌C500，得到保藏号为CCTCCNO:M208195猪霍乱沙门氏菌(5a^o"e/7ae/JfericaC力o7eraesu/s^C500/pXAIS;(4)扩大培养步骤(3)的猪霍乱沙门氏菌，得到猪霍乱沙门氏菌抑制素DNA疫苗。更详细的技术方案见《具体实施方式》。本发明的猪霍乱沙门氏菌抑制素DNA疫苗不含卡那霉素基因，在应用上比现有的抑制素DNA疫苗具有更好的安全性，其制备工艺简单，不需要经过纯化等制备步骤。图l:是本发明所克隆的天冬氨酸半乳糖脱氢酶基因(asd)的基因片段的扩增图谱，图中M:250bp的DNAmarker;l—4:以PYA3493为模板用asd的primers扩增得到的目的片段；5:以水为模板用asd的primers扩增得到的结果。图2:是真核表达质粒载体pVAX—asd酶切鉴定图谱，图中M:250bp的DNAmarker;1:真核表达质粒载体pVAX—asd通过pVUII进行酶切的结果。图3:是本发明抑制素真核表达质粒pXAIS的构建图谱。图4:是抑制素融合基因IS回收后的图谱lanel—5:从抑制素融合表达质粒PCIS上用Me/和ffi/w!Z7/进行双酶切回收后的结果；M:250bp的DNAmarker。图5:是抑制素真核表达质粒pXAIS酶切鉴定图谱M:250bp的DMmarker;1:pXAIS通过MeJ和ffi"^JJJ双酶切得到的结果。图6:添加抗生素对以猪霍乱沙门氏菌C500为载体的抑制素DNA疫苗的影响图左侧为在添加卡那霉素抗生素的LB固体培养基培养的以猪霍乱沙门氏菌C500为载体的抑制素DNA疫苗；图右侧为在不添加任何抗生素的LB固体培养基培养的以猪霍乱沙门氏菌C500为载体的抑制素DNA疫苗。图7:是抑制素真核表达质粒PXAIS在PK15细胞中转染48小时后通过RT-PCR进行转录水平的检测结果泳道l:无质粒转染的PK15细胞；泳道2:真核表达质粒载体pVAX—asd转染后RT-PCR结果；泳道3-5:抑制素真核表达质粒PXAIS转染后的RT-PCR结果。图8:是抑制素真核表达质粒pXAIS在PK15细胞中转染48小时后的蛋白表达间接免疫荧光检测结果图8A:抑制素真核表达质粒pXAIS在PK15细胞中表达情况检测有荧光，显示该融合蛋白有免疫活性；图8B:真核表达质粒载体pVAX—asd在PK15细胞中表达情况检测无荧光；图8C:无质粒转染的细胞检测为无荧光(空白对照)。图9:昆明鼠免疫后不同时间的抗抑制素IgG抗体滴度检测免疫后两周试验组的IgG抗体水平明显高于其他对照组，而在加强免疫后抗体水平没有显著差异。图10:是昆明鼠免疫后不同时间段的抗抑制素IgG分型抗体水平检测免疫后两周试验组的IgGl和IgG2a的抗体水平均高丁其他免疫组的，且lgG2a的0D值高于IgGl，而在4、6周两种分型的OD值几乎无差异。具体实施方式实施例1真核表达质粒载体pVAX—asd的构建1、天冬氨酸e-半乳糖脱氢酶基因(asd)基因克隆及序列分析采用Primer5.0引物设计软件，根据GenBank(AF015781)登录的沙门氏菌asd基因序列，设计了引物对(正向引物PIATGCAGCTGGCACATCTCTTTGCAGG;反向引物P2TTACAGCTGCTACGCCMCTGGCGCA)，以PYA3493质粒(KangHY等,I咖imeresponsestorecombinantpneumococcalPspAantigendeliveredbyliveattenuatedSalmonellaentericaserovartyphimuriumvaccine.InfectImmuti,2002,70(4):1739-49.)为模板，通过PCR方法克隆鼠伤寒沙门氏菌的asd基因片段。