专利名称：T－20融合蛋白、其制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及T-20融合蛋白、其制备方法及用途。具体而言，本发明实现了T-20融合蛋白在甲醇酵母中的表达，并建立了蛋白质纯化的方法，使得大批量、低成本的生产成为可能，为T-20融合蛋白的临床应用打下了良好的基础。
背景技术：
HIV-1入侵宿主细胞有两个重要步骤受体识别和膜融合。HIV-1首先识别宿主细胞表面的特异受体蛋白并与之相结合，然后病毒和宿主细胞表面发生了复杂构象变化，导致HIV-1膜与宿主细胞质膜相融合，使得HIV-1核心颗粒进入宿主细胞的原生质中。
与其他逆转录病毒类似，HIV-1的膜糖蛋白以多蛋白前体分子的形式在宿主细胞的粗面内质网上合成。编码膜糖蛋白前体的env基因位于病毒基因组的后半区，表达产物为一段88kD的多肽链。这一多肽链在合成过程中进入内质网腔并被糖基化，使分子量达到160kD，因而被称为gp160。gp160以单一跨膜肽段锚定在内质网膜上，并在合成后不久形成三聚体。
在高尔基复合体中，gp160三聚体的糖基被修饰成更为复杂的形态，并且每个gp160分子均被宿主细胞的蛋白水解酶切断。形成分子量分别为120kD和41kD的两个成熟蛋白质，分别称为gp120和gp41，gp120包围在gp41三聚体表面，以非共价键相互结合形成gp120/gp41复合体。另外，gp120与gp41之间还可能形成二硫键，使复合结构更加稳固。
成熟的gp120/gp41三聚体通过高尔基复合体分泌的大囊泡到达宿主细胞质膜，参与对HIV-1病毒颗粒的包裹。
HIV-1入侵的第一步是gp120与细胞表面的CD4受体分子相结合。gp120与CD4的结合区域主要是C4区，C3区和C5区也参予了与CD4的结合。Smith等(Smith D H，Byrn R A，Marsters S A，et al.Science，1987；2381704)还发现可溶性CD4(sCD4)也能与gp120结合，使gp120从病毒膜上脱落下来，从而中和HIV-1的感染。但由于中和反应在大多数HIV-1株系中不能发生，因而sCD4不能作为一种治疗药物。
HIV-1的细胞入侵还需要共受体的参与。很早就发现，HIV-1不能入侵整合了人CD4的小鼠细胞。但将人的CD4-细胞与小鼠CD4+细胞融合以后，HIV-1则能进入杂交细胞。另外，特定的HIV-1株只能感染某几类人CD4+细胞，但不能感染其他类型的人CD4+细胞。这些实验都说明HIV-1的入侵还需要人类细胞表面的其他具有组织特异性的辅助因子。共受体与gp120的相互作用非常复杂。一般认为，gp120在与CD4结合以后，经过构象变化而形成了共受体的结合位点。Atchison等(Atchison R E，Gosling J，Monteclaro F S，et al.Science，1996；2741924)的分析表明，HIV-1入侵需要gp120与共受体形成一种复杂的结构，而决不仅仅是简单的位点结合。这种结构一旦形成，就使gp120与gp41脱离，从而启动了HIV-1入侵宿主细胞的下一过程膜融合。
HIV-1不仅能使其膜宿主细胞膜融合，而且能介导被感染细胞与周围的CD4+细胞发生融合，形成合胞体。直接参与病毒-细胞融合或合胞体形成的是gp41的膜外侧区域。该区域从N端起依次为融膜肽(fusion peptide)、螺旋段1(H1)、免疫环区(IM)、螺旋段2(H2)。1997年，在Cell和Nature杂志上分别发表了gp41膜外侧主要区域(H1和H2)晶体结构的X射线测定结果。在晶体结构中，三段H1螺旋平行排列于中央形成核心，三段H2螺旋反平行地围绕在周围，形成螺旋六元束。这证实gp41以三聚体存在。
T-20取自病毒的膜蛋白gp41膜外区域C末端序列，共有36个氨基酸，它是艾滋病病毒的膜融合抑制剂。临床试验表明，单独或复合用药，对艾滋病都具有明显的治疗作用。491名来自北美和巴西的志愿者参加T-20的临床试验，在此以前，平均每人已经使用12种抗艾滋病药物，他们平均的病毒载量是100,000/μl，T细胞计数为80/μl。实验中，每人使用3到5种药物治疗。一组只使用上市的药物，一组使用上市药加T-20。6个月后，使用T-20的受试者中37％的病毒载量降到检测不到的水平(低于400/μl)，而对照组只有16％。使用T-20的受试者中20％的病毒载量降到低于50/μl，而对照组只有7％。T-20的受试者的T细胞平均增长了76/μl，而对照组只增长了32/μl。另有504名来自欧洲和澳大利亚的志愿者也参加了临床实验，在此以前，所有的受试者都曾经使用药物治疗，并且最后失败，他们平均的T细胞数为98/μl。6个月后，使用加入T-20治疗的受试者中28％的病毒降到检测不到的水平(低于400/μl)，而对照组只有14％。T-20的受试者的T细胞数平均增长了65/μl，而对照组只增长了38/μl。
