一种用于鉴定紫花前胡的引物对及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，涉及中药及中药材鉴定领域，特别涉及一种用 于鉴定紫花前胡的引物对及其应用。
【背景技术】
[0002] 紫花前胡为伞形科植物紫花前胡Peucedanum decursivum(Miq. )Maxim.的干燥 根。药理研宄表明，紫花前胡挥发油的醇提物具有抑制癌细胞的生长和代谢作用。近年来， 紫花前胡药材因其独特的药理活性备受关注，市场上伪品也较多，如滨海前胡、碎叶山芹、 前胡、蕨叶藁本、异叶茴芹、石防风、短片藁本等。
[0003] 因紫花前胡药材与同科或同属混伪品的形态特征比较相近，外形鉴别比较困难， 采用传统的鉴定方法有一定的局限，因此，亟需寻找一种快速、准确的鉴定方法，以确保前 胡药材鉴定的准确性熊永兴等采用的DNA条形码技术对前胡及其混伪品进行鉴定（侯典 云、宋经元，杨培，周红，辛天怡，姚辉，基于ITS2序列鉴别前胡和紫花前胡药材及混伪品， 中国中药杂志，2014, 39 (21) :4186)，但该方法耗时较长，且使用大型仪器，不利于实现快 速、现场检测。
【发明内容】
[0004] 本发明的第一个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定紫花前胡的引物对。
[0005] 本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定紫花前胡的引物对为由序列表中序列1和 序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对。
[0006] 所述引物对中，两条单链DNA分子既可以分别单独包装，也可以按照摩尔比为1:1 的比例混合后包装在一起。
[0007] 本发明的第二个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定紫花前胡的试剂盒。
[0008] 本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定紫花前胡的试剂盒，具体可含有所述引物 对、dNTP和DNA聚合酶。
[0009] 制备所述引物对的方法也属于本发明的保护范围。
[0010] 制备所述引物对的方法，具体可包括将组成所述引物对的两条单链DNA分子分别 单独包装的步骤。
[0011] 制备所述试剂盒的方法也属于本发明的保护范围。
[0012] 制备所述试剂盒的方法，具体可包括如下步骤：将组成所述引物对的两条单链 DNA分子分别单独包装后，与分别单独包装的dNTP和DNA聚合酶包装于同一个试剂盒内。
[0013] 所述引物对或所述试剂盒在鉴定或辅助鉴定紫花前胡中的应用也属于本发明的 保护范围。
[0014] 本发明的第三个目的是提供一种利用所述引物对或所述试剂盒鉴定或辅助鉴定 待测样品中是否含有紫花前胡的方法。
[0015] 本发明所提供的利用所述引物对或所述试剂盒鉴定或辅助鉴定待测样品中是否 含有紫花前胡的方法，具体可包括如下步骤：
[0016] (a)从待测样品中提取基因组DNA作为模板，采用所述引物对进行PCR扩增；
[0017] (b)根据步骤（a)所得PCR产物的大小，按照如下方法确定所述待测样品中是否含 有紫花前胡：若PCR产物中含有200-300bp (如252bp)的DNA片段，则所述待测样品中含有 或候选含有紫花前胡；若PCR产物中不含有200-300bp (如252bp)的DNA片段，则所述待测 样品中不含有或候选不含有紫花前胡。
[0018] 在所述方法中，所述紫花前胡为中药材。当然所述方法也可以用于检测紫花前胡 的基原植物--紫花前胡Peucedanum decursivum(Miq. )Maxim.。相应的，所述待测样品既 可为单一或混合的中药材成品，也可以为植株或取自所述植株的组织或器官。