鼠伤寒沙门氏菌与猪霍乱沙门氏菌的asd基因同源性为100%，其cDNA开放阅读框为1107bp，编码368个氨基酸。以PYA3493质粒为模板，对asd基因片段尽行扩增；反应总体积20HL，其中含MgCl2(购自Toyobo公司)2uL引物(lOpmol/iiL上海生工生物工程技术有限公司合成)各0.5uLdNTPMixture(各lOmM,购自Toyobo公司)1ixLTaq酶(40U/PL，购自Toyobo公司)0.5uL模板0.5uL10XTaq缓冲液(购自Toyobo公司)1nL双蒸水使反应总体积20uL。按以下条件进行PCR反应94'C变性4min，然后94。C变性lrain、60°。退火45sec、"72。C延伸1min，35个循环后72'C再延伸7min。最后，将PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳，以DL2000作为分子量标准，观察电泳结果。(见图1)2、酶切和连接用PCR产物纯化试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)，参照试剂盒使用说明书将PCR扩增产物回收和纯化。纯化后的PCR产物与质粒载体PVAX分别用"K"//内切酶进行酶切。酶切体系10XH缓冲液(购自Toyobo公司)5uLasd(或pVAX)20uLp吸Z7(购自Toyobo公司)为2nL双蒸水至总体积50uL，37°C，反应3-5h,酶切后用低融点琼脂糖凝胶电泳分离回收1107bp的asd目的片段和2640bp的pVAX片段。然后按如下体系进行连接反应，连接目的片段和载体，连接体系为10Xligase缓冲艰(购自Toyobo公司)2jiLssd6"pVAX2uLT4DNA连接酶(购自Toyobo公司)1nL双蒸水至总体积20yL，16。C过夜。连接产物-2(TC保存，备用。3、感受态细菌的制备和重组质粒转化感受态细菌1)采用常规的CaCl2法(J,萨姆布鲁克，D.W.拉赛尔，分子克隆实验指南[M].第三版，北京科学出版杜，2002)制备新鲜感受态细菌大肠杆菌6097(NakayamaK等，ConstructionofanAsd+expression-cloningvector:stablemaintenanceandhighlevelexpressionofclonedgenesinaSalmonellavaccinestrain.Bio/Technology1988.6:693-697)。具体步骤如下(1)从含二氨基庚二酸MP(DAP终浓度为50ug/mL)的LB平板上(1LLB固体培养基组成10g氯化钠、5g酵母提取物、10g胰蛋白胨，15g琼脂粉，PH7.0)挑取新活化的缺失asd基因的fsc力e2"ic力j'acWi单菌落，接种于10mLLB液体培养基中(DAP终浓度为50ug/mL)(1LLB液体培养基组成10g氯化钠、5g酵母提取物、10g胰蛋白胨，pH7.0),37'C下振荡培养12h左右,直至对数生长后期即0D6。。>0.5时。将该菌悬液以1:100(体积比)接种于100mLLB液体培养基中，37。C振荡培养2.5h至0DM。=0.5左右。(2)培养液转入离心管中，冰上放置lOmin,然后于4'C下3000g离心lOmin。(3)去上清，用预冷的0.05mol/L的CaCl2溶液10mL轻轻悬浮细胞,冰上放置30min后，4'C下3000g离心lOmin。(4)弃去上清,加入4mL预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置lOmin,即成感受态细胞悬液。