T-20抑制膜融合的机理还不是很清楚。根据gp41和流感病毒融合蛋白红细胞凝集素具有相似性，有人于1993年提出了“发夹前体中间体理论”，即HIV在发生膜融合时，H1螺旋卷曲结构从H2螺旋三员束中被拉出，而成为游离状态，T-20趁机结合于H1，阻止了以后发夹结构的形成和膜融合。但近期的研究发现，H1并不存在T-20的特异性结合位点，在H2区域也存在T-20结合区；同时，T-20还具有膜反应性，C末端辛基修饰的T-20可以更好的完成膜定位，表现出更高的抑制效应，因此T-20的抑制效应可能还和膜反应性有关。
Fc指包括抗体的非抗原结合部分序列的分子或序列，优选人源，可以来自任何一种同工型，如IgG、IgA、IgM、IgE、IgD。Fc与T-20的融合蛋白相比T-20具有更高的稳定性，而且在体内的半衰期更长。
而甲醇酵母表达体系是近几年发展起来的高效表达系统，相比于大肠杆菌、哺乳动物细胞以及昆虫细胞表达体系而言，甲醇酵母表达体系具有很好的表达可控制、可分泌表达、蛋白易于纯化、表达量高、成本较低等优点。
我们将T-20和Fc基因同时克隆到一个表达载体中，转化甲醇酵母，筛选到了高表达菌株，然后摸索了发酵、纯化工艺，实现了T-20融合蛋白的大规模生产，为其临床应用奠定了基础。
发明内容
本发明的一个目的是提供T-20与Fc的融合蛋白。
本发明的另一个目的是提供用甲醇酵母表达T-20融合蛋白并分离纯化制备T-20融合蛋白的生产方法。该方法包括(a)将编码T-20与Fc的融合蛋白的核苷酸序列可操作地连于大肠杆菌、甲醇酵母、CHO或昆虫表达载体，得到T-20融合蛋白重组表达载体；(b)将步骤(a)中的重组表达载体转入宿主菌，筛选获得表达T-20融合蛋白的工程菌；(c)在适合所述融合蛋白表达的条件下发酵培养步骤(b)中的工程菌；(d)从步骤(c)的发酵培养产物中纯化分离出所述融合蛋白。
该方法还包括，在所述步骤(a)之前，以化学合成获得的T-20基因为模板进行PCR，并以RT-PCR方法获得Fc基因。
本发明的另一个目的是提供获得的T-20融合蛋白的药物制剂。
本发明还提供了上述药物制剂用于预防和治疗艾滋病的用途。
本发明中所述的T-20融合蛋白指T-20或其变体、片段与Fc或其变体、片段融合的蛋白。在一个优选实施例中，所述T-20融合蛋白为R1-L-R2形式。在另一优选实施例中，本发明T-20融合蛋白为R1-R2形式。其中R1为Fc蛋白、其变体或片段，R2为T-20蛋白、其变体或片段，L为接头。所述T-20蛋白、或其变体、片段选自以下(a)SEQ ID NO1所示的T-20序列；(b)氨基酸序列X-Y，其中X，Y为图1所示的包括位置1-36的任何残基，并且X＜Y，特别是1-36；所述Fc蛋白选自以下(A)SEQ ID NO2所示的氨基酸序列；(B)亚部分(A)的氨基酸序列，在以下一个或多个位置具有取代或缺失的不同氨基酸，其中的编号采用SEQ ID NO2的编号i.一个或多个半胱氨酸残基；ii.一个或多个酪氨酸残基；iii.缺失或用丙氨酸取代位置5的丝氨酸；iv.缺失或用谷氨酰胺取代位置20的谷氨酸；v.缺失或用丙氨酸取代位置130的谷氨酸；vi.缺失或用丙氨酸取代位置105的赖氨酸；vii.缺失或取代位置107的赖氨酸；viii.缺失N端1-17位的氨基酸序列；ix.取代或缺失一个或多个残基以消除Fc受体结合位点；x.取代或缺失一个或多个残基以消除补体Clq结合位点；xi.亚部分i-x的组合；所述接头选自以下(a)ala-(ala)n-ala，n可以是1-4间的整数；(b)gly-(gly)n-gly，n可以是0-4间的整数；(c)gly-pro-gly；(d)gly-gly-pro-gly-gly；
(e)val；(f)tyr-val；(g)ser-gly-(gly)6-gly；以及(h)亚部分(a)-(g)的任何组合。
本发明还提供一种编码T-20与Fc融合蛋白的核酸序列，众所周知，一种氨基酸可以有多种密码子编码，本发明分别提供一种编码T-20蛋白的核酸序列(SEQ ID NO3)和编码Fc蛋白的核酸序列(SEQ ID NO4)，但在某些实施方案中，可以根据实际需要对核酸密码子进行突变，特别是选用甲醇酵母偏爱密码子，但编码获得的T-20融合蛋白的氨基酸序列不变。
