产生的原始数据去除接头序列、 用Tmap软件比对到人类hgl9参考基因组、分析单体型SNP覆盖倍数和基因型。
[0099] 三、数据分析
[0100] 利用父母和先证者与α -地贫致病基因 HBAl紧密连锁多态性位点（SNP)在染色 体上的位置和基因型构建单体型。利用已经建好的单体型对胚胎是否致病进行判断。
[0101] 四、结果
[0102] 选取目标区域的26个多态性位点chrl6构建单体型：
[0103] 60054 103923 189971 207731 212649 218735 221057 221126 223706
[0104] 223735 224619 232773 232787 234632 235579 240280 241210 244785
[0105] 272349 280860 304514 336660 404750 571904 899974 1114458
[0106] 单体型结果如图1所示。
[0107] 结果表明：
[0108] Syq_l为杂合SEA缺失，Syq_2为杂合SEA缺失，Syq_4为杂合3. 7缺失，Syq_5为 杂合SEA缺失，Syq_7为杂合3. 7缺失，Syq_8为杂合3. 7缺失；Syq_10为杂合SEA缺失； Syq_ll为杂合3. 7缺失；Syq_12为杂合3. 7缺失，Syq_15为杂合3. 7缺失。
[0109] 实施例2 4例α -地贫患者基因检测
[0110] 一、建库和测序
[0111] 获取4例α -地贫患者的全血样本，提取全血DNA，用Qubit (Invitrogen, the Quant-iTTM dsDNA HS Assay Kit)定量，并分离IOng进行后续实验。
[0112] 使用本发明的优选引物组（表1中的全部引物对1~110)，按照Ion 八1^115叫1\11^&^1(^82.0标准建库流程进行建库标准建库流程进行建库。简而言之， 多重PCR扩增产物的DNA分子两端加上测序所用的接头，在一定条件下使核酸分子成簇生 长，然后在Ion Torrent PGM上测序，得到片段长度分布在125bp~275bp的目标区域DNA 片段序列。
[0113] 本实施例中，对于获自上述4例全血DNA样品按照Ion Torrent官方公布的测序 说明书进行操作。
[0114] 二、比对与统计
[0115] 利用Torrent_Server_4. 0_VM软件对PGM测序仪产生的原始数据去除接头序列、 用Tmap软件比对到人类hgl9参考基因组、分析SEA缺失区域拷贝数。
[0116] 三、数据分析
[0117] 利用30例确定正常的样本构建数据库，计算每个样本SEA缺失区域染色体的相对 序列值（RC)，通过不同样本的平均值，统计分析、最终确定参考值的范围为0. 7~1. 3。根 据参考值对样本的缺失型进行判断。
[0118] 四、结果
[0119] 结果如图2所示。
[0120] 结果表明：
[0121] 样本1为杂合3. 7/SEA缺失；样本2为杂合3. 7缺失；样本3为杂合4. 2缺失；样 本4为杂合SEA缺失。
【主权项】
1. 一种用于检测a-地中海贫血基因突变的引物组合物，其特征在于由特异扩增人类 a-珠蛋白基因HBAl的SEA、4. 2kb、3. 7kb三种缺失突变和CS、WS、QS三种点突变的引物， 以及特异扩增HBAl上下游IMb范围内紧密连锁的SNP位点的引物组成。2. 根据权利要求1所述的引物组合物，其中，所述特异扩增HBAl的SEA、4. 2kb、3. 7kb 三种缺失突变和CS、WS、QS三种点突变的引物包括正向引物序列为SEQIDN0:2n-1且反 向引物序列为SEQIDN0:2n的引物对中的至少一对，n为1~94的自然数；所述特异扩增 HBAl上下游IMb范围内紧密连锁的SNP位点的引物包括正向引物序列为SEQIDN0:2n-1 且反向引物序列为SEQIDN0:2n的引物对中的至少一对，n为95~110的自然数。3. 根据权利要求2所述的引物组合物，其包括序列为SEQIDNOs: 1~220的全部引 物。4. 一种用于检测a-地中海贫血基因突变的检测产品，其特征在于包括权利要求1-3 任一项所述的引物组合物；优选地，所述检测产品为检测试剂盒。5. -种用于检测a_地中海贫血基因突变的试剂盒，其特征在于包括： (1) 用于文库构建的反应试剂，包括：权利要求1-3任一项所述的引物组合物、通用引 物、多重PCR聚合酶、DNA连接酶、末端修复酶、dNTPs、反应缓冲液； (2) 用于纯化PCR反应产物的试剂，优选地，其包括产物纯化磁珠及缓冲液； 优选地，所述试剂盒还包括： (3) 阴性质控品和阳性质控品。