(5)将感受态细胞分装成100ixL的小份,可以立刻用于转化，或者将其贮存于-70'C下，备用。2)用热休克法(J.萨姆布鲁克，D.W.拉赛尔，分子克隆实验指南[M].第三版，北京科学出版社,2002)将连接产物转化感受态细菌DH5a，步骤如下(1)从-7(TC冰箱中取100wL感受态细胞悬液,置于冰上融解。(2)加入连接产物DNA溶液，轻轻摇匀，冰上放置30min后。(3)42'C水浴中热击90s，热击后迅速置于冰上冷却3min。(4)向管中加入400uLLB液体培养基，混匀后37。C振荡培养lh,使细菌恢复正常生长状态，并表达DNA编码的氨苄抗生素抗性基因。(5)将上述菌液摇匀后取100ul涂布于不含DAP(DAP终浓度为50ug/mL)的筛选平板上，正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37'C培养16-24h。4、阳性克隆的筛选、鉴定与测序从上述(5)的平板中挑取阳性克隆，接种于不含DAP的LB液体培养基培养，用质粒小量试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)抽提质粒(参照试剂盒使用说明书〉，/^〃//酶切，酶切体系为10XH缓冲液(购自Toyobo公司)1.6uL，提取的重组质粒9uL,p吸Z7为0.8uL，力卩ddH20至总体积16uL,37'C，反应2-3h，观察酶切结果，电泳条带与目的条带大小相符，送上海英骏生物技术有限公司测序。获得真核表达质粒载体pVAX—asd。(见图2)实施例2抑制素真核表达质粒pXAIS的构建(见图3)1、真核表达质粒载体pVAX—asd提取与纯化从LB平板上挑取新活化的真核表达质粒载体pVAX—asd单菌落，接种至lOmLLB液体培养基中，37'C、240rpra培养过夜，按体积比1:250的比例稀释到适当体积LB中，继续培养12h，离心收集菌体，抽提纯化真核表达质粒载体pVAX—asd。2、抑制素融合基因片段制备采用本申请人以前构建的抑制素融合表达质粒PCIS(HanL等，DevelopmentandevaluationofanovelDNAvaccineexpressinginhibinalpha(1-32)fragmentforimprovingthefertilityinratsandshe印.Animalreproductionscience,2008，109(1-4):251-65)通过Afteif卩A7"oT77双酶切可以得到858bp的抑制素与乙肝表面抗原(Davis等，DM-basedimmunizationforHepatitisBinducescontinuoussecretion269ofantigenandhighlevelsofcirculatingantibody,Hum.Mol.Genet.1993(2):1847-1851)融合基因片段IS(见图4)。3、抑制素真核表达质粒的连接将纯化、回收得到的抑制素融合基因片段IS和真核表达质粒载体pVAX—asd分别按如下体系进行池e/J和ffi/K/JJ/双酶切。反应体系为10XH缓冲液(购自Toyobo公司)5uL、IS15uL(或真核表达质粒载体pVAX—asd20uL)、顺e//和^//^///分别为1.5uL、加双蒸水至总体积50uL，37°C,反应3-5h，酶切后，用低融点琼脂糖凝胶电泳分离回收858bp的抑制素融合基因片段IS和3780bp的真核表达质粒载体pVAX—asd大片段。然后按如下体系进行连接反应10X连接缓冲液(购自Toyobo公司)2uL、IS6uL、真核表达质粒载体pVAX—asd大片段3"L、T4DNA连接酶(购自Toyobo公司)1wL、加双蒸水至总体积20uL,4°C过夜。