双重实时荧光定量pcr检测引发心内膜炎的巴尔通体的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学检测领域，具体地说，涉及一种双重实时荧光定量PCR检 测引发心内膜炎的巴尔通体的方法。
【背景技术】
[0002] 心内膜炎（IE)是一类严重危害身体健康、临床表现非常复杂且检测很困难的疾 病，该病的病因复杂，依据起初临床表现、潜在心脏疾病、涉及病原微生物和并发症存在与 否等表现出各种各样的形式，其治疗需内科医生、心脏病专家、外科医生、微生物学家、传染 病专家、神经学家、神经外科学家、放射科学家和病理学家等的会诊与治疗。自从磺胺类药 和青霉素出现，IE治疗得到了很大改观，不再是普遍致命性的疾病。在过去30年里，预防 和治疗水平虽然有了很大提高，但发病率和死亡率依然比较高，每年发病率为3~10例 /100000人，住院死亡率为9. 6%~26. 0%。Netzer等报道IE死亡率在20世纪50年代 约为40. 0 %~60. 0%，20世纪70年代到80年代降到约为30. 0%，1980~1995年约为 16. 0%~27. 0%。Slipczuk等研宄近五十年IE流行病显示在20世纪70年代住院死亡率 为24. 4 %~36. 8 %，并且之后一直保持在这个水平。
[0003] 引起 IE 病原体有链球菌（Streptococcus spp.)、葡萄球菌（Staphylococcus spp·)、柯克斯体（Coxiella spp·)、巴尔通体（Bartonella spp·)、衣原体（Chlamydia spp.)、棒状杆菌（Corynebacterium spp.)、布鲁氏菌（Brucella spp.)、肠杆菌科 (Enterobacteriaceae spp.)和真菌等。其诊断方法主要依据微生物学检查，比如血液及瓣 膜组织培养分离病原体、血清学、组织病理学和核酸分子诊断。报道BCNE患者在IE患者中 约占2. 5%~31.0%，主要是由于一类营养条件要求苛刻、生长缓慢、难以培养的病原体， 即巴尔通体与柯克斯体引起，其中BE发病率在IE患者中约占4. 5%。Slipczuk等报道全 世界BCNE患者在20世纪60年代约占18%，20世纪70年代约占14%，20世纪80年代约占 23%，20世纪90年代约占20%，21世纪前十年约占14%，近十年处于下降趋势。英国报道 伦敦圣托马斯医院1975~2000年516份心内膜炎病例，研宄显示BCNE患者约占12. 2%， BE发病率在BCNE患者中约占11%。在法国BE发病率在IE患者中约占30%，在巴西BE患 者在BCNE患者中约占3. 9%。
[0004] 收集了 1993~2013年英国、法国、美国、印度、瑞典和希腊等全世界范围内报道的 52篇文献，共计538例BE，其中47篇文献详细描述110例患者情况，5篇文献只报道BE病 例数共428例。统计时剔除重叠病例报道。综合各种方法检测感染人心内膜炎的巴尔通体 主要有8种，在110个病例患者中，由Bq感染的患者占50.0% (55例），Bh占23. 6% (26 例），另外Bvb (2例）、Bva(5例）、Ba(2例）、Be (1例）、Bk(l例）和Bm(l例），未确定种 的患者有17例。发现Bh和Bq为主要的病原体，此外也可引起人类CSD、战壕热和BA等多 种疾病。此外报道至少有6种巴尔通体可引起动物感染心内膜炎，分别为Bq、BK Bvb、Bc、 B.bovis (牛巴尔通体）和 B.washoensis。
[0005] 目前，对Bh和Bq检测方法主要是分离培养、血清学检测、常规PCR和实时荧光定 量PCR检测。巴尔通体菌生长缓慢、营养条件要求苛刻且难于分离培养，液体培养时生长相 对比较快。血清学检测通常用IFA法和ELISA法检测抗体，结果判读存在主观因素，灵敏度 和特异性均不高，不能很好区分Bq和Bh，且易与衣原体等其他微生物出现交叉反应。常规 PCR检测存在引物结合缺乏特异性、实验室污染和临床样品中PCR抑制物存在造成假阴性 等，在基因扩增后还需电泳测序来验证，相对耗时，成本也比较高。实时荧光探针PCR方法 依据序列特异性探针区别物种，增加了特异性和灵敏度，但需要合成探针价格比较贵，目前 国外报道实时荧光探针PCR方法检测巴尔通体属，国内本实验室已建立了检测Bvb单重实 时荧光定量PCR探针法，其他实验室报道采用TaqMan-MGB探针技术建立了检测Bh和Bq单 重实时荧光定量PCR方法，但是一个PCR体系只能检测一种或一类病原体，不能同时检测多 种病原体。近年来多重实时荧光定量PCR探针法的应用越来越广泛，该技术是几种荧光探 针混合在一起，根据各自探针荧光颜色不同可在单一管中有效的区分多种病原体，节省样 本、节约试剂、降低成本和加速实验进程等。目前国内外尚无应用双重探针法同时检测Bh 和Bq的报道，双重PCR方法具有高效性、节约时间、节省样本等优点，在原来单重PCR基础 上提高50 %的效率等。因此有必要建立了双重实时荧光定量PCR探针法用以检测引起人心 内膜炎常见的两种巴尔通体，为这两种巴尔通体鉴别和区分提供有效检测方法。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种双重实时荧光定量PCR检测引发心内膜炎的巴尔通体 (五日热巴尔通体和汉赛巴尔通体）的方法。
