定量PCR反应的Ct平均值为35. 19 ;7个拷贝的IL-6基因其荧光定 量PCR反应的Ct平均值为31. 46。因此，本发明提供的荧光定量PCR方法具有很好的敏感 性。
[0124] 3. 5重复性试验
[0125] 批内重复试验：取5个不同梯度的各基因质粒标准品，分别设3个重复同时进行实 时荧光定量PCR ;批间重复试验：取5个不同梯度的各基因质粒标准品，在同一条件下不同 时间点重复进行3次实时荧光定量PCR。结果表明本发明提供的荧光定量PCR方法批内和 批间检测的Ct值变异系数均在合理范围内（5% )，方法的重复性好。
[0126] 实施例 4 荧光定量 PCR 方法用于 IFN- a，IFN- β，IFN- γ，IL-I β，IL-2 和 IL-6 基因的绝对定量
[0127] 本发明提供的荧光定量PCR标准曲线可以分别用作待检样品中鸡IFN-α， IFN-β，IFN-γ，IL-I β，IL-2 和 IL-6 的绝对定量。
[0128] 比如，若待测样品IFN-α检测的Ct值（Y)为25,则X = (37. 90-25)/3. 352 = 3. 85,则其所含的IFN-α基因拷贝数（l〇x) = 7· IX 103。
[0129] 若待测样品 IFN-β 检测的 Ct 值（Y)为 25,，则 X = (35. 43-25)/3. 276 = 3. 18， 则其所含的IFN-β基因拷贝数（IOx) = 1.5X103。
[0130] 若待测样品 IFN- γ 检测的 Ct 值（Y)为 25,则 X = (35. 97-25) /3. 223 = 3. 40,则 其所含的IFN-γ基因拷贝数（IOx) = 2. 5X 103。
[0131] 若待测样品 IL-I β 检测的 Ct 值（Y)为 25,则 X = (37. 03-25)/3. 598 = 3. 34,则 其所含的IL-I β基因拷贝数（IOx) = 2. 2X 103。
[0132] 若待测样品 IL-2 检测的 Ct 值（Y)为 25,则 X = (39. 50-25) /3. 586 = 4. 04,则其 所含的IL-2基因拷贝数（IOx) = I. I X 104。
[0133] 若待测样品 IL-6 检测的 Ct 值（Y)为 25,则 X = (36. 24-25) /3. 234 = 3. 48,则其 所含的IL-6基因拷贝数（IOx) = 3. OX 103。
[0134] 实施例 5 荧光定量 PCR 方法用于鸡 IFN- α，IFN- β，IFN- γ，IL-I β，IL-2 和 IL-6 的相对定量检测
[0135] 5.1 方法
[0136] 5. I. 1鸡胚实验和样品的采集和处理
[0137] 11日龄的SPF鸡胚8枚，收集其中4枚鸡胚的尿囊液各lmL，合并为1份检测样 品（Oh)。另外4枚鸡胚经尿囊腔途径各接种一株新城疫病毒强毒株0.2mL，然后在病毒 接种后24h收集鸡胚尿囊液各lmL，合并作为第二份检测样品（24h)。提取两份样品的总 RNA (Trizol法），溶解于20 μ L的TE缓冲液。使用随机引物及反转录试剂盒将RNA反转录 合成cDNA，保存于-20°C备用。
[0138] 5. 1. 2相对定量法检测病毒接种后鸡胚尿囊液中IFN-α，IFN-β，IFN-γ， IL-I β，IL-2和IL-6水平的变化
[0139] 使用建立的荧光定量PCR方法检测淋巴细胞cDNA样品的IFN-a，IFN-β，IFN-γ， IL-I β，IL-2和IL-6水平，以细胞肌动蛋白（Actin)作为内参照（Reference)基因。每个 样品做3个重复。通过相对定量法（2_AAet)分析病毒接种后各基因表达水平的动态变化。
[0140] 5. 2 结果
[0141] 血液样品中IFN-a ,IFN-β ,IFN-γ ,IL-Ιβ，IL-2和IL-6水平的荧光定量PCR检 测结果见表7。由表7可见，在病毒接种后24h，IFN- a，IFN- γ和IL-2的表达水平分别比 病毒接种前高出39. 67倍，5. 43倍和4. 56倍，而其余几种细胞因子的表达则相对下降（图 19) 〇
[0142] 表7鸡胚尿囊液样品中细胞因子表达水平的荧光定量PCR检测结果
[0143]