[0019] 本发明的第四个目的是提供一种利用所述引物对或所述试剂盒鉴定或辅助鉴定 待测样品为紫花前胡，还是前胡、毛前胡、信前胡、滨海前胡、华中前胡、石防风、短片藁本、 碎叶山芹、蕨叶藁本和异叶茴芹中的任一种的方法。
[0020] 本发明所提供的利用所述引物对或所述试剂盒鉴定或辅助鉴定待测样品为紫花 前胡，还是前胡、毛前胡、信前胡、滨海前胡、华中前胡、石防风、短片藁本、碎叶山芹、蕨叶藁 本和异叶茴芹中的任一种的方法，具体可包括如下步骤：
[0021] (a)从待测样品中提取基因组DNA作为模板，采用所述引物对进行PCR扩增；
[0022] (b)根据步骤（a)所得PCR产物的大小，按照如下方法确定所述待测样品为紫花前 胡，还是前胡、毛前胡、信前胡、滨海前胡、华中前胡、石防风、短片藁本、碎叶山芹、蕨叶藁本 和异叶茴芹中的任一种：若PCR产物中含有200-300bp的DNA片段，则所述待测样品为或候 选为紫花前胡；若PCR产物中不含有200-300bp的DNA片段，则所述待测样品为或候选为前 胡、毛前胡、信前胡、滨海前胡、华中前胡、石防风、短片藁本、碎叶山芹、蕨叶藁本和异叶茴 芹中的任一种；
[0023] 所述待测样品为紫花前胡、前胡、毛前胡、信前胡、滨海前胡、华中前胡、石防风、短 片藁本、碎叶山芹、蕨叶藁本和异叶茴芹中的任一种（既可为中药材也可为基原植物）。
[0024] 在上述两方法的步骤（a)中，进行所述PCR扩增时采用的退火温度可为55°C。
[0025] 在本发明中，进行所述PCR扩增时采用的具体反应条件如下：95 °C 5min ; 95°〇258,55°〇3〇8,72°〇3〇8,25个循环；72°〇1〇11^11。
[0026] 在上述两方法的步骤（a)中，在进行所述PCR扩增的反应体系中，所述引物对中每 条单链DNA分子的终浓度均为400nM。
[0027] 在本发明中，进行所述PCR扩增时采用的具体反应体系如下：0. 5yL模板 0嫩，1.04 1^序列1所示的引物（10?111〇1)，1.(^1^序列2所示的引物（10?111〇1)，2.54 1^ IOXbuffer 缓冲液，I. 5yL 浓度为 25mM 的 MgCljK溶液，0. 5yL 浓度为 IOmM 的 dNTPs， 0· 5 μ L Taq DNA聚合酶（5U/ μ L)，无菌双蒸水补足至25 μ L。
[0028] 在上述两方法中，所述200-300bp (如252bp)的DNA片段在琼脂糖凝胶电泳图谱 上位于DNA分子量标准200和300bp之间。
[0029] 在实际应用中，判断所述PCR产物中是否含有200-300bp (如252bp)的DNA片段， 可通过将所述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳进行检测，若电泳结果显示含有200-300bp (如 252bp)目的条带，则所述PCR产物中含有200-300bp (如252bp)的DNA片段；反之，则不含 有200-300bp (如252bp)的DNA片段。当然也通过测序的方法判定所述PCR产物中是否含 有 200-300bp (如 252bp)的 DNA 片段。
[0030] 在本发明中，所述200-300bp (如252bp)的DNA片段为252bp的DNA片段，具体为 序列3所示的DNA片段。
[0031] 实验证明，采用本发明所提供的引物，通过快速PCR方法实现了紫花前胡与前胡、 毛前胡、信前胡等混伪品的快速、准确鉴别，实现药材分子鉴别的现场运用提供技术支撑。
【附图说明】
[0032] 图1为紫花前胡及混淆品的系统发育树。其中，谱系分支节点上方为BI树的后验 概率PP和MP树的自举支持度BS，在斜线的左边为PP值，斜线的右边为BS值。
