DNA分子来自多个受试样品时，每个样品被加上不同的标签序 列（barcode)，以用于在测序过程中进行样品的区分（Micah Hamady, Jeffrey J Walker, J Kirk Harris et al. Error-correcting barcoded primers forpyrosequencing hundreds of samples in multiplex. Nature Methods, 2008, 5 (3))，从而实现同时对多个样品进行测 序。
[0044] 本发明中，基因组参考序列可以来自公共数据库。例如，人类基因组序列可以是 NCBI或者UCSC数据库中的人类基因组参考序列。
[0045] 本发明中，序列比对可以通过任何一种序列比对程序，例如本领域技术人员可获 得的 Torrent Mapping Alignment Program(TMAP)和 Burrow-Wheeler-Aligner (BWA)进行 比对，将读段与参考基因组序列比对，得到读段在参考基因组上的位置。
[0046] 优选地，利用Torrent_Server_4. 0_VM软件对PGM测序仪产生的原始数据去除接 头序列，用Tmap软件比对到人类hgl9参考基因组，最后分析单体型SNP覆盖倍数和基因 型。
[0047] 本发明可用于对适用人群进行α -地贫基因诊断和胚胎移植前诊断，有利于提供 遗传咨询和提供临床决策依据。α -地贫基因诊断、胚胎移植前诊断、产前诊断可有效防止 α-地贫患儿出生。本发明适用人群可以是α-地贫携带者和患者。
[0048] 上述适用人群举例仅用于本发明，而不应为限定本说明的范围。
[0049] 在一个特定的实施方案中，本发明的体外检测胚胎α -地中海贫血突变的方法包 括以下步骤：
[0050] (1)将获自体外培养的囊胚的滋养层细胞经全基因组扩增对细胞中的基因组DNA 进行富集；
[0051] (2)磁珠纯化全基因组扩增产物；
[0052] (3)提取夫妻双方全血DNA ;
[0053] (4)利用本发明的引物组合物进行多重PCR扩增富集单体型目标区域DNA ;
[0054] (5)纯化PCR产物，并测序；
[0055] (6)将步骤（4)中测定的胚胎和夫妻双方的DNA序列进行比对，判断胚胎的单体 型；
[0056] (7)将步骤（4)中测定的DNA序列与正常样本参考序列（例如人类hgl9参考基因 组序列）进行比对，分析目标位点覆盖倍数和基因型。
[0057] 在另一个特定的实施方案中，本发明的体外检测胚胎α -地中海贫血突变的方法 包括以下步骤：
[0058] (1)将获自体外培养的囊胚的滋养层细胞经全基因组扩增对细胞中的基因组DNA 进行富集；
[0059] (2)磁珠纯化全基因组扩增产物；
[0060] (3)利用本发明的引物组合物进行多重PCR扩增富集目标区域DNA ;
[0061] (4)纯化PCR产物，并测序；
[0062] (5)将步骤（3)中测定的DNA序列结果与正常样本参考序列（例如人类hgl9参考 基因组序列）进行比对，判断样本的基因型。
[0063] 五、胚胎植入前筛选
[0064] 本发明还提供了 α -地中海贫血致病基因突变的胚胎植入前筛选方法。
[0065] 在一个特定的实施方案中，所述胚胎植入前筛选方法包括以下步骤：
[0066] (1)将获自体外培养的囊胚的滋养层细胞经全基因组扩增对细胞中的基因组DNA 进行富集；
[0067] (2)磁珠纯化全基因组扩增产物；
[0068] (3)提取夫妻双方全血DNA ;
[0069] (4)利用本发明的引物组合物进行多重PCR扩增富集单体型目标区域DNA ;
[0070] (5)纯化PCR产物，并测序；
[0071] (6)将步骤（4)中测定的胚胎和夫妻双方的DNA序列进行比对，判断胚胎的单体 型；
[0072] (7)将步骤（4)中测定的DNA序列与正常样本参考序列（例如人类hgl9参考基因 组序列）进行比对，分析目标位点覆盖倍数和基因型；
[0073] (8)选择不携带α -地中海贫血致病基因突变的胚胎用于子宫植入。
[0074] 在另一个特定的实施方案中，所述胚胎植入前筛选方法包括以下步骤：
[0075] (1)将获自体外培养的囊胚的滋养层细胞经全基因组扩增对细胞中的基因组DNA 进行富集；
[0076] (2)磁珠纯化全基因组扩增产物；
[0077] (3)利用本发明的引物组合物进行多重PCR扩增富集目标区域DNA ;
[0078] (4)纯化PCR产物，并测序；
[0079] (5)将步骤（3)中测定的DNA序列结果与正常样本参考序列（例如人类hgl9参考 基因组序列）进行比对，判断样本的基因型；