[0144] Note: Λ Ct:Ct (Target)-Ct (Reference) ;ΛΛ Ct: Λ Ct (24h)_ Λ Ct (Oh)
[0145]
【主权项】
1. 一种检测鸡免疫相关细胞因子的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，包括六对特异 性引物，所述特异性引物的核苷酸序列分别为： 引物对一： IFN-a Chicken-U :5'-GCTCACGCTCCTTCTGAA-3'； IFN-a Chicken-L :5'-TGTTGCTGGTGTCCAGG-3' 引物对二： IFN-0 Chicken-U :5'-AGGACAAGAAGCAAGCAAG-3'； IFN-0 Chicken-L :5'-TGCCTTGGTTTACGAAGCATT-3' 引物对三： IFN-y Chicken-U :5,-GACAAGTCAAAGCCGCACAT-3，； IFN-y Chicken-L :5'-GTTCATCGGGACCTTGGCCA-3' 引物对四： IL-I0 Chicken-U :5'-AGGCTCAACATTGCGCTG-3'； IL-I0 Chicken-L :5'-CCAGGCGGTAGAAGATGA-3' 引物对五： IL-2Chicken-U :5'-CTGTATTTCGGTAGCAAC-3'； IL-2Chicken-L :5'-CACTCCTGGGTCTCAGTTGGT-3' 引物对六： IL-6Chicken-U :5'-TGCAAGAAGTTCACCGTGT-3'； IL-6Chicken-L :5'-CAGGTAGGTCTGAAAGGCG-3'。2. 如权利要求1所述的一种检测鸡免疫相关细胞因子的荧光定量PCR试剂盒，其特征 在于，还包括鸡IFN-a，IFN-0，IFN-y，IL-I 0，IL-2和IL-6质粒标准品。3. 权利要求1或2所述的试剂盒在制备检测鸡免疫相关细胞因子的转录水平试剂中的 应用。4. 如权利要求1或2所述的试剂盒在检测鸡免疫相关细胞因子IFN-a，IFN-0， IFN-y，IL-I 0，IL-2和IL-6水平的绝对定量或相对定量中的应用。5. 权利要求1或2所述试剂盒检测鸡IFN- a，IFN- 0，IFN- y，IL-I 0，IL-2和IL-6 的荧光定量PCR方法，包括以下步骤， a. 待检样品cDNA的制备： 首先提取待检样品的RNA，然后使用随机引物进行反转录反应，制备样品的cDNA ; b. 配制PCR反应体系： PCR扩增反应的体系为20yl，包括：2X荧光定量PCR预混液IOy 1，IOyM上游引物 I y 1，10 y M下游引物I y 1，荧光定量PCR缓冲液2 y 1，DNA模板2 y 1和CldH2O 4 y 1 ; c. 设定PCR扩增反应的程序为： 95°C预变性2. 5分钟；95°C 7秒，55°C 10秒，72°C 15秒扩增45个循环，每个循环结束 时检测荧光；熔解曲线分析为95°C 15秒，60°C 50秒，95°C continuous ;最后37°C 30秒结 束； d. 结果分析： 调整荧光定量PCR的扩增基线和阈值设定，以阈值线不低于正常阴性对照扩增曲线的 最高点为准，在阳性对照质粒标准品为有效扩增，无模板对照无扩增的前提下，读取待测样 品的Ct值，进行结果判定：Ct值大于40的样本为阴性结果；Ct值小于或等于40的样本为 阳性结果。
【专利摘要】本发明提供一种检测鸡免疫相关细胞因子的荧光定量PCR试剂盒及应用，用于鸡IFN-α，IFN-β，IFN-γ，IL-1β,IL-2和IL-6基因转录水平的SYBR Green I荧光定量PCR。本发明提供的试剂盒及检测方法灵敏度高、特异性强、线性浓度范围广、重复性好、操作简便及省时，可用于多种样品类型鸡免疫相关细胞因子的绝对或相对定量检测。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104975088
【申请号】CN201510374356
【发明人】黄艳艳, 许传田, 吴家强, 杨少华, 黄庆华, 张琳, 朱曼玲, 高丹丹
【申请人】山东省农业科学院畜牧兽医研究所
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2015年6月30日