本发明中所指的甲醇酵母包括巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)、pichiamathonolica等能够利用甲醇作为唯一碳源的酵母。本发明中使用的表达载体可以选用各种已知的载体，如商业化的载体pHIL-D2、pPIC9、pPICZα、pPIC3.5K等。将重组表达载体通过电转化或原生质体转化等方法转入宿主细胞，利用合适的条件筛选重组子，可以诱导表达T-20融合蛋白。
本发明中，工程菌在合适的条件下发酵培养包括以下步骤经筛选的工程菌株活化后接入培养液(例如BMGY、YPD培养液)中制备种子液，培养过夜后接种至发酵罐中，发酵用培养基为基础培养基(例如基础盐培养基)，发酵条件控制为pH4.0-8.0，优选pH4.5-7.0，最佳为pH5.0，温度28℃-37℃，最佳为30℃，溶氧控制在30％以上。培养4-24小时后开始补料，加入甘油或葡萄糖等，当菌体OD值达到高密度(OD600为15-200)，加入诱导剂(如甲醇)诱导表达，控制pH3.0-7.0，优选pH3-4.0，最佳为pH3.0，诱导12-84小时结束。
本发明中，从发酵产物中纯化分离出T-20融合蛋白包括以下要点收集发酵产物，T-20融合蛋白表达产物存在于培养液或菌体中；如表达产物在菌体中，则需破菌；经多步纯化获得产物(包括Protein A亲和柱层析、离子柱层析、反向层析、透析、超滤或凝胶过滤等)；用SDS-PAGE和RP-HPLC检验，获得纯度大于95％的T-20融合蛋白。
已确证，T-20在临床应用上是安全有效的。因此，该融合蛋白是安全的并适宜于药物使用。
采用本发明方法制得的T-20融合蛋白，显示出体外抗融合活性。本发明制备T-20融合蛋白的方法简单，回收率高，并且不损伤蛋白活性，操作性强。
含有本发明方法所获得的多肽和常规载体及助剂组成的药物制剂，包含仅有用本发明方法所获得的多肽的药物制剂，或以本发明方法所获得的多肽作为活性成分与传统的辅剂和添加物一起组成的药物制剂，包括注射针剂、口服制剂、含服制剂及肺部、气道、鼻腔给药制剂及其他非肠道给药组合物。
注射针剂含有本发明活性多肽，优选以无菌冻干物储存。在给药前与合适的等渗溶液混合，等渗溶液包括传统的适于注射或注入的等渗水系统，其中含有用于注射液的普通添加物如稳定剂和促溶剂，优选生理盐水或通过缓冲液调成的等渗溶液。
口服制剂含有本发明活性多肽，包括按知方法制备的固体组合物、液体组合物及喷雾组合物。该组合物为含有本发明活性多肽与至少一种常用的惰性稀释剂混合。该组合物在实际一般情况下，也可加入惰性稀释剂之外的其他添加物如润滑剂(例如硬脂酸镁)、悬浮剂、崩解剂(如甘醇酸纤维素钙)、稳定剂(例如乳糖)、助溶剂(例如谷氨酸、天冬氨酸)、甜味剂、芳香剂以及防腐剂等。
含服制剂及肺部、气道、鼻腔给药制剂及其他非肠道给药组合物含有本发明活性多肽，包括本发明的活性多肽与普通添加物如惰性稀释剂、稳定剂、乳化剂、润滑剂等混合，并用已知方法制备的喷剂、搽剂、栓剂、药膏等。
T-20融合蛋白可以用于预防和治疗艾滋病，如单独使用及同AZT、DDC、DDI、D4T、3TC、那韦拉品(Nevirpine)、地拉韦啶(Delavirdine)、额发文那韦(Efavinavor)、Sequanavir、来顿那韦(Ritonavir)、印第那韦(Indinavir)、纳尔芬那韦(Nelfinavir)、安皮乐那韦(Amprenavir)等组成的任意组合使用。
图1显示本发明重组质粒1的构建示意图。
图2显示本发明T-20融合蛋白在甲醇酵母中的表达。
图3显示本发明T-20融合蛋白的抗融合活性。
图4显示本发明重组质粒2的构建示意图。
图5显示本发明重组质粒3的示意图。图中“Ampicillin”表示氨苄抗性基因，“αfactor”表示“α因子”。
图6显示本发明重组质粒4的示意图。
具体实施例方式
实施例1表达载体为pPICZαC的工程菌构建本例利用Invitrogen公司的EasySelectTM Pichia表达系统表达T-20融合蛋白。利用pPICZαC为表达载体，将T-20基因与Fc基因克隆于α因子信号肽基因后。
1.1基因的克隆与重组质粒1的构建(图1)设计并合成T-201，T-202，T-203，T-204，Fc1，Fc2(SEQ ID NO5、6、7、8、9、10)，以T-201、T-202，T-203，T-204为引物，PCR扩增T-20基因序列，其中5’端和3’端分别引入Kpn I和Xba I位点。以Fc1、Fc2为引物，以从外周血淋巴细胞中抽提的总RNA为模板合成的第一链cDNA为模板，PCR扩增Fc基因，5’端和3’端分别引入Cla I和Eco RI位点。PCR条件为94℃1分钟，52℃1分钟，72℃1分30秒，共35轮循环。PCR产物回收后克隆至pGEM-T载体中，得到重组质粒pGEM-T-T-20和pGEM-T-Fc，经测序确定为T-20和Fc的基因序列。