4、参照通用的甘油法(J.萨姆布鲁克，D.W.拉赛尔，分子克隆实验指南[M].第三版，北京科学出版杜，2002)制备新鲜感受态猪霍乱沙门氏菌C500，具体步骤如下1)将猪霍乱沙门氏菌C500置于LB培养基上，在37'C下过夜培养；2)将过夜培养液按1:100体积比接种50ralLB液体培养基；3)37°C下200r/min培养至OD6。。达0.3-0.4，一般需要2.5-3小时;4)细胞在4。C5000g下离心15分钟，弃上清液；5)用预冷的50ml去离子水轻轻悬浮菌体；6)重复上步骤2次，去离子水体积分别为25ml和12.5ml;7)细胞在4°C5000g下离心15分钟，弃上清液收集菌体；8)用50ml灭菌的、冰冷后的10%甘油轻轻悬浮细胞；9)细胞在4。C5000g下离心15分钟，弃上清液；10)照上面步骤重复三次，10%甘油体积分别为50,25,12.5ml;11)最后于4°C7500r/min离心15rain收获细胞；11)沉淀细胞中加入0.25ml冰预冷的10%甘油重悬；12)将细胞按40ul等份装入微量离心管，于-80'C保存备用。5、将连接产物电转化入猪霍乱沙门氏菌的感受态细胞，方法如下1)在冰上解冻电感受态细胞，冰上培育约5分钟；2)添加10lil连接产物，冰上培育约5分钟；3)转移混合物至冷却后的电转杯中；4)对电转杯进行脉冲，时间4秒(脉冲电阻200Q，电容25uFd，电压2.0千伏)；5)立即添加1000u1的SOC培养基(蛋白胨20g，酵母提取物5g,氯化钠0.5g,1mol/L氯化钾2.5tnl，溶于1L水中高压灭菌，只是在培养基冷却到室温后，除了加10ml灭过菌的lnrol/L氯化镁外，再加20ml灭菌的lmol/L葡萄糖(18g葡萄糖溶于足够水中，再用水补足到100ml，用0.22um的滤膜过滤除菌)。6)37°C下培养1小时以复原；7)转移细胞至相应的LB固体培养基上培养。6、抑制素真核表达质粒(pXAIS)和以猪霍乱沙门氏菌C500为载体的抑制素DNA疫苗的筛选和鉴定挑取阳性克隆，接种于LB液体培养，提取质粒DM,迸行酶切鉴定，分别用Nhel和Hi/riin、双酶切鉴定重组质粒，酶切体系为10XHbuffer2wL、提取的重组质粒9"L、N力el和Hi/jdlII分别为0.5uL、加ddH20至总体积20wL,37°C,反应3-5h，1.2%琼脂糖电泳检测，电泳条带与目的条带大小相符(见图5)，送上海英骏生物技术有限公司进行测序，得到鉴定正确的抑制素真核表达质粒pXAIS和以猪霍乱沙门氏菌C500为载体的抑制素DNA疫苗。7、以猪霍乱沙门氏菌C500为载体的抑制素DNA疫苗的卡那霉素抗性检测将筛选鉴定正确的猪霍乱沙门氏菌C500为载体的抑制素DNA疫苗分别进行添加和不添加卡那霉素培养，结果显示，添加了卡那霉素的LB液体培养基中的猪霍乱沙门氏菌C500为载体的抑制素DNA疫苗没有生长，而没有添加卡那霉素的LB液体培养基中的猪霍乱沙门氏菌C500为载体的抑制素DNA疫苗则正常生长(见图6)。实施例4:抑制素真核表达质粒pXAIS质粒在体外蛋白表达的检测1、抑制素真核表达质粒pXAIS转染细胞后转录水平的检测用质粒提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)抽提质粒，待PK15细胞(野猪正常肾脏的细胞)单层长至60%-70%时按脂质体转染试剂盒(购自Invitrogen公司)说明书进行转染。转染PK15细胞48h后，用胰酶消化并收集细胞。按照Trizol(购自Invitrogen公司)使用说明书提取细胞的mRM'反转录获得cDM,根据抑制素引物进行扩增。