片段，发现在紫花前胡ITSl和ITS2之间的5. 8S rRNA序列的 第12bp处为T，而其他混淆品均为C。根据以上特有的变异位点设计紫花前胡的特异性PCR 引物，如下：
[0045] ZHQH-CP3s :5' -CACGCATCGTATTGCaT-3'（序列 1);
[0046] ZHQH-CP3a :5' -TAGTCCCGCCTGACCTG-3'（序列 2)。
[0047] 理论PCR产物长度为252bp (序列3)。
[0048] 二、用于鉴定紫花前胡的试剂盒的组装
[0049] 将步骤一设计合成的引物ZHQH-CP3S和ZHQH_CP3a分别单独包装后，与分别单独 包装的dNTP、DNA聚合酶、IOXbuffer缓冲液等包装于同一个试剂盒内，即得到本发明用于 鉴定紫花前胡的试剂盒。
[0050] 三、鉴定待测样品中是否含有紫花前胡的方法
[0051] 采用步骤二的试剂盒按照包括如下步骤的方法鉴定待测样品中是否含有紫花前 胡：
[0052] 1、PCR 扩增
[0053] 从待测样品中提取基因组DNA作为模板，采用步骤一设计合成的引物ZHQH-CP3S 和ZHQH-CP3a (序列1和序列2)按照如下进行PCR扩增：
[0054] PCR反应总体积25 μ L，包括以下试剂：0. 5 μ L模板DNA，I. 0 μ L上游引物 (IOpmol)，I. 0 μ L 下游引物（IOpmol)，2. 5 μ L 10 Xbuffer 缓冲液，1. 5 μ L 浓度为 25mM 的 MgCljK溶液，0· 5 μ L浓度为IOmM的dNTPs，0· 5 μ L Taq DNA聚合酶（5U/ μ L)，无菌双蒸水 补足至25 μ L。
[0055] PCR反应液配制完后，轻轻震荡混匀，将PCR管放入PCR仪中，进行PCR扩增，具体 反应条件如下：95°〇5111丨11 ;95°〇258,55°〇3〇8,72°〇3〇8,25个循环；72°〇1〇11^11。
[0056] 2、PCR产物检测
[0057] 采用琼脂糖凝胶电泳法检测PCR产物，具体如下：
[0058] 取5 μ L扩增产物，采用2 %的琼脂糖凝胶，在电压80-90V下电泳30分钟，凝胶成 像系统下观察并拍照。根据目的条带的大小，按照如下方法确定待测样品中是否含有紫花 前胡：若获得大小约为252bp的目的条带（序列3)，则所述待测样品中含有紫花前胡；若没 有获得大小为252bp的目的条带（序列3)，则所述待测样品中不含有紫花前胡。
[0059] 实施例2、采用实施例1制备的试剂盒鉴定紫花前胡的特异性分析
[0060] 待测样品：紫花前胡（采自于安徽金寨）、前胡（采自于安徽宁国）、毛前胡（购 自于安徽亳州药材市场）和信前胡（购自于安徽亳州药材市场）。均符合中国药典（2010 年版）一部正文各药材项下的有关规定。通过鉴定，各味药材实物与名称相符，质量符合标 准。
[0061] -、从待测样品中提取基因组DNA
[0062] 分别取约50mg干燥样品（当然也可采用IOOmg新鲜样品进行基因组DNA提取）， 用CTAB法提取总DNA。具体如下：
[0063] 将无霉变的干燥药材置于粉碎机中研磨粉碎，过40目筛。将粉末转移到2. OmL的 微量离心管中，加入90(^1^已灭菌的0^提取液（配方：2%(28/10〇1111)0^，10〇111111〇1/1 Tris-HCl pH = 8.0, 20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl)、0.02g PVP 40000、10 μ L0-巯基乙 醇充分振荡混匀，65°C水浴I. 5h-2h，期间轻摇2-3次。结束后取出冷却至室温，加入900 μ L 氯仿-异戊醇（体积比24 :1)，充分振荡混勾，12000g离心10min。取上清，加入等体积氯 仿-异戊醇（体积比24 :1)，充分振荡混勾，12000g离心10min。取上清，加入2/3体积预冷 的异丙醇溶液，-20°C放置0. 5h以上。取出，12000g离心10min，弃上清，沉淀用70% (体 积分数）乙醇洗涤两次，37°C挥干乙醇，用适量灭菌水溶解，_20°C保存。
