一种水产品细菌性疾病的快速检测试剂盒及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种快速检测水产品细菌性疾病的试剂盒，尤其涉及一种水产品细菌 性疾病的快速检测试剂盒及应用。
【背景技术】
[0002] 近年来，我国海水养殖业迅猛发展，在过去10年间海水养殖产量增加了 5-6倍。但 是，前阶段海水养殖的大发展带有很大的盲目性、甚至破坏性，导致这两年海水养殖产量增 长开始放缓，尤其是病害的问题变得愈来愈严重。
[0003] 虾的常见细菌性病害有烂鳃病、褐斑病、红点病三种，一般流行于4月、8月中 旬-10月中旬，烂鳃病在发病初期，病虾鳃丝末端开始腐烂，严重时鳃丝大部分溃烂发黑， 外部几丁质膜皱缩，病虾呼吸困难，活动迟缓；褐斑病发病初期，虾的甲壳上有斑点状褐黑 色溃疡，中间凹陷，边缘往往变白色，严重时一直腐蚀到甲壳层下面组织，变成褐黑色，褐斑 通常在鳃部、腹部及其附肢上都有出现，严重时新老几丁质发生粘连，造成蜕皮困难而致 死；红点病发病时，病虾的尾部、游泳足、步足上出现红点，并逐步扩大，严重时引起虾死亡。
[0004] 蟹常见细菌性病害有黑鳃病、腐壳病、肠胃炎三种，一般流行于5月、7月-9月，黑 鳃病病发时，病蟹鳃部受到致病菌感染，轻时鳃丝部分呈暗灰色或黑色，重时鳃丝全部变为 黑色，病蟹呼吸困难，行动迟钝，轻者有退避能力，重者就陆续死亡，发病时间7-9月份，规 格在80克/只以上个体常见发生，危害很大；腐壳病病发时，蟹甲壳受破坏几丁质的细菌感 染所致，病蟹的甲壳、步足上出现棕色、深褐色或黑色状病灶，或出现白色斑点，斑点逐步发 展连成块状，形成黑色溃疡，严重时甲壳被侵蚀成孔，严重影响蟹摄食，进而导致蟹死亡；肠 胃炎病发时，蟹肠胃发炎，打开病蟹脐盖，轻压肛门，可见黄色或淡红色粘液流出，病蟹很少 摄食，严重的引起死亡。
[0005] 水产品细菌性病害的主要病原是弧菌、假单胞菌、黄杆菌、气单胞菌、嗜水气单胞 菌、哈维氏弧菌等。
[0006] 当前病原检测技术主要是以下几种：1、常规生化检测技术，它是将纯化后的细菌 接种到含不同生化物质的培养基中，由于不同种的细菌代谢的物质不完全相同，与培养基 中显色剂反应的结果也不相同，将这些结果与标准菌株和文献记录结果对照，就可以得出 结论。这种方法结果比较准确，但是十分耗时，而且对新的种类的检测结果并不十分可靠； 2、API-20E等快速细菌鉴定试剂盒，它采用检测少数几个生化指标后统计分析得出鉴定结 论，相对比较节约时间，但结果不太可靠。
[0007] 中国专利公开号CN 1410550A，公开日2003年4月16日，名称为一种快速检测对 虾桃拉病毒试剂盒，该申请案公开了 一种快速检测对虾桃拉病毒试剂盒，主要由以下几种 试剂组成，试剂A，组织裂解液；试剂B :RNA提取液；试剂C :桃拉病毒RNA反转录反应液，其 中含有特定引物TSV-Rl5 ' -TCACCAGGCAGTCCGGCATAAG ;试剂D :PCR反应液，其中含有特定引 物TSV-F15' -CGAAAGTTGGGTACACGGCAGA。其不足之处在于，只能检测一种病毒。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于为了解决现有常规生化检测技术十分耗时，而且对新的种类的 检测结果并不十分可靠的缺陷而提供一种可靠，快速的水产品细菌性疾病的快速检测试剂 盒。
[0009] 本发明的另一个目的是提供一种水产品细菌性疾病的快速检测试剂盒的应用。