用Cla I和Eco RI切开表达质粒pPICZαC，然后与Cla I和Eco RI处理后的Fc基因片段连接，转化大肠杆菌TOP10F’(购自Invitrogen公司)，涂布含有25ug/ml ZeocinTM的低盐LB平板上。筛选转化子得到重组质粒，然后用Kpn I和Xba I切开重组质粒，与Kpn I和Xba I处理后的Fc基因片段连接，转化大肠杆菌TOP10F’，涂布含有25ug/ml ZeocinTM的低盐LB平板上，筛选转化子得到重组质粒1。经DNA序列分析与设计序列相同。
1.2重组质粒1转化宿主菌X-33大量抽提重组质粒1，用Sac I线性化，然后用无水乙醇沉淀，70％乙醇洗涤后晾干，溶于适量的TE溶液中(浓度约为1μg/μL)。然后电转化制备好的X-33宿主菌，涂布在含有100ug/ml ZeocinTM的YPDS筛选培养基上，30℃培养3天，得到酵母转化子。
1.3表达筛选从转化子中挑选20个单克隆，分别接种到25ml的BMGY培养基中，30℃培养至OD600到5.0，离心收集菌体，悬浮到150ml的BMMY培养基中诱导表达，每24小时加入1.5ml甲醇，诱导表达72小时，取样进行SDS-PAGE，看到在27kd左右有明显的表达条带，为T-20融合蛋白，筛选高表达菌株为工程菌(图2)。
1.4抗融合活性测定T-20融合蛋白具有抗融合活性，能减少合胞体的形成，可以通过测定合胞体的形成量检测其活性。HIV感染的Hela细胞H1-J.C53细胞在DMEM培养24小时，EDTA处理细胞使其洗脱备用。未感染H1-J.C53细胞在96孔板中培养24小时后加入不同稀释度T-20 DMEM溶液，最终浓度为0-100μM不等，共浴20分钟。然后加入处理后的HIV感染细胞，每孔50个左右，阴性对照只加培养基，37℃于CO2培养箱培养18-24小时。固定细胞，用0.5％结晶紫染色，立体解剖显微镜对合胞体计数，合胞体越少，表示T-20抗融合能力越强。不加T-20的合胞体数量为100％。试验结果表明，T-20融合蛋白具有良好的抗融合能力(图3)。
实施例2表达载体为pPIC9的工程菌的构建本例使用Invitrogen公司Pichia pastoris表达系统表达T-20融合蛋白。
2.1重组质粒2的构建(图4)设计并合成引物T-205、T-206、Fc3、Fc4(SEQ ID NO11、12、13、14)，引物Fc3中引入XhoI酶切位点和酵母α信号肽切割位点(KEX2酶识别位点)，Fc4引物引入Sna BI，T-205引物和T-206分别引入Sna BI和Not I位点。以pGEM-T-Fc为模板，以Fc3、Fc4为引物，PCR扩增Fc基因，电泳回收基因片段，用XhoI和Sna BI酶切处理并回收。同时用XhoI和Sna BI酶切pPIC9质粒，电泳回收后与XhoI和Sna BI处理的Fc基因片段连接，然后转化大肠杆菌DH5α(购自Invitrogen公司)，筛选转化子得重组质粒pPIC9-T-20。然后以pGEM-T-T-20为模板，以T-205、T-206为引物，PCR扩增T-20基因，电泳回收基因片段，用Sna BI和Not I酶切处理并回收。同时用Sna BI和Not I酶切pPIC9-Fc质粒，电泳回收后与Sna BI和Not I处理后的T-20基因片段连接，然后转化大肠杆菌DH5α，涂布在含有100ug/ml的氨苄青霉素的LB平板上，筛选转化子得重组质粒2。DNA序列分析证明基因序列正确。
2.2重组质粒2转化宿主菌GS115大量抽提重组质粒2，用SalI线性化，然后用无水乙醇沉淀，70％乙醇洗涤后晾干，溶于适量的TE溶液中(浓度约为1μg/μL)。然后电转化制备好的GS115宿主菌，涂布在MD筛选培养基上，30℃培养3天，得到酵母转化子。
2.3表达筛选从MD平板上选20个单克隆分别接种到3ml MGY培养基中，30℃培养48小时后加入27ml MM培养基进行诱导，表达72小时，取样进行SDS-PAGE检测，筛选高表达的菌株为工程菌株。
实施例3表达载体为pMETαA的工程菌的构建本例使用Invitrogen公司Pichia methonolica表达系统表达T-20融合蛋白。
3.1重组质粒3的构建用Xho I和Not I双酶切实施例2中的重组质粒2，回收T-20和Fc融合蛋白基因片段，与Xho I和Not I酶切处理的pMETαA质粒连接，转化大肠杆菌DH5α，涂布在含有100ug/ml的氨苄青霉素的LB平板上，筛选转化子得重组质粒3(图5)。