[0080] (6)选择不携带α -地中海贫血致病基因突变的胚胎用于子宫植入。
[0081] 六、技术效果
[0082] 本发明的优点主要有以下几方面：
[0083] (1)通用性：本发明的方法对SEA缺失区域拷贝数和26个SNP进行分析，可用于 基因诊断和不同配偶的胚胎移植前诊断。
[0084] (2) SEA缺失区域和多位点SNP测序：基于第二代测序技术，本发明可以对SEA缺 失区域和HBAl基因附近的多个SNP进行分析，不需依赖已知的探针和设计探针。
[0085] (3)高通量：基于高通量测序技术，本发明可以高通量地进行α -地贫突变的检 测，通过在每个样品上加上不同的标签序列，可以一次地对大量样品进行分析。
[0086] (4)成本低：随着测序技术的不断发展和测序成本的不断降低，本发明对α -地贫 突变分析的成本也在不断下降。
[0087] (5)高灵敏度：可用于3~5个细胞的分析。因此适合于试管婴儿技术中胚胎移 植前的检测。
[0088] (6)特异性：本发明选取千人基因组计划数据（http://www. ncbi. nlm. nih. gov/variation/tools/1000 genomes/)中 HBAl 基因上下游 IMb 范围内 CHB (北方汉人） 和CHS(南方汉人）最小等位基因频率均大于0.2的高频多态性位点，去除多聚核苷酸 (polyN)和位点上下游50bp序列中GC含量>70%的多态性位点，并选择unique比对到人 类基因组hgl9的43个SNP位点和SEA缺失区域作为目标区域设计了共110对引物，这些 引物具有很高的特异性。
【附图说明】
[0089] 图1为单体型检测结果。其中，F代表父本来源的DNA链，M代表母本来源的DNA 链，Syq系列为胚胎，*代表没有碱基，突出显示的*(*)代表缺失区域，突出显示的白色字母 (例如C)代表基因脱扣、重组造成的不符合遗传规律的碱基。图IA :父亲（Fl和F2都为正 常链）；图IB :母亲（Ml为3. 7缺失致病链，M2为SEA缺失致病链）；图IC :Syq_l (Fl为正 常链，M2为SEA缺失致病链）；图ID :Syq_2 (Fl为正常链，M2为SEA缺失致病链）；图IE : Syq_4 (F2为正常链，Ml为3. 7缺失致病链）；图IF :Syq_5 (Fl为正常链，M2为SEA缺失致病 链）；图IG :Syq_7 (F2为正常链，Ml为3. 7缺失致病链）；图IH :Syq_8 (F2为正常链，Ml为 3·7缺失致病链）；图lI:Syq_10(Fl为正常链，M2为SEA缺失致病链）；图lJ :Syq_ll(Fl 为正常链，Ml为3. 7缺失致病链）；图lK:Syq_12(F2为正常链，Ml为3. 7缺失致病链）；图 IL :Syq_15 (F2为正常链，Ml为3. 7缺失致病链）。
[0090] 图2为4例α -地贫患者的基因检测结果。横坐标sea代表SEA缺失区域，4. 2代 表4. 2kb缺失区域，3. 7代表3. 7kb缺失区域，4. 2/3. 7代表4. 2kb缺失区域和3. 7kb缺失 区域的重叠区域。
【具体实施方式】
[0091] 下面通过实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中使 用的组分，除特殊说明外，均选用
【发明内容】
中的优选方案。实施例中未注明具体条件的实验 方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0092] 实施例1 10例胚胎α -地贫胚胎移植前检测
[0093] 一、建库和测序
[0094] 按照全基因组扩增方法，获取10例母亲基因检测为-3. 7/-SEA的α -地贫患者 的胚胎样本细胞 DNA，用 Qubit(Invitrogen，the Quant-iTTM dsDNA HS Assay Kit)定量， 并分离IOng进行后续实验。
[0095] 使用本发明的优选引物组（表1中的全部引物对1~110)，按照Ion AmpliSeqTMLibrary Kits 2.0标准建库流程进行建库标准建库流程进行建库。简而言之， 多重PCR扩增产物的DNA分子两端加上测序所用的接头，在一定条件下使核酸分子成簇生 长，然后在Ion Torrent PGM上测序，得到片段长度分布在125bp~275bp的目标区域DNA 片段序列。
[0096] 本实施例中，对于获自上述10例胚胎细胞的DNA样品按照Ion Torrent官方公布 的测序说明书进行操作。
[0097] 二、比对与统计
[0098] 利用Torrent_Server_4. 0_VM软件对PGM测序仪