α-地中海贫血基因突变检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因组突变检测领域，特别涉及人类α -地中海贫血基因检测和人类 胚胎α-地中海贫血基因检测。
【背景技术】
[0002] 地中海贫血（以下简称地贫）分为α -地中海贫血和β-地中海贫血。α -地 中海贫血（以下简称α-地贫），是一组因 α-珠蛋白链合成减少或不能合成，α-链/非 α-链比例失衡为特征的遗传溶血性血红蛋白病。地贫是世界上最常见的人类单基因遗传 血液病之一，被世界卫生组织列入危害人类健康的6种常见病，也是中国南方各省最常见、 危害最大的遗传病。在我国南方α -地贫的高发区，总发病率为2. 46%，其中广西、广东、江 西、四川和浙江各省（区）的发病率分别为14.95%、4· 11 %、2· 60%、L 92%和1.20%。
[0003] 人类α-珠蛋白基因簇位于16号染色体，每条染色体各有2个α-珠蛋白基因。 大多数α-地贫是由于α-珠蛋白基因的缺失所致，少数由基因点突变造成。若仅是一条 染色体上的一个α-基因缺失或缺陷，则α-链的合成部分受抑制，称为α+地贫；若有一 条染色体上的2个α-基因均缺失或缺陷，称为α 〇地贫。重型α-地贫是α 〇地贫的纯 合子状态，其4个α-珠蛋白基因均缺失或缺陷，以致完全无 α-链生成。中间型α-地贫 是α〇和α+地贫的杂合子状态，是由3个α-珠蛋白基因缺失或缺陷所造成，患者仅能合 成少量α-链。标准型α-地贫（轻型）是α +地贫纯合子或α 〇地贫杂合子状态，它仅 有2个α-珠蛋白基因缺失或缺陷，故有相当数量的α-链合成，症状轻微。静止型α-地 贫是α+地贫杂合子状态，它仅有一个α-基因缺失或缺陷，α-链的合成略为减少，症状 非常轻微。目前在中国发现的α-链缺失突变有17种，最常见的有SEA、4. 2kb和3. 7kb三 种缺失型及CS、WS和QS三种点突变。目前，α-地贫还没有效的根治方法，主要以预防为 主。因此开展检测，提早发现地贫异常基因的携带者对指导婚前及产前诊断具有重要的意 义。
[0004] 遗传病起因于上代生殖细胞和受精卵的遗传物质突变。杜绝遗传病患儿的出生仍 是目前最有效的手段，以往通过产前诊断在妊娠16-20周进行选择性流产，阻止患儿的出 生。植入前遗传学诊断（preimplantation genetic diagnosis, P⑶）是辅助生殖技术和分 子生物学技术相结合而发展起来的一门新的诊断技术，通过胚胎活检技术获得1~2个卵 裂球进行遗传学诊断分析，选择正常、无缺陷的健康胚胎植入子宫继续妊娠，达到优生的目 的，可以避免传统的产前诊断技术引起的出血、感染等并发症以及流产和引产给孕妇造成 的身心痛苦，并避免由此引起的伦理上的争议。目前还没有已经商品化试剂盒用来进行胚 胎植入前α-地中海贫血诊断，本发明属于国内首创，提供了一种高覆盖率的试剂盒来满 足临床应用的需求。
[0005] PGD的分析材料极为有限，通常仅为1~2个细胞，对诊断技术的敏感性和特异性 要求高，同时子宫的种植窗时间短，要求在尽可能短的时间得到诊断结果。PCR以一对与待 检测目的DNA片段起始与结束部位碱基互补的寡核苷酸为引物，经反复变性、退火、延伸， 实现目的DNA的对数扩增，具有极高的检测敏感性和特异性；少量的DNA模板在数小时内就 可以扩增大量的拷贝数。但由于单细胞内基因组DNA的含量约10pg，目的基因模板仅1~ 2个拷贝，扩增后特异性产物量达不到检测水平，使诊断的特异性和敏感性降低。巢式PCR 是改良的PCR。巢式PCR有内外两对引物，PCR反应分两步。在首轮外侧引物PCR中，反应 模板是单细胞裂解产物，外侧引物与目的基因配对连接，扩增引物间的特异性片段。然后以 此PCR产物为模板，应用内侧引物引导扩增产物内的DNA片断，使目的基因产量进一步增 加。巢式PCR大大提高了 PCR技术的灵敏度、特异性和精确度。
[0006] PCR虽然灵敏，但应用于P⑶的时候，存在污染、等位基因脱扣、扩增失败等缺点。 单细胞PCR的扩增失败率大约是5%~10%。扩增失败可能与样本的准备过程有关，如未 移入细胞、靶DNA的丢失和变性以及细胞的裂解过程。污染是导致误诊的重要原因，通过设 立严格的阴性和阳性对照、严格的实验室操作以及单精子卵胞浆内注射技术的应用可以减 少污染。等位基因脱扣（allele dropout, AD0)是指在单细胞扩增时，杂合子的两个等位基 因之一出现扩增，而另一个等位基因无扩增产物。ADO是导致误诊的主要原因之一，通常有 5%~20%的单细胞扩增出现等位基因脱扣。其发生机理复杂，可能与染色体嵌合体、部分 二倍体细胞中存在单倍体细胞和PCR变性的温度有关。
【发明内容】
[0007] 为了克服现有技术的上述局限性，本发明人设计了一种基于高通量测序技术检测 α -地贫的方法。
