57-IFN-aCh，pUC57-IFN-0Ch，pUC57-IFN-yCh，pUC57-IL-10Ch，pUC57-IL-2Ch 和 pUC57-IL-6Ch。质粒中目的基因的核苷酸序列（SEQ ID NO. 7~12)如附表所示。
[0082] 用核酸/蛋白紫外检测仪测定质粒的纯度（OD26tlA)D28tl= L 8左右为高纯度DNA) 和浓度，并换算为质粒拷贝数，置于_20°C保存。质粒拷贝数计算公式为：拷贝数（拷贝/ μ L) = 6. 02 X IO23 X 质粒浓度（g/μ L)/MW ;
[0083] MW(g/mol)=质粒大小（bp) X660g/mol · bp。
[0084] 实施例 3 检测鸡 IFN- a，IFN- β，IFN- γ，IL-I β，IL-2 和 IL-6 的荧光定量 PCR 方法的建立
[0085] 3. 1反应条件的优化
[0086] 首先，使用不同的退火温度进行PCR，分别扩增IFN- a，IFN- β，IFN- γ，IL-I β， IL-2和IL-6,确定反应的最佳退火温度。然后，使用不同的引物浓度及最佳退火温度进行 荧光定量PCR，优化引物的使用浓度。将指数扩增期出现最早（Ct值最小）、扩增曲线最佳 (典型的S型曲线）以及扩增产物最多（荧光增量值最高）的反应所使用的引物浓度，作为 最佳引物浓度。
[0087] 试验使用了上海生物工程有限公司（Sangon)的荧光定量PCR预混液（Master Mix)和缓冲液（Buffer)，仪器为：Roche LightCycler480Real_time PCR Machine。
[0088] 优化的 IFN- α，IFN- β，IFN- γ，IL-I β，IL-2 和 IL-6 荧光定量 PCR 反应体系均 为：
[0089]
[0090] 优化的 IFN- a，IFN- β，IFN- γ，IL-I β，IL-2 和 IL-6 荧光定量 PCR 反应程序均 为：95°C预变性2. 5分钟；95°C 7秒，55°C 10秒，72°C 15秒扩增45个循环，每个循环结束时 检测荧光；熔解曲线分析为95°C 15秒，60°C 50秒，95°C continuous ;最后37°C 30秒结束。
[0091] 3. 2标准曲线的制备
[0092] 标准曲线的绘制是荧光定量PCR方法中进行基因绝对定量检测的基础。本发明分 别以8个浓度梯度的鸡IFN- a，IFN- β，IFN- γ，IL-I β，IL-2和IL-6质粒标准品为模板， 使用上述优化的反应体系和程序进行实时荧光定量PCR，绘制反应的标准曲线。
[0093] 3. 2. 1荧光定量PCR检测IFN- α的标准曲线
[0094] 图1显示8个浓度梯度（6. 9Χ IO1~10 8个拷贝）的鸡IFN- α基因均有明显的指 数扩增。各反应的模板拷贝数、Tm值、Ct值以及3个重复反应的平均Ct值见表1。反应产 物的Tm值在88. 09~88. 24°C，且峰值单一（图2)。据试验结果绘制了反应的标准曲线见 图 3,并得到公式：Y = 37. 90-3. 352X (Error :0· 0991，Efficiency :1· 987) 〇
[0095] 表1鸡IFN- α质粒标准品（6. 9 X IO1~10 8个拷贝）的荧光定量PCR反应结果
[0096]
[0097] 3. 2. 2荧光定量PCR检测IFN- β的标准曲线
[0098] 图4显示3Χ IO2~10 8拷贝的IFN-β基因均有明显的指数扩增。表2是各反应 孔的具体结果，包括模板拷贝数、各反应的Tm值、Ct值以及3个重复反应的平均Ct值。反 应产物的Tm值在85. 42~85. 95°C，且峰值单一（图5)。据试验结果绘制了反应的标准曲 线（图 6)，并得到公式：Y = 35. 43-3. 276X(Error:0· 163, Efficiency: 2. 019) 〇
[0099] 表2 IFN-β质粒标准品（3 X IO2~10 8个拷贝）的荧光定量PCR反应结果
[0100]
[0101] 3. 2. 3荧光定量PCR检测IFN-γ的标准曲线