[0033] 图2为特异性PCR引物对ZHQH-CP3 (上下游引物分别为ZHQH-CP3s和ZHQH-CP3a) 扩增凝胶电泳图。M:DNA分子标准（DNA Marker，从上到下依次为600、500、400、300、200和 IOObp) ;1到5 :用特异性PCR引物对ZHQH-CP3扩增5个紫花前胡样本的结果；6到10 :用 特异性PCR引物对ZHQH-CP3扩增5个前胡（白花前胡）样本的结果；11到15 :用特异性 PCR引物对ZHQH-CP3扩增5个毛前胡（药材）样本的结果；16到20 :用特异性PCR引物对 ZHQH-CP3扩增5个信前胡（药材）样本的结果。
[0034] 图3为特异性PCR引物对ZHQH-CP3 (上下游引物分别为ZHQH-CP3s和ZHQH-CP3a) 扩增凝胶电泳图。M:DNA分子标准（DNA Marker，从上到下依次为600、500、400、300、200和 IOObp) ;1 到 7 :紫花前胡 DNA 模板浓度依次为 144ng/yl、72ng/yl、36ng/yl、18ng/yl、 9ng/ μ 1、4· 5ng/ μ 1 和 2. 25ng/ μ 1 ;8 到 14 :前胡 DNA 模板浓度依次为 144ng/ μ l、72ng/ μ l、36ng/ μ l、18ng/ μ l、9ng/ μ 1、4· 5ng/ μ 1 和 2. 25ng/ μ 1 ;15 到 21 :信前胡 DNA 模板浓 度依次为 144ng/ μ l、72ng/ μ l、36ng/ μ l、18ng/ μ l、9ng/ μ 1、4· 5ng/ μ 1 和 2. 25ng/ μ 1 ; 22 到 28 :毛前胡 DNA 模板浓度依次为 144ng/ μ l、72ng/ μ l、36ng/ μ l、18ng/ μ l、9ng/ μ 1、 4· 5ng/ μ 1 和 2· 25ng/ μ 1。
【具体实施方式】
[0035] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0036] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0037] 实施例1、用于鉴定紫花前胡的试剂盒的制备及使用方法
[0038] 一、用于鉴定紫花前胡的引物对的设计与合成
[0039] 从GenBank查找紫花前胡及混淆品的ITS序列，详见下表1。
[0040] 表1紫花前胡及混淆品的ITS序列
[0041]
[0042]
[0043]分别用贝叶斯法（Bayesian inference, BI)和简约法（maximum parsimony, MP) 进行系统发育分析，构建BI和MP两种系统树。其中BI树用MrBayes version 3. I. 2软件 构建，MP 树用 PAUP*version 4. Obeta 10 软件构建。构建 BI 树时，用 MrModeltest version 2. 3软件根据AIC(Akaike Information Criterion)检验标准选择数据的最适模型，所选 最适模型是（GTR+I+G)。马尔科夫链的蒙特卡洛方法（Markov Chains Monte Carlo, MCMC) 设置为四条链并运行500000代。为了确定其收敛情况，MCMC分别运行两次。每100代抽 取一个样本，共形成10002个样本。经过分析得知，整个运行在20000代后达到平稳，这样， 总共剩余的样本数为9602,用剩余样本重建系统树并估计其后验概率值。构建MP树时，设 置自举重复次数bootstrap nr印s为1000次，使用启发式搜索分析自举重复数据集，启发 式搜索设置为由随机逐步添加法产生起始树，重复10次，采用TBR分支交换。通过BI法 和MP法构建的系统发育树表明，2种方法构建的系统树完全一致（图1)。图1中各谱系分 支的节点处标有BI树的后验概率（posterior probability, PP)值和MP树的自举支持度 (Bootstrap, BS)。结果表明，前胡所有序列的单倍型形成单系（PP = L 00, BS = 99)。 [0044] 在确定前胡为单系群的前提下，用软件Clustal X 1. 81对表1中所有ITS序列进 行对位排序和比较，找到差异