一种t细胞活化调节剂生物学活性的报告基因检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物制药技术领域，具体地说是涉及一种T细胞活化调节剂生物学活 性的报告基因检测方法。
【背景技术】
[0002] 胸腺依赖性淋巴细胞（Thymus-dependent lymphocyte，简称T细胞）功能的抑制 或激活在肿瘤免疫、自身免疫疾病及移植排斥反应中起着极为重要的作用，T细胞活化，不 仅需要T细胞受体的第一信号，而且需要第二信号。第一信号来自于T细胞上的⑶3/TCR(T cell receptor，T细胞受体）复合物与抗原提呈细胞或其它种类细胞上的主要组织相容性 复合体（major histocompatibility complex，MHC)及抗原复合物；第二信号即共刺激信号 来源于T细胞上的CD28与抗原提呈细胞上的CD80/86的结合，对该信号通路进行调节，如 通过CTLA-4竞争性抑制⑶28与⑶80/86的结合，进而阻断第二信号通路，或者通过⑶3抗 体竞争性结合CD3/TCR复合物，从而阻断第一信号通路，可起到调节（抑制或激活）T细胞 活性的效果。基于此，涌现出大量已上市或在研的针对T细胞活化过程中所涉及的分子事 件而设计的药物，以下统称为T细胞活化调节剂。对T细胞活化程度进行检测，是基于细胞 水平的在开发此类药物时对其药效进行评估的重要指标。
[0003] 现有的在细胞水平对T细胞活化程度进行检测的方法分为以下几类：第一，检测 T细胞活化引起的T细胞增殖效应（如专利CN 101427135 A)，该方法需要使用原代T细 胞，材料来源相对困难且重复性没有保障，同时实验持续时间较长，通常为5-7天；第二，直 接检测T细胞活化过程中相关分子，例如mRNA或蛋白的表达（如专利CN 101427135 A、 US 6114129 A、US 5180662 A、CN 102811739 A 和 EP 2510948 A1，以及参考文献：Stohl W et al·，J Immunol. 1990Aug 15 ;145(4) :1078-87.)，该方法实验流程复杂，重复性相 对欠缺；第三，检测T细胞对ICAMl等粘附分子的粘附性（如专利CN 102811739 A和EP 2510948 Al)，该体系同样需要分离原代细胞并存在实验流程复杂，重复性相对欠缺等问 题；第四，检测T细胞活化过程中相关分子的启动子驱动的报告基因的表达（如专利US 5474897 A ;以及参考文献：Schwarz EM et al. ,Proc Natl Acad Sci U S A. 1993Aug 15 ; 90(16):7734-8. ；Qiu D et al., J Biol Chem. 1999May 7 ；274(19):13443-50. ；Yang XY et al.,J Biol Chem. 2000Febl8 ；275 (7):4541-4. ；ffeaver JR et al.,Mol Immunol. 2007Apr ； 44(11) :2813-9.)，此类方法相对上述三种方法而言，具有快速、简便、重复性较好的特点。
[0004] 基于报告基因系统的在细胞水平对T细胞活化程度进行检测的方法，国内 目前尚无相关专利报道。国外已有报道的第四类检测手段中，US 5474897 A所提 供的实验体系中采用了 IL-2启动子中的⑶28RE驱动报告基因的表达，⑶28RE位 于IL-2转录起始位点上游-164到-154位（参考文献：Butscher WG et al·，J Biol Chem. 1998Jan 2 ;273(1) :552-60.)，而 IL-2 启动子包括-300 位到 +40 位，含有除 CD28 之外的多个反应元件，IL-2的转录表达受到这些反应元件的共同调控，仅用CD28E不 能很好的模拟并反映在外界刺激作用下T细胞活化后内源IL-2的转录表达情况；第 四类检测手段中另一类技术手段（如参考文献：Schwarz EM et al.，Proc Natl Acad Sci U S A. 1993Aug 15 ；90 (16) : 7734-8. ；Qiu D et al. , J Biol Chem. 1999May 7； 274(19):13443-50. ；Yang XY et al. , J Biol Chem. 2000Feb 18 ；275 (7):4541-4. ；ffeaver JR et al.，Mol Immunol. 2007Apr ;44 (II) :2813-9.)，使用的为 phorbol-12-myristate 13-acetate (PMA)+ionomycin类的组合刺激方式，PMA可以自由进入细胞膜，直接作用于细 胞内的PKC(蛋白激酶C) ;in〇n〇mycin为钙离子载体，使细胞外Ca2+内流，PKC和Ca2+产 生的信号共同作用于核内的转录因子，启动T细胞活化相关基因（如IL-2)的转录和蛋白 合成；该刺激方式作用快，但由于直接作用于T细胞活化信号通路的中下游，无法模拟肿瘤 免疫、自身免疫疾病及移植排斥反应等病理条件下T细胞的活化方式。