[0008] 一、定义
[0009] "读段（reads) "是指测序获得的序列片段。
[0010] "单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP) "是指在基因组水平 上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。
[0011] "单体型（Haplotype) "是指位于一条染色体特定区域的一组相互关联，并倾向于 以整体遗传给后代的单核苷酸多态性的组合，又称单倍体型或单元型。
[0012] 二、引物组合物
[0013] 本发明提供了一种用于检测α-地中海贫血基因突变的引物组合物，其由特异扩 增中国人群α -地贫SEA、4. 2kb、3. 7kb三种最常见缺失型突变和CS、WS、QS三种最常见点 突变的引物，以及特异扩增人类α -珠蛋白基因 HBAl上下游IMb范围内紧密连锁的单核苷 酸多态性（SNP)位点的引物组成。
[0014] 在本发明中，针对人类α-珠蛋白基因 ΗΒΑ1，设计了 110对序列特异性引物（如表 1所示）。其中，特异扩增α -地贫SEA、4. 2kb、3. 7kb三种缺失型突变和CS、WS、QS三种点 突变的引物包括编号为1~94的引物对（正向引物序列分别为SEQ ID NOs: 1~188中的 奇数序列，反向引物序列分别为SEQ ID NOs: 1~188中的偶数序列）中的一对或多对；特 异扩增HBAl上下游IMb范围内紧密连锁的SNP位点的引物包括编号为95~110的引物对 (正向引物序列分别为SEQ ID NOs: 189~220中的奇数序列，反向引物序列分别为SEQ ID NOs: 189~220中的偶数序列）中的一对或多对。
[0015] 这些引物的特点为：（1)在目标染色体上序列唯一；（2)位置特异的寡核苷酸具有 相同的退火温度；（3) 110对引物混合到两个PCR反应管中，在两个PCR反应管中能进行110 重反应。
[0016] 表1 α-地中海贫血基因检测引物
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[0023] 在最优选的实施方案中，本发明的引物组合物包括表1中编号为1~110的全部 引物对。
[0024] 三、检测产品
[0025] 本发明提供了一种用于检测α -地贫基因突变的检测产品，其包括本发明的引物 组合物。
[0026] 在一个特定的实施方案中，所述检测产品为检测试剂盒，其包括：
[0027] (1)用于文库构建的反应试剂，包括：特异性结合引物，通用引物，多重PCR聚合 酶，DNA连接酶，末端修复酶，dNTPs，反应缓冲液；
[0028] (2)用于纯化PCR反应产物的试剂。
[0029] 所述特异性结合引物即为本发明的上述引物组合物。
[0030] 优选地，用于PCR产物纯化的试剂包括产物纯化磁珠及缓冲液。上述试剂盒还可 以包括阴性质控品和阳性质控品。
[0031] 四、检测方法
[0032] 本发明提供了一种体外检测α -地中海贫血突变的方法，其包括以下步骤：
[0033] (1)分离样本基因组DNA ;
[0034] (2)利用本发明的引物组合物进行多重PCR扩增富集目标区域DNA ;
[0035] (3)纯化PCR产物，测序；
[0036] (4)比对与统计；
[0037] (5)数据分析。
[0038] 优选地，样本来自胚胎或全血。
[0039] 胚胎基因组DNA的获取是当胚胎发育至囊胚期时，取出外围滋养层细胞3~5个， 运用全基因组扩增方法对细胞中的基因组DNA进行富集。任选地，使用磁珠纯化扩增产物。
[0040] 目标区域DNA分子富集采用的是多重PCR扩增的方法。具体原理和方法参见生厂 商提供的说明书，将DNA分子富集为比较集中的一定大小的片段。在本发明的一个实施方 案中，DNA片段大小在125~275bp之间。
[0041] 优选地，步骤（2)中按照Ion AmpliSeq? Library Kits 2. 0标准建库流程进行建 库。在这个过程中，通过目标区域多重PCR扩增为集中在125~275bp的DNA分子，两端加 上了测序所用接头，每个样品被加上不同的标签序列（barcode)，从而在一次测序得到的数 据中可以使多个样品的数据区分开。
[0042] 优选地，所采用的测序方法为高通量测序方法。在一个特定的实施方案中，测序平 台为Ion Torrent PGM。更优选地，测序深度为300X~3000X，即每条特异PCR扩增产物 被测序300~3000次，例如在本发明的一个实施方案中，测序深度为1000X，即该条特异 PCR扩增产物被测序1000次。
[0043] 优选地，当待测的