[0007] 为了实现本发明的目的，本发明首先提供一种用于检测引发心内膜炎的巴尔通体 的实时荧光定量PCR引物组，所述引物组包括用于检测汉赛巴尔通体的引物对I和用于检 测五日热巴尔通体的引物对II ;
[0008] 所述引物对I为：
[0009] BhF :5' -GAGTCAGATGGAATGGTATTGGTTATC-3' ；
[0010] BhR :5' -CGGTTTATCCCCCACAAGATAGG-3' ；
[0011] 所述引物对II为：
[0012] BqF :5' -TGCCAAGTATGCGAGTTCCTG-3' ；
[0013] BqR : 5 ' -TCAGAGTTAGGTGCAAGTTCTATGG-3 '。
[0014] 本发明还提供了与前述引物组配合使用的探针，所述探针为：
[0015] 探针 I :
[0016] BhT：FAM-CCCTCCCGGTTTTTCTCTGGGCCT-BHQ1 ；
[0017] 探针 II:
[0018] BqT ：CY5-TCTGCGCCCGGTTCTGAAATGCCT-BHQ2 ；
[0019] 其中，FAM和CY5为荧光报告基团，BHQl和BHQ2为荧光淬灭基因。
[0020] 本发明还提供了含有前述引物组及前述探针的试剂盒。
[0021] 进一步地，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的一 种或多种。
[0022] 进一步地，所述试剂盒的工作步骤是利用前述引物组及前述探针对引发心内膜炎 的巴尔通体进行TaqMan实时荧光定量PCR检测。
[0023] 进一步地，所述工作步骤具体包括：
[0024] 1)提取样品中的DNA ;
[0025] 2)以步骤1)中提取的DNA为模板，利用前述引物组及前述探针进行双重实时荧光 定量PCR反应；
[0026] 3)分析实时荧光定量PCR产物。
[0027] 进一步地，所述试剂盒的PCR反应体系以20 μ 1计为：
[0028]
[0029] 作为优选，所述引物的浓度为10ym〇l/L，所述探针的浓度为lOymol/L。
[0030] 作为优选，所述试剂盒的PCR反应条件为：95°C 2分钟，单个循环；95°C 3秒， 60°C 30秒，共40个循环。
[0031] 本发明的有益效果在于：
[0032] 本发明建立的双重实时荧光定量PCR探针法特异性强、灵敏度高、稳定性好。特 异性实验结果显示只有汉赛巴尔通体和五日热巴尔通体扩增出荧光信号，其他种属的细 菌均未见荧光信号；敏感性实验结果显示在20 μ L的反应体系中，双重实时实时荧光定量 PCR探针法检测汉赛巴尔通体和五日热巴尔通体最低检出限分别为3. 64Χ IO1个拷贝和 3. 28Χ101个拷贝，比常规PCR敏感性提高了 100倍，此外也显示出良好的线性关系和扩增 效率，相关系数R2分别为0. 994和0. 998, E值分别为100. 0%和103. 4%。重复性实验结 果显示组内和组间的CV值为0. 19% -0. 53%和0. 49% -1. 66%，在允许范围内。采用本方 法可同时快速检测出汉赛巴尔通体和五日热巴尔通体，为这两种巴尔通体所引起的心内膜 炎等一系列疾病的早期快速诊断、监测和流行病学调查等研宄提供有效手段。
【附图说明】
[0033] 图1为本发明实施例1中汉赛巴尔通体㈧和五日热巴尔通体⑶不同退火温度 的扩增曲线。
[0034] 图2为本发明实施例1中汉赛巴尔通体㈧和五日热巴尔通体⑶不同探针浓度 的扩增曲线。
[0035] 图3为本发明实施例1中汉赛巴尔通体㈧和五日热巴尔通体⑶不同引物浓度 的扩增曲线。
[0036] 图4为本发明实施例1中实时荧光定量PCR探针法特异性检测五日热巴尔通体和 汉赛巴尔通体的结果。
[0037] 图5为本发明实施例1中实时荧光定量PCR探针法特异性检测国内分离的14株 巴尔通体（6株Bh和8株Bq)的结果。
[0038] 图6为本发明实施例1中汉赛巴尔通体单重实时荧光定量PCR探针法敏感性分析 的扩增曲线（A)和标准曲线（B)，其扩增效率为98. 1%，相关系数R2为0.996。
[0039] 图7为本发明实施例1中五日热巴尔通体单重实时荧光定量PCR探针法敏感性分 析的扩增曲线（A)和标准曲线（B)，其相关系数R2为