[0064] 用通用引物QH-TYls和QH-TYla检测以上提取的紫花前胡、前胡、毛前胡、信前胡 的基因组DNA质量。
[0065] ZHQH-TYIs : 5 ' -CGGATATCTCGGC-3 ' ；
[0066] ZHQH-TYla :5, -CAACTTGCGTTCAA-3,。
[0067] 反应总体系为25 μ L，包括DNA模板(λ 5 μ L (5-50ng)，上游引物1 μ L (IOpmol)，下 游引物 1 μ L(IOpmol)，10XPCR Buffer 2. 5 μ L，MgCl2 (25mM) 1. 5 μ L，dNTPs (IOmM)O. 5 μ L， Taq DNA聚合酶（5U/yL)0. 5yL，ddH20补足至25yL。通用引物PCR反应条件为：95°C5min、 25 个循环（每个循环包括 95°C 30s，55°C 30s，72°C 30s)、72°C lOmin。
[0068] 结果发现所有样品均能扩增出DNA条带。
[0069] 二、PCR 扩增
[0070] 以步骤一从待测样品中提取的基因组DNA为模板，采用实施例1步骤一设计的引 物对（引物ZHQH-CP3S和ZHQH-CP3a)进行PCR扩增。具体的反应体系和反应条件同实施 例1步骤三1。实验同时设置以双蒸水为模板作为阴性对照。实验重复三次。
[0071] 反应结束后，按照实施例1中步骤三2的方法对待测样品进行鉴定。
[0072] 结果如图2所示，从图中可以看出：
[0073] 利用本发明的引物对（引物ZHQH-CP3S和ZHQH_CP3a)对紫花前胡、前胡、毛前胡 和信前胡进行检测，紫花前胡能够扩增出片段大小约为252bp的目的条带。而前胡、毛前胡 和信前胡未扩增出目的条带。这表明该反应体系能将紫花前胡与前胡、毛前胡和信前胡准 确的鉴别出来。将大小约为252bp的目的条带回收测序，其序列正为序列表中序列3。
[0074] 实施例3、采用实施例1制备的试剂盒鉴定紫花前胡的灵敏度分析
[0075] 待测样品：紫花前胡（采自于安徽金寨）。符合中国药典（2010年版）一部正文 各药材项下的有关规定。通过鉴定，各味药材实物与名称相符，质量符合标准。
[0076] 一、从待测样品中提取基因组DNA
[0077] 分别取约50mg干燥样品（当然也可采用IOOmg新鲜样品进行基因组DNA提取）， 用CTAB法提取总DNA。具体参照实施例2步骤一进行。
[0078] 二、PCR 扩增
[0079] 将步骤一从紫花前胡中提取的基因组DNA进行倍比稀释，得到基因组DNA模板浓 度分别为 144ng/ μ l、72ng/ μ l、36ng/ μ l、18ng/ μ l、9ng/ μ 1、4· 5ng/ μ 1 和 2. 25ng/ μ 1 的 系列稀释液，以各稀释液分别为模板，采用实施例1步骤一设计的引物对（引物ZHQH-CP3s 和ZHQH-CP3a)进行PCR扩增。具体的反应体系和反应条件同实施例1步骤三1。实验同时 设置以双蒸水为模板作为阴性对照。实验重复三次。
[0080] 反应结束后，按照实施例1中步骤三2的方法对待测样品进行鉴定。
[0081] 结果如图3所示，从图中可以看出：
[0082] 利用本发明的引物对（引物ZHQH-CP3S和ZHQH_CP3a)对紫花前胡进行检测，当模 板浓度为18ng/ μ 1时仍能够检测到大小约为252bp的目的条带，但模板浓度为36ng/ μ 1 时，在PCR扩增为25循环的条件情况下，条带较亮。将大小约为252bp的目的条带回收测 序，其序列正为序列表中序列3。
【主权项】