[0010] 为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案： 一种水产品细菌性疾病的快速检测试剂盒，所述快速检测试剂盒包括： a) DNA提取试剂一份：含缓冲试剂A和细胞裂解试剂B，缓冲试剂A含有NaCl 0· 1-0. 3mol/L，pH为L 8-8. 2的三羟基甲基氨基甲烷l-80mmol/L，pH为L 8-8. 2的乙二胺 四乙酸0. l-8mmol/L与体积分数为10-20 %的曲拉通X-100 ;细胞裂解试剂B含有浓度为 1-lOmg/mL的溶菌酶与pH为7. 8-8. 2的三羟基甲基氨基甲烷l-80mmol/L ;所述快速检测试 剂盒还包括： b) PCR反应试剂甲一份：PCR反应试剂甲含有10倍聚合酶链式反应缓冲液2-4 μ L、 22-27mmol/L 的氯化镁溶液 1-3 yL、2. 2-2. 7mmol/L 的 dNTP 1-3 yL、3-7mmol/L 的引物 VPtllO. 1-1 μ L、3-7mmol/L 的引物 VPtl2O. 1-1 μ L、3-7U 的 Taq 酶 0· 1-0. 5 μ L 与无核酸酶灭菌 水 10-15yL ; c) PCR反应试剂乙一份：PCR反应试剂乙含有10倍聚合酶链式反应缓冲液2-4 μ L、 22-27mmol/L 的氯化镁溶液 1-3 yL、2. 2-2. 7mmol/L 的 dNTP 1-3 yL、3-7mmol/L 的引物 VPtl3O. 1-1 μ L、3-7mmol/L 的引物 VPtl4O. 1-1 μ L、3-7U 的 Taq 酶 0· 1-0. 5 μ L 与无核酸酶灭菌 水 10-15yL ; d) PCR杂交液一份：PCR杂交液由20倍柠檬酸钠缓冲溶液1-5 μ L、体积分数为10%的 十二磺基硫酸钠溶液0. 1-0. 5 yL、质量分数为25 %的甲酰胺3-5 yL与50倍Denhardts溶 液1-3 μ L组成。
[0011] 在本技术方案中，试剂A和试剂B将样品中的细菌进行裂解，释放出细菌DNA，然 后通过PCR反应试剂进行多聚酶链式反应，对样品释放出的DNA进行特异性的扩增，然后将 PCR反应产物与PCR杂交液进行杂交反应，根据碱基互补配对的原则，使得PCR反应产物与 基因芯片上的探针杂交形成稳定的双链，间接的对待测序列进行了定性分析。
[0012] 作为优选，VPc^g 16SrRNA 引物 F :GGITTCGGATGTTACAGCGTAGAGTTTGATCCTGGCTCAG (SEQ ID NO. 1)； VP0Jg 16SrRNA 引物 R :GACGGGCGGTGTGTGCA(SEQ ID NO. 2); VP03指 gyrB-F:TGCACTGCAGAAGCGTCCAGCGATGTATATCGG(SEQ ID N0.3); VP04指 gyrB-R :AGCTGAGCTCCCGGCTGAATCTCCCTCGAC(SEQ ID NO. 4)。
[0013] 在本技术方案中，VPQ1、VPQ2、VPQ3、VP ciJt为进行PCR反应的特异引物和必需成分， 是PCR反应的主要成分。