以反转录得到的cDNA为模板，用INHprimers(INHP1:TGCTGGATATCTGCAGAATTCCCT，INHP2:CTTCTCGAGATCTGTGGCAGTCGG。这引物是由上海生工生物工程技术有限公司合成)进行INH目的片段的扩增。经r/6琼脂糖电泳检测可发现一条858bp左右的片段(见图7),经上海生丄生物工程技术有限公司测序鉴定该片段为抑制素目的片段，片段全长为858bp。2、抑制素真核表达质粒pXAIS体外表达的检测将待检测细胞(瞬吋转染细胞)用PBS缓沖液(8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HP04和0.24gKH2P04,溶于800ml蒸馏水中，用HC1调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可)洗涤3次，100%甲醇室温固定10min,PBS缓冲液洗涤3次，用含10%牛血清的PBS封闭30min，然后依次分别与鼠抑制素单克隆抗体(购自Thermo公司，货号为MS-1863-S0)和FITC标记的羊抗鼠二抗(购自武汉博士得生物工程有限公司)37'C作用各30rain,其间用PBS缓冲液洗涤，与二抗反应后在用PBS缓冲液洗涤3次，直接于荧光显微镜下镜检(型号Olympus，1X70)。抑制素真核表达质粒pXAIS在转染PK15细胞48h后，通过间接免疫荧光方法检测质粒是否在真核细胞中表达。结果表明PBS缓冲液及真核表达质粒载体pVAX—asd质粒转然后的细胞用抑制素抗体检测后通过荧光显微镜没有发现绿色荧光，而抑制素真核表达质粒pXAIS转染的细胞经检测后发现绿色荧光(见图8)。这结果表明抑制素真核表达质粒pXAIS转染真核细胞后表达的融合蛋白具有抑制素免疫活性。3、ELISA法检测细胞表达产物的免疫学活性包被待测样每孔100nL,用PH9.6,0.05M碳酸盐包被缓冲(Na2C031.59克，NaHC(h2.93克，加蒸馏水至1000ral)液稀释的抑制素抗原浓度为100ng/100uL包被作阳性对照，4汇过夜；自动洗板机上用PBST缓冲液(KH2P04-0.2克，Na2HP04■12H20-2.9克，NaCl-8.0克，KC1-0.2克，TVeen-200.05%_0.5ml，加蒸馏水至1000ml)洗6次，然后每孔加封闭液(牛血清白蛋白-BSA0.1克加洗涤缓冲液至100ml)200uL,37'C反应lh;洗涤，加鼠抑制素单克隆抗体100uL，37'C反应lh;洗涤，加兔抗鼠IgG-HRP(1:5000,购自武汉博士德公司)100ul/孔，反应l小时；洗涤，加入150uLT肥底物液(0.2MNa2HP0-(28.4g/L)25.7ml，0.1M柠檬酸(19.2g/L)24.3ml，加蒸馏水50ml即为100ml的底物缓沖液；0.75%TMB即称取37.5呢溶于5ral无水乙醇；A液:0.75mlTMB0.75%+6.75ralddH20—7.5ml;B液:7.5ral底物缓冲液+45ul过氧化脲一7.5ral)显色，37。C反应25分钟；力[]50uL2raol/L1^04终止反应，于酶标仪上测0D站。值。收集抑制素真核表达质粒PXAIS转染48h后的PK15细胞制备待测样，包被待测样每孔100UL，包被抑制素100ng/100uL作阳性对照，OD咖值PBS〈抑制素真核表达质粒pXAIS〈抑制素抗原100ng,抑制素真核表达质粒pXAIS与抑制素抗原所测得的OD值差异较小，且大于PBS及真核表达质粒载体pVAX—asd对照組2倍以上，提示抑制素真核表达质粒pXAIS均具有抑制素的免疫学活性(表1)。