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供了一种T细胞活化调节剂生 物学活性的报告基因检测方法，T细胞活化调节剂可促进或抑制T细胞激活，若此类调节 剂具备生物学活性，可通过检测此类调节剂来检测到T细胞活化程度的变化；本发明根据 T细胞活化需要第一信号和第二信号的同时激活，且该过程中的关键事件为IL-2表达上调 的机理，利用在第一信号和第二信号同时激活时可大量表达IL-2的T细胞Jurkat，全基因 合成IL-2启动子-329到+48位，将其连接至报告基因萤光素酶（Luciferase)上游，构建 IL-2启动子驱动的报告基因萤光素酶表达载体，将该表达载体电转染Jurkat细胞，通过转 染效率检测、加压筛选，获得带有IL-2启动子驱动的萤光素酶表达框架的稳定细胞株（以 下简称为Jurkat IL-2P Luc细胞株），在此基础上，使用CD3抗体和表达CD80/86的Raji 细胞作为上游刺激，对该细胞株的效应功能进行检测，并对该检测体系进行优化，对其特异 性和重复性进行了评估。本发明具有检测快速、操作简便、重复性好和灵敏度高的特点。
[0006] 为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
[0007] 本发明提供了一种T细胞活化调节剂生物学活性的报告基因检测方法；包括：
[0008] 步骤一 ：IL_2启动子驱动的报告基因载体的构建；
[0009] 步骤二：带有IL-2启动子驱动的报告基因的稳定细胞株的构建；
[0010] 步骤三：对T细胞活化调节剂的生物学活性进行检测；其检测方法包括：
[0011] 在⑶3抗体和表达⑶80/86的B细胞系Raji共同作用下，上述稳定细胞株被激 活，IL-2启动子驱动的萤光素酶报告基因表达上调，同步加入T细胞活化调节剂，通过检测 报告基因表达量，定量评估T细胞活化调节剂生物学活性。
[0012] 优选地，所述步骤一中，所述IL-2启动子驱动的报告基因载体的构建方法包括： 将IL-2启动子，从-329到+48位，构建至萤光素酶报告基因上游，用以驱动IL-2表达。
[0013] 更加优选地，所述步骤二中，带有IL-2启动子驱动的报告基因的所述稳定细胞株 的构建方法包括：所述细胞株为T细胞，T细胞被激活后，IL-2表达上调，同时，T细胞株转 染了 IL-2启动子驱动的萤光素酶报告基因，通过加压筛选和单克隆分离培养，用于T细胞 活化调节剂的生物学活性检测；
[0014] 其中，所述Jurkat为人急性T淋巴细胞白血病细胞；
[0015] 所述Raji为人B淋巴细胞瘤细胞；
[0016] 所述 PBMC，peripheral blood mononuclear cell 为外周血单个核细胞；
[0017] 所述 CD 为 cluster of differentiation，决定族分子；
[0018] 所述 PHA，phytohaemagglutinin 为植物血凝素；
[0019] 所述 PMA，phorbol-12-myristate 13-acetate 为佛波醋；
[0020] 所述Ionomycin为离子霉素；
[0021] 所述 IL-2, interleukin 2 为白细胞介素 2 ;
[0022] 所述 CD28RE，CD28response element 为 CD28 反应元件；
[0023] 所述 CTLA4, cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4 为细胞毒 T 淋巴细 胞相关抗原4 ;
[0024] 所述 Fe, crystalline fragment 为结晶片段。
[0025] 本发明与现有技术相比具有以下优点：
[0026] 国内尚无用报告基因检测法对T细胞活化调节剂生物学活性进行定量评估的实 验体系相关报道，本发明填补了这一空白；与使用原代T细胞进行检测的实验体系相比，本 发明所提供的检测方法，无需使用人外周血，解决了目前人外周血来源困难且不同人来源 的外周血所对应的实验结果一致性较差这一难题；同时无需分离原代T细胞，避免了繁琐 的PBMC分离及T细胞磁珠分选等流程，缩短实验流程，简化实验操作步骤；所使用的上游刺 激为⑶3抗体和表达⑶80/86的Raji细胞，与传统的PHA或PMA+ionomycin的刺激模式相 比，本发明所采用的这种刺激方式，更接近肿瘤免疫、自身免疫疾病及移植排斥反应等病理 情况下体内T细胞激活时的真实情况；同时我们选用了 T细胞活化过程中的关键事件IL-2 表达为检验点，选取IL-2启动子-329到+48位，用以驱动报告基因萤光素酶的表达，相较 于已有报道的实验体系中所采用的CD28RE (位于IL-2转录起始位点上游-164到-154位）， 其所含有的IL-2转录因子作用位点更为全面，能更加全面真实的反映 IL-2在转录水平激 活的状态，定量评估T细胞活化程度，进而对T细胞活化调节剂生物学活性进行定量检测； 该体系具有快速、操作简便、重复性好的特点，对T细胞活化调节剂质量控制和临床应用具 有重要意义。
[0027] 说明书附图
[0028] 图1示例性地示出了未转染质粒的Jurkat细胞通过流式细胞术检测的GFP表达 情况示意图；
[0029] 图2示例性地示出了转染GFP的Jurkat细胞通过流式细