6. -种体外检测胚胎a-地中海贫血基因突变的方法，其包括以下步骤： (4) 分离胚胎基因组DNA; (5) 利用权利要求1-3任一项所述的引物组合物进行多重PCR扩增富集目标区域DNA; (6) 纯化PCR产物，测序； (7) 比对与统计； (8) 数据分析。7. 根据权利要求6所述的方法，其中，步骤⑴中胚胎基因组DNA的分离是当胚胎发育 至囊胚期时，取出外围滋养层细胞3~5个，运用全基因组扩增方法对细胞中的基因组DNA 进行富集；优选地，在步骤（1)中还包括使用磁珠纯化扩增产物。8. -种体外检测胚胎a-地中海贫血基因突变的方法，其包括以下步骤： (9) 将获自体外培养的囊胚的滋养层细胞经全基因组扩增对细胞中的基因组DNA进行 富集； (10) 磁珠纯化全基因组扩增产物； (11) 提取夫妻双方全血DNA; (12) 利用权利要求1-3任一项所述的引物组合物进行多重PCR扩增富集单体型目标区 域DNA; (13) 纯化PCR产物，并测序； (14) 将步骤（4)中测定的胚胎和夫妻双方的DNA序列进行比对，判断胚胎的单体型； (15) 将步骤（4)中测定的DNA序列与正常样本参考序列进行比对，分析目标位点覆盖 倍数和基因型。9. 一种体外检测胚胎a-地中海贫血基因突变的方法，其包括以下步骤： (16) 将获自体外培养的囊胚的滋养层细胞经全基因组扩增对细胞中的基因组DNA进 行富集； (17) 磁珠纯化全基因组扩增产物； (18) 利用权利要求1-3任一项所述的引物组合物进行多重PCR扩增富集目标区域 DNA； (19) 纯化PCR产物，并测序； (20) 将步骤（3)中测定的DNA序列结果与正常样本参考序列进行比对，判断样本的基 因型。10. -种a-地中海贫血致病基因突变的胚胎植入前筛选方法，其包括以下步骤： (21) 将获自体外培养的囊胚的滋养层细胞经全基因组扩增对细胞中的基因组DNA进 行富集； (22) 磁珠纯化全基因组扩增产物； (23) 提取夫妻双方全血DNA; (24) 利用权利要求1-3任一项所述的引物组合物进行多重PCR扩增富集单体型目标区 域DNA; (25) 纯化PCR产物，并测序； (26) 将步骤（4)中测定的胚胎和夫妻双方的DNA序列进行比对，判断胚胎的单体型； (27) 将步骤（4)中测定的DNA序列与正常样本参考序列进行比对，分析目标位点覆盖 倍数和基因型； (28) 选择不携带a-地中海贫血致病基因突变的胚胎用于子宫植入。11. 一种a-地中海贫血致病基因突变的胚胎植入前筛选方法，其包括以下步骤： (29) 将获自体外培养的囊胚的滋养层细胞经全基因组扩增对细胞中的基因组DNA进 行富集； (30) 磁珠纯化全基因组扩增产物； (31) 利用权利要求1-3任一项所述的引物组合物进行多重PCR扩增富集目标区域 DNA； (32) 纯化PCR产物，并测序； (33) 将步骤（3)中测定的DNA序列结果与正常样本参考序列进行比对，判断样本的基 因型； (34) 选择不携带a-地中海贫血致病基因突变的胚胎用于子宫植入。12. 根据权利要求6-11任一项所述的方法，其中，富集的目标区域DNA片段大小在 125~275bp之间。13. 根据权利要求6-11任一项所述的方法，其中，富集目标区域DNA是按照Ion AmpliSeq?LibraryKits2.0标准建库流程进行建库；优选地，通过目标区域多重PCR扩 增为集中在125~275bp的DNA分子，两端加上了测序所用接头，来自不同受试样品的DNA 被加上不同的标签序列（barcode)。14. 根据权利要求6-11任一项所述的方法，其中，所采用的测序方法为高通量测序方 法；优选地，测序平台为IonTorrentPGM015. 根据权利要求14所述的方法，其中，测序深度为300X~3000X。16. 根据权利要求6-11任一项所述的方法，其中，利用!'〇1^6]11:_561^61'_4.0_\^[软件对 测序仪产生的原始数据去除接头序列，用Tmap软件比对到正常样品参考序列。17. 根据权利要求6-11任一项所述的方法，其中，所述正常样品参考序列为人类基因 组参考序列，优选人类hgl9参考基因组序列。
【专利摘要】本发明提供了一种α-地中海贫血基因突变检测试剂盒，该试剂盒包含一套扩增样品中靶基因的引物组合物。本发明的检测试剂盒可以对所有α-地贫突变进行胚胎移植前检测，并且检测过程更加快速，检测结果也更为准确。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN104894279
【申请号】CN201510359029
【发明人】冯涛, 刘小军, 邢丽贤, 邓红辉, 杨凯
【申请人】北京嘉宝仁和医疗科技有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月25日