表l转染48小时后通过ELISA方法检测重组蛋白的表达情况的OD450值<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例4本发明在昆明鼠上对其繁殖性能以及免疫应答的影响1、疫苗制备-以猪霍乱沙门氏菌C500为载体的抑制素DNA疫苗和猪霍乱沙门氏菌C500空菌分别接种LB液体培养基中，于37。C、150rpm振摇培养至0D咖0.3-0.4，4°C、1500g离心10min,弃上清，用灭菌的PBS缓冲液调整细菌浓度至10"CFU/mL，得到试验的备用疫苗。2、试验动物免疫试验选50日龄的昆明小鼠共45只，分为3组，每组15只，购自湖北省疾病控制中心提供，在本申请人所在的动物遗传育种与繁殖实验室饲养一周后进入试验，各组试验小鼠年龄和体重基本一致。这三组分别为试验组T1(口服以猪霍乱沙门氏菌C500为载体的抑制素口服基因疫苗)，猪霍乱沙门氏菌C500空菌对照组T2(口服猪霍乱沙门氏菌C500〉，PBS对照组T3(只口服PBS缓冲液)；在发情期放入公鼠进行交配，直至产仔，观察其产仔数，泌乳力，仔鼠成活率的变化T12，T22，T32在加强免疫一次后上组进行相同处理T13,T23,T33在加强免疫二次后进行相同处理。3、免疫方法受免疫的动物(50日龄性成熟昆明小鼠)免疫前12小时禁食，免前4小时禁水，免疫前30分钟，预先口服7.5^的NaHC03(200uL/头)以中和胃酸，免疫剂量为1X1(TCFU/头。每个试验组中的三个小组分别免疫不同次数，一组一免，两外两组初次免疫后2周以相同剂量、相同方法加强免疫一次，同样，最后一组以相同剂量、相同方法加强免疫一次。4、饲养管理试验用昆明小鼠为每5只/笼，室内温度一直保持在28度左右。试验期期内动物房一直保持清洁、卫生，及时清除舍内粪尿，保持舍内干燥。5、血浆制备以初次免疫为0周，分别在第0、2、4、6、8周进行尾静脉采取血样，肝素钠抗凝，制备血浆，-20°C保存，用以抗体的检测(参照杨利国等，酶免疫测定技术M南京农业大学出版社，南京，1998:138-139)。6、测定指标(1)小鼠产仔数，泌乳力，以及仔鼠成活率记录每个试验组小鼠产仔数，泌乳力，以及仔鼠成活率。以猪霍乱沙门氏菌C500为载体的抑制素口服基因疫苗对昆明小鼠繁殖性能的影响如表2所述，本发明Tl组试验鼠平均产仔数，泌乳力均高于空菌组和对照组，但是在试验组与各对照组之间没有显著差异。(2)抑制素抗体检测采用间接ELISA方法检测血浆中抑制素抗体。步骤如下包被抑制素抗原每孔100ng/100pL，4'C反应12h,弃反应液，于自动洗板机上洗涤6次，每次30秒；加封闭液(5%的脱脂牛奶溶液)200nL/孔，37'C反应1.5h,弃反应液，洗涤6次'每次30秒；将昆明小鼠血浆依次稀释l:2,1:4，1:5，1-10,1:20，1:40,1:50，同时设阴性对照孔，每个样本三个重复，37。C反应lh，弃反应液，洗涤6次'每次30秒；加羊抗鼠IgG-朋P1:5000稀释(购自武汉博士德公司)，每孔100uL，37。C反应lh,弃反应液，洗涤6次'每次30秒；加TMB底物液，每孔150uL，37'C反应25min;加2mol/L硫酸终止反应，每孔50uL;OD450读数。以P/N值》2判为最高抗体滴度，其中P为待测血样的吸光值，N为阴性对照血样吸光值，结果见表3和图9。本发明的以猪霍乱沙门氏菌C500为载体的抑制素口服基因疫苗笫一次口服免疫后的第2周抑制素抗体滴度值就达高峰，且一免后试验组高于其它各组(P<0.05)，随后各组的抗体滴度值都有所下降，但试验组均高于对照组(P〉0.05)。