3.2重组质粒3转化宿主菌PMAD11大量抽提重组质粒3，用Apa I线性化，然后用无水乙醇沉淀，70％乙醇洗涤后晾干，溶于适量的TE溶液中(浓度约为1μg/μL)。然后电转化制备好的PMAD11宿主菌，涂布在MD筛选培养基上，30℃培养3天，得到酵母转化子。
3.3表达筛选从MD平板上挑选20个单克隆分别接种到50ml的BMDY培养基中，30℃培养到OD600为6.0，离心收集菌体，重新悬浮到5ml的BMMY培养基中诱导表达，每24小时补加50ul的甲醇，诱导表达72小时，取样SDS-PAGE，筛选高表达菌株为工程菌。
实施例4表达载体为pGAPZαA的工程菌的构建本例使用Invitrogen公司的连续表达载体pGAPZα载体表达T-20融合蛋白。
4.1重组质粒4的构建用Xho I和Not I双酶切实施例2中的重组质粒2，回收T-20和Fc融合蛋白基因片段，与Xho I和Not I酶切处理的pGAPZαA质粒连接，转化大肠杆菌TOP10F’，涂布含有25ug/ml ZeocinTM的低盐LB平板上，筛选转化子得到重组质粒4(图6)。
4.2重组质粒1转化宿主菌X-33大量抽提重组质粒1，用Avr II线性化，然后用无水乙醇沉淀，70％乙醇洗涤后晾干，溶于适量的TE溶液中(浓度约为1μg/μL)。然后电转化制备好的X-33宿主菌，涂布含有100ug/ml ZeocinTM的YPDS筛选培养基上，30℃培养3天，得到酵母转化子。
4.3表达筛选从转化子中挑选20个单克隆，分别接种到50ml的YPD培养基中，30℃培养表达72小时，取样SDS-PAGE，筛选高表达菌株为工程菌。
实施例5工程菌的发酵将自存的实施例1中获得的工程菌株接种于BMGY培养基中30℃培养24小时后，作为种子液接种于发酵罐中，发酵培养基为基础培养基加入微量元素的溶液，发酵温度30℃，pH5.0，控制溶解氧不低于30％，菌体生长24小时后开始补加甘油，同时将pH下调到3.0。菌体OD达到200时开始加入甲醇诱导表达。起始甲醇添加量控制为每升每小时1-2ml，随后逐渐增大每升每小时至15-20ml，通过调节搅拌速度和通气量保持溶氧值大于30％，必要时通入纯氧。连续诱导培养72小时后收获培养液，离心收集上清，4.0℃保存。
实施例6发酵产物的纯化将实施例5获得的发酵液用磷酸盐缓冲液调节pH至7.4～7.6，用MWCO20KD的超滤膜浓缩至原体积的1/5，上样至Protein A Sepharose FF亲和层析柱，目的蛋白结合后，用280nm紫外检测仪监测下，用0.1mol/L pH7.6的磷酸盐缓冲液冲洗至基线。用0.1mol/L pH3.5的乙酸盐缓冲液洗脱目的蛋白，收集洗脱峰，用磷酸盐缓冲液调节pH至7.0左右。取样分析，SDS-PAGE显示蛋白纯度大于95％。
序列表<110>上海富纯中南生物技术有限公司<120>T-20融合蛋白、其制备方法及用途<130>034168<160>14<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>36<212>PRT<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<223>T-20蛋白的编码序列<400>3tacaccagcc tgatccactc cctgattgaa gaatctcaga accagcaaga aaagaacgaa 60atgtggtcgg actaggtgag ggactaactt cttagagtct tggtcgttct tttcttgctt120caagaactgc tggagctgga taaatgggca tctctgtgga actggtttta atgagttctt180gacgacctcg acctatttac ccgtagagac accttgacca aaattact 228<210>4<211>1398<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>Fc蛋白的编码序列<400>4gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 60ctcgggttta gaacactgtt ttgagtgtgt acgggtggca cgggtcgtgg acttgaggac120gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg180ccccctggca gtcagaagga