1. 用于鉴定或辅助鉴定紫花前胡的引物对，其特征在于：所述引物对为由序列表中序 列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对。2. 用于鉴定或辅助鉴定紫花前胡的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有权利要求 1所述的引物对、dNTP和DNA聚合酶。3. 制备权利要求1所述引物对的方法，包括将组成所述引物对的两条单链DNA分子分 别单独包装的步骤。4. 制备权利要求2所述试剂盒的方法，包括如下步骤：将组成所述引物对的两条单链 DNA分子分别单独包装后，与分别单独包装的dNTP和DNA聚合酶包装于同一个试剂盒内。5. 权利要求1所述的引物对或权利要求2所述的试剂盒在鉴定或辅助鉴定紫花前胡中 的应用。6. 利用权利要求1所述的引物对或权利要求2所述的试剂盒鉴定或辅助鉴定待测样品 中是否含有紫花前胡的方法，包括如下步骤： (a) 从待测样品中提取基因组DNA作为模板，采用权利要求1所述的引物对进行PCR扩 增； (b) 根据步骤（a)所得PCR产物的大小，按照如下方法确定所述待测样品中是否含有紫 花前胡：若PCR产物中含有200-300bp的DNA片段，则所述待测样品中含有或候选含有紫花 前胡；若PCR产物中不含有200-300bp的DNA片段，则所述待测样品中不含有或候选不含有 紫花前胡。7. 利用权利要求1所述的引物对或权利要求2所述的试剂盒鉴定或辅助鉴定待测样品 为紫花前胡，还是前胡、毛前胡、信前胡、滨海前胡、华中前胡、石防风、短片藁本、碎叶山芹、 蕨叶藁本和异叶茴芹中的任一种的方法，包括如下步骤： (a) 从待测样品中提取基因组DNA作为模板，采用权利要求1所述的引物对进行PCR扩 增； (b) 根据步骤（a)所得PCR产物的大小，按照如下方法确定所述待测样品为紫花前胡， 还是前胡、毛前胡、信前胡、滨海前胡、华中前胡、石防风、短片藁本、碎叶山芹、蕨叶藁本和 异叶茴芹中的任一种：若PCR产物中含有200-300bp的DNA片段，则所述待测样品为或候选 为前胡；若PCR产物中不含有200-300bp的DNA片段，则所述待测样品为或候选为前胡、毛 前胡、信前胡、滨海前胡、华中前胡、石防风、短片藁本、碎叶山芹、蕨叶藁本和异叶茴芹中的 任一种； 所述待测样品为紫花前胡、前胡、毛前胡、信前胡、滨海前胡、华中前胡、石防风、短片藁 本、碎叶山芹、蕨叶藁本和异叶茴芹中的任一种。8. 根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：在步骤（a)中，进行所述PCR扩增时 采用的退火温度为55 °C。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于：进行所述PCR扩增时采用的扩增程序为： 95。〇51^11;951：258,551：3〇8,721：3〇8,25个循环 ；721：1〇111111。10. 根据权利要求6-9中任一所述的方法，其特征在于：所述200-300bp的DNA片段为 252bp的DNA片段； 所述252bp的DNA片段具体为序列表中序列3所示的DNA片段。
【专利摘要】本发明公开了一种用于鉴定紫花前胡的引物对及其应用。本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定紫花前胡的引物对，具体为由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对。实验证明，采用本发明所提供的引物，通过快速PCR方法实现了紫花前胡与前胡、毛前胡、信前胡等混伪品的快速、准确鉴别，实现药材分子鉴别的现场运用提供技术支撑。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN104894270
【申请号】CN201510315809
【发明人】黄璐琦, 袁媛, 赵群
【申请人】中国中医科学院中药研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月10日