[0014] 一种水产品细菌性疾病的快速检测试剂盒的应用，依次包括以下步骤： 1) 样品处理：取0. 1-0. 5g样品，用100-300 μ L的缓冲试剂A悬浮样品，并将样品充分 混勾；10000-12000g离心2-4min，留下沉淀，弃上清液； 2) DNA提取：用100-300 μ L缓冲试剂A再次悬浮步骤1)得到的沉淀，并加入20-80 μ L 细胞裂解试剂B混匀，室温下放置4-5min，再在沸水浴中保温5-10min ;然后10000-12000g 离心8-10min，取上清液，向上清液中加入上清液体积2-4倍的无水乙醇；在室温下放置 5-10min后，10000-12000离心5-8min ;弃上清液，用质量分数75-80%的乙醇洗涤沉淀2-3 次，待乙醇完全挥发后，将所得沉淀溶于10-50 μ L灭菌双蒸水中，得到DNA提取液； 3) PCR扩增：取步骤2)得到的DNA提取液1-3 μ L与PCR反应试剂甲混合，在93-95 °C反 应 3-5min，然后 93-95°C变性 0· 5-lmin，在 54-58°C复性 0· 5-lmin，72°C下延伸 lmin-2min， 然后变性、复性、延伸步骤循环30-50次，最后在70-75°C下保温5-8min，得到一号PCR产 物；另取步骤2)得到的DNA提取液1-3 μ L与PCR反应试剂乙混合，在93-95°C反应3-5min， 然后 93-95°C变性 0· 5-lmin，在 54-58°C复性 0· 5-lmin，72°C下延伸 lmin-2min，然后变性、 复性、延伸步骤循环30-50次，最后在70-75°C下保温5-8min，得到二号PCR产物； 4) 杂交反应：取2. 5-3. 5 μ L步骤3)得到的一号PCR产物与2. 5-3. 5 μ L步骤3)得到 的二号PCR产物混匀，得到PCR产物，然后与PCR杂交液混匀，3000-3500rpm离心25-35s， 在93-95°C下变性2-4min，然后骤冷冰浴l-3min，得到PCR杂交反应液； 5) 点样检测：将步骤4)得到PCR杂交反应液在基因芯片上均匀点样，放入40-45°C恒 温水浴锅中杂交2-2. 5h，然后移出基因芯片，并在微生物基因芯片监测系统软件判读，得到 结果。
[0015] 点样所用探针为检测探针与质控探针。
[0016] 检测探针的设计：从RDPII (http://rdp. cme. msu. edu/)中下载所需要的细菌的 核酸序列，分析流程为下载序列数据，整理后导入数据库，抽取所有细菌的通用引物所包括 的序列，进行全局联配，根据联配图得到某指定细菌的特征区段，在特征区域设计种特异性 探针，再进行引物特异性检验、性能评价和分级，调整Tm值和弃用特异性有问题的探针，最 终得到表1所示的检测探针序列。
[0017] 表1、检测探针表
表2、质控探针表
表3、基因芯片点样表
本发明的主要原理是，试剂A和试剂B将样品中的细菌进行裂解，释放出细菌DNA，然 后通过PCR反应试剂进行多聚酶链式反应，对样品释放出的DNA进行特异性的扩增，然后将 PCR反应产物与PCR杂交液进行杂交反应，使样品中的DNA与探针根据碱基互补配对的原则 充分反应，带有荧光标记的PCR产物与基因芯片上的互补探针杂交结合形成稳定的双链， 然后在微生物基因芯片监测系统软件进行判读，得出定性分析结果，判定该细菌的菌属。
[0018] 本发明基于核酸的检测技术，包括DNA探针和PCR技术，相对于其它的病原检测技 术而言，本发明的有益效果是： 1) 该方法检测十分快速，5-6h即可得知检测结果，而其他方法则至少需要3天或一个 星期以上； 2) 该方法检测灵敏度高； 3) 该方法可以检测多种细菌病毒，如黄杆菌属、嗜冷黄杆菌、弧菌属、霍乱弧菌、哈维氏 弧菌、溶藻弧菌、河流弧菌、创伤弧菌、副溶血性弧菌、诺卡氏菌属、嗜水性气单胞菌、链球菌 属等，而其他检测方法则只能检测一种细菌病毒。
【具体实施方式】
[0019] 以下结合具体实施例，对本发明做进一步的解释： 曲拉通X-IOO购自上海研域生物