表3:本发明制备的口服DNA疫苗昆明小鼠血浆中抑制素的抗体滴度免疫次数\分组试验组T1空菌组T2PBS对照组一免后50±025±015±0二免后25±028.33±1.6718.33±1.67三免后13.33±0.834.17±0.8311.67±0.83(3)抗体水平分型检测分型检测与测定抗体的方法相同，只是在加入二抗时用羊抗小鼠IgGl-冊P和lgG2a-朋P替代羊抗小鼠lgG-HRP进行免疫血清抗体IgGl和lgG2a的分型检测。抗体分型检测显示免疫后两周IgG2a测定的0D值高于IgGl，而在加强免疫后两种分型的OD值无显著差异。结果见图IO。表2免疫后昆明鼠繁殖力的比较(均值士方差,n=5)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注在水平上比较，显著水平pO.05用完全不同的字母显示，而iX).05则用相同的字母表示200810197980.3转溢齿被10/105t权利要求1、一株含有抑制素真核表达质粒pXAIS的猪霍乱沙门氏菌(Salmonellaentericasv.Choleraesuis)C500/pXAIS，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCCNOM208195。2、由权利要求1所述的猪霍乱沙门氏菌制备的猪霍乱沙门氏菌抑制素DNA疫苗。3、一种表达猪抑制素融合基因IS的表达质粒pXAIS，其特征在于，将质粒pVAXl用pVUII内切酶进行消化，从质粒PYA3493中扩增得到天冬氨酸e-半乳糖脱氢酶基因的核苷酸序列插入到pVAXl质粒中，得到不含卡那霉素的pVAX—asd质粒，将抑制素真核表达质粒PCIS中酶切回收得到乙肝表面抗原和抑制素a(1-32)的融合基因，再将该融合基因插入到pVAX一asd质粒中，得到抑制素真核表达质粒pXAIS。4、一种提高动物繁殖力的猪霍乱沙门氏菌抑制素DNA疫苗的制备方法，其特征在于-(1)将质粒pVAXl用pVUII内切酶进行消化，从质粒PYA3493中扩增得到天冬氨酸e-半乳糖脱氢酶基因的核苷酸序列插入到pVAXl质粒中，得到不含卡那霉素的pVAX—asd质粒；(2)将抑制素真核表达质粒PCIS中酶切回收得到乙肝表面抗原和抑制素a(1-32)的基因，将该融合基因插入到pVAX—asd质粒中，得到抑制素真核表达质粒pXAIS;(3)用质粒pXAIS转化猪霍乱沙门氏菌C500，得到保藏号为CCTCCNO:M208195猪霍舌L沙门氏菌(^5k/顶o"eJ7ae"ter/casr.C力o/erae5tA2.5^C500/pXAIS;(4)扩大培养步骤(3)的猪霍乱沙门氏菌，得到猪霍乱沙门氏菌抑制素DNA疫苗。5、权利要求1所述的猪霍乱沙门氏菌在制备提高动物繁殖力的猪霍乱沙门氏菌抑制素DNA疫苗中的应用。全文摘要本发明属于动物疫苗制备
技术领域：
，具体涉及一种无抗生素基因残留的提高动物繁殖力的猪霍乱沙门氏菌抑制素DNA疫苗及制备与应用。将猪抑制素α(1-32)基因与乙肝表面抗原融和基因插入到缺失了卡那霉素抗性基因的质粒载体pVAX1中，得到抑制素真核表达质粒pXAIS，将抑制素真核表达质粒pXAIS转染入猪霍乱沙门氏菌C500中，构建了猪霍乱沙门氏菌抑制素DNA疫苗。与现有技术相比，本疫苗无抗生素基因残留，具有运动效率高，免疫方法简单，免疫效果好。载体菌本身可作为免疫佐剂，能同时激活粘膜免疫和全身免疫，并可获得对载体菌的免疫等优点。文档编号A61K39/00GK101407781SQ200810197980公开日2009年4月15日申请日期2008年12月1日优先权日2008年12月1日发明者杨利国,梁爱心,王庆玲,甄艳红,丽韩申请人:华中农业大学