[0102] 图7显示6. 5Χ IO2~10 8拷贝的IFN-γ基因均有明显的指数扩增。表3是各反 应孔的具体结果，包括模板拷贝数、各反应的Tm值、Ct值以及3个重复反应的平均Ct值。 反应产物的Tm值在82. 00~82. 21 °C，且峰值单一（图8)。据试验结果绘制了反应的标准 曲线（图 9)，并得到公式：Y = 35. 97-3. 223X (Error :0· 152, Efficiency :2· 042) ο
[0103] 表3 IFN-γ质粒标准品（6. 5 X IO2~10 8个拷贝）的荧光定量PCR反应结果
[0104]
[0105] 3. 2. 4荧光定量PCR检测IL-I β的标准曲线
[0106] 图10显示8个浓度梯度（4. 5Χ IO1~10 8个拷贝）的鸡IL-I β基因均有明显的 指数扩增。各反应的模板拷贝数、Tm值、Ct值以及3个重复反应的平均Ct值见表4。反应 产物的Tm值在89. 09~89. 31°C，且峰值单一（图11)。据试验结果绘制了反应的标准曲 线见图 12,并得到公式：Y = 37. 03-3. 598X(Error:0. 0997, Efficiency: 1. 896) 〇
[0107] 表4 IL-I β质粒标准品（4. 5 X IO1~10 8个拷贝）的荧光定量PCR反应结果
[0108]
[0110] 3. 2. 5荧光定量PCR检测IL-2的标准曲线
[0111] 图13显示8. 7X IO1~10 8拷贝的IL-2基因均有明显的指数扩增。表5是各反应 孔的具体结果，包括模板拷贝数、各反应的Tm值、Ct值以及3个重复反应的平均Ct值。反 应产物的Tm值在80. 19~80. 44°C，且峰值单一（图14)。据试验结果绘制了反应的标准 曲线（图 15)，并得到公式：Y = 39. 50-3. 586X (Error :0· 0805, Efficiency :1· 901) 〇
[0112] 表5 IL-2质粒标准品（8. 7 X IO1~10 8个拷贝）的荧光定量PCR反应结果
[0113]
[0114] 3. 2. 6荧光定量PCR检测IL-6的标准曲线
[0115] 图16显示6. 6 X IO1~10 8拷贝的IFN-γ基因均有明显的指数扩增。表6是各反 应孔的具体结果，包括模板拷贝数、各反应的Tm值、Ct值以及3个重复反应的平均Ct值。 反应产物的Tm值在87. 47~87. 68°C，且峰值单一（图17)。据试验结果绘制了反应的标 准曲线（图 18)，并得到公式：Y = 36. 24-3. 234X(Error:0· 190, Efficiency: 2. 038) 〇
[0116] 表6 IFN-γ质粒标准品（7. 4X IO1~10 8个拷贝）的荧光定量PCR反应结果
[0117]
[0118] 3.3特异性试验
[0119] 特异性通过以下两个方面进行验证。
[0120] (1)对质粒标准品的荧光定量PCR扩增产物进行熔解曲线的分析，检测扩增产物 的单一性（单一峰值）。结果表明，IFN-α，IFN-β，IFN-γ，IL-I β，IL-2和IL-6基因扩 增产物的熔解曲线均为单一峰值。
[0121] (2)用建立的实时荧光定量PCR方法检测对照基因的质粒样品，若无扩增则表明 方法的特异性好。对照基因包括本实验室制备的17种固有免疫信号通路信号分子（TLR3， TLR7，MDA5，MyD88，TRIFF，MAVS，IL-Iβ，IL-2,IL-6,IL-17,IFN-a，IFN-β，IFN-γ，IFIT5， Μχ，OASL和PKR)的质粒标准品。结果表明，建立的方法对相应的对照基因均无扩增，表明 方法的特异性好。
[0122] 3. 4敏感性试验
[0123] 将鸡IFN- a，IFN- β，IFN- γ，IL-I β，IL-2和IL-6质粒标准品进行10倍梯度稀 释，按上述建立的方法进行实时荧光定量PCR扩增，检测该方法的敏感性。结果表明，7个拷 贝的IFN-a基因其荧光定量PCR反应的Ct平均值为34. 82 ;3个拷贝的IFN-β基因其荧 光定量PCR反应的Ct平均值为32. 78 ;7个拷贝的IFN-Y基因其荧光定量PCR反应的Ct 平均值为32. 71 ;5个拷贝的IL-I β基因其荧光定量PCR反应的Ct平均值为34. 85 ;9个拷 贝的IL-2基因其荧光