gaaggggggt tttgggttcc tgtgggagta ctagagggcc240acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc300tggggactcc agtgtacgca ccaccacctg cactcggtgc ttctgggact ccagttcaag360aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag420ttgaccatgc acctgccgca cctccacgta ttacggttct gtttcggcgc cctcctcgtc480tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat540atgttgtcgt gcatggcaca ccagtcgcag gagtggcagg acgtggtcct gaccgactta600ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc660ccgttcctca tgttcacgtt ccagaggttg tttcgggagg gtcgggggta gctcttttgg720atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg780
tagaggtttc ggtttcccgt cggggctctt ggtgtccaca tgtgggacgg gggtagggcc 840gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 900ctactcgact ggttcttggt ccagtcggac tggacggacc agtttccgaa gatagggtcg 960gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1020ctgtagcggc acctcaccct ctcgttaccc gtcggcctct tgttgatgtt ctggtgcgga 1080cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1140gggcacgacc tgaggctgcc gaggaagaag gagatgtcgt tcgagtggca cctgttctcg 1200aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1260tccaccgtcg tccccttgca gaagagtacg aggcactacg tactccgaga cgtgttggtg 1320tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatgaa tgtgcgtctt ctcggagagg 1380gacagaggcc catttact1398<210>5<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>5gatgaattct acaccagcct gatccactcc ctgattg 37<210>6<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>6gcctgatcca ctccctgatt gaagaatctc agaaccagca agaaaagaac gaacaagaac 60<210>7<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>7ccagttccac agagatgccc atttatccag ctccagcagt tcttgttcgt tcttttcttg 60<210>8<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature
<223>引物<400>8cgctctagat cattaaaacc agttccacag agatgc36<210>9<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>9gtatctctcg agaagagagg ctgaagcaga gcccaaatct tgtgaca47<210>10<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>10gatgaattct ttacccggag acagggagag gctcttctgc gtgta 45<210>11<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>11tacgtataca ccagcctgat ccactccct29<210>12<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>12gcggccgctt taaaaccagt tccacagaga 30<210>13<211>47
<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>13tctctcgaga aaagagaggc tgaagctgag cccaaatctt ctgacaa47<210>14<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>14tacgtattta cccggagaca gggagaggct cttctgc 3权利要求
1.一种产生T-20融合蛋白的方法，该方法包括(a)将编码T-20与Fc的融合蛋白的核苷酸序列可操作地连于大肠杆菌、甲醇酵母、CHO或昆虫表达载体，得到T-20融合蛋白重组表达载体；(b)将步骤(a)中的重组表达载体转入宿主菌，筛选获得表达T-20融合蛋白的工程菌；(c)在适合所述融合蛋白表达的条件下发酵培养步骤(b)中的工程菌；(d)从步骤(c)的发酵培养产物中纯化分离出所述融合蛋白。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤(a)之前，以化学合成获得的T-20基因为模板进行PCR，并以RT-PCR方法获得Fc基因。
3.如权利要求1的方法，其特征在于，所述T-20融合蛋白为R1-L-R2和R1-R2形式，其中R1为Fc蛋白、其变体或片段，R2为T-20蛋白、其变体或片段，L为接头。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述T-20蛋白、或其变体、片段选自以下(a)SEQ ID NO1所示的T-20序列；(b)氨基酸序列X-Y，其中X，Y为图1所示的包括位置1-36的任何残基，并且X＜Y，特别是1-36；
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述Fc蛋白选自以下(A)SEQ ID NO2所示的氨基酸序列；(B)亚部分(A)的氨基酸序列，在以下一个或多个位置具有取代或缺失的不同氨基酸，其中的编号采用SEQ ID NO2的编号i.一个或多个半胱氨酸残基；ii.一个或多个酪氨酸残基；iii.缺失或用丙氨酸取代位置5的丝氨酸；iv.缺失或用谷氨酰胺取代位置20的谷氨酸；v.缺失或用丙氨酸取代位置130的谷氨酸；vi.缺失或用丙氨酸取代位置105的赖氨酸；vii.缺失或取代位置107的赖氨酸；viii.缺失N端1-17位的氨基酸序列；ix.取代或缺失一个或多个残基以消除Fc受体结合位点；x.取代或缺失一个或多个残基以消除补体Clq结合位点；xi.亚部分i-x的组合。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述接头选自以下(a)ala-(ala)n-ala，n可以是1-4间的整数；(b)gly-(gly)n-gly，n可以是0-4间的整数；(c)gly-pro-gly；(d)gly-gly-pro-gly-gly；(e)val；(f)tyr-val；(g)ser-gly-(gly)6-gly；(h)亚部分(a)-(g)的任何组合。
7.一种T-20融合蛋白，其特征在于，它为R1-L-R2和R1-R2形式，其中R1为Fc蛋白、其变体或片段，R2为T-20蛋白、其变体或片段，L为接头。
8.编码权利要求7所述的T-20融合蛋白的核苷酸序列。
9.含有权利要求8所述的T-20融合蛋白的药物制剂。
10.T-20融合蛋白的用途，其特征在于，用于制备预防或治疗艾滋病的药剂。
全文摘要
本发明涉及T－20融合蛋白(T－20多肽和免疫球蛋白Fc区的融合蛋白)在多种甲醇酵母菌株中的表达、大规模培养及分离纯化技术。最后得到的高纯度重组T－20融合蛋白药物制剂可用于艾滋病治疗。
文档编号A61K38/16GK1580265SQ03142139
公开日2005年2月16日 申请日期2003年8月8日 优先权日2003年8月8日
发明者倪健, 罗鹏, 杨武剑, 郑颖 申请人:上海富纯中南生物技术有限公司