专利名称：巴曲酶的突变核苷酸序列、突变的α因子分泌信号序列和使用其制备巴曲酶的方法
巴曲酶的突变核苷酸序列、突变的α因子分泌信号序列和 使用其制备巴曲酶的方法发明背景 发明领域本发明涉及编码巴曲酶的核苷酸序列和/或包含特定序列的突变的α因子分泌 信号序列、以及使用其的载体和转化体。
背景技术：
一般地，毒液对哺乳动物包括人的凝血级联和溶解纤维蛋白途径的作用已研究 了很长时间，并且已分离且表征了数种有效试剂。已知在毒液中包括的各种组分直接 或间接影响纤维蛋白凝固、血小板聚集等等，因此被用作促凝血剂或抗凝血剂(Meaume， J.Toxicon，4 2558(1966) ；Matsui 等人，Biochim. Biophys. Acta.，1477 :146_156 (2000))。 某些组分已得到表征且广泛用于血栓形成的诊断和治疗。特别地，已积极进行关于通过切 割纤维蛋白肽使纤维蛋白原转变成纤维蛋白的凝血酶样酶的研究，已报告了超过20种蛋 白质，并且已表征了某些的cDNA。凝血酶样酶最初水解纤维蛋白原分子的纤维蛋白肽A，以形成不像凝血酶(哺乳 动物天然血液凝固蛋白质)的不稳定的纤维蛋白凝块(des-A-纤维蛋白)，但这种不稳定的 纤维蛋白凝块通过体内纤维蛋白溶解系统随着时间被快速降解，以最终降低血液纤维蛋白 原水平(Pirkle，H.和 Stocker，K. Thromb. Haemost，65 444-450 (1991) ；Marsh,N. A. ,Blood Coagu1. Fibrinolysis, 5 :339_410(1994))。因此，通过使用酶的这些两面特征，凝血酶样酶在临床领域中被用作止血剂或血 栓形成的治疗和预防试剂。这种酶对其他凝血因子和血小板激活没有影响，由于这个优点， 在手术前1-2小时静脉内或肌内注射少量酶(2NIH单位/60kg)显示有效的止血活性。另一 方面，通过控制酶的剂量和施用时间，可以降低血液纤维蛋白原水平而不引起在使用血栓 溶解酶时可能发生的副作用，例如出血。在上述过程期间形成的des-A-纤维蛋白和FDP (纤 维蛋白原降解产物)的释放刺激血液内皮细胞，以诱导纤溶酶原激活物产生。该酶被用作 血栓形成的治疗和预防试剂，因为该酶可以抑制凝血酶活性(Schumacher等人，Thromb. Res.，81 187-194 (1996)；和 Bell W, R. Jr. , Drugs, 54 18-30 (1997)) 近来，据报告凝血酶样酶的这种纤维蛋白原减少效应对治疗肝素诱发的血 小板减少症或由肝素施用造成的急性缺血性中风有效(Dempfle等人，Blood,96 2793-2802(2000))。临床上使用的所有凝血酶样酶都是从毒液中分离并纯化的天然蛋白质。从Latin 毒蛇迈阿密矛头蝮蛇(Bothrops atrox moojeni)的毒液中分离的巴曲酶可以从Italian Solco Basle Ltd. Company和Swiss Pentapharm Company通过商购获得，并且作为商品名 如立止血(r印tilase，用于止血)、去纤酶(用于溶栓)、立止血试剂(用于诊断试剂)销 售。从Latin毒蛇美洲矛头蝮蛇(Bothrops jararaca)的毒液中分离的巴曲酶(用于止血，
3Italian Ravizza Company),Π^ β (Calloselasma rhodostoma)的_夕夜中
分离的 Malayan pit viper 禾口 Ancrod(American Knoll PharmaceuticalCompany)也是可 以通过商购获得的。近来，使用巴曲酶作为自体纤维蛋白粘合剂用于手术操作中的出血预防和缝合的 Vivostat System (Denmark, Vivosolution Co.)也是弓I 人注目的。同样地，产生重组蛋白质的方法已由众多研究者进行了深入研究，因为大量生产 从蛇中纯化的巴曲酶是有限的。在微生物中表达来自真核生物的蛋白质的研究中，由于在 真核基因转录后的翻译中具有大肠杆菌(原核生物)的低翻译效率的基因密码子，蛋白质 表达减少。为了克服这一点，通常通过使用重组大肠杆菌菌株进行改善蛋白质翻译的方 法，其中将外源真核tRNA基因转化到所述大肠杆菌菌株内，以识别在大肠杆菌中具有低频 率的氨基酸密码子。尽管存在这些努力，但在大肠杆菌中表达的蛋白质的重折叠过程中产 生无活性蛋白质(Yang 等人，Biotechnol. Lett. ,25 101-104(2003) ；Fanetal.，Biochem. Mol. Biol. Int.，47 :217_225 (1999) ；Maeda 等人，J. Biochem.，109 :632_637 (1991))。如迄 今为止报告的，仍未报告其中重组凝血酶样酶在大肠杆菌中表达且随后具有与天然酶的比 活性相比较而言相似活性的任何成功案例。本申请全文中提及了各种出版物和专利，并且在括号中提供了引证。这些出版物 和专利整体的公开内容在此通过引用合并入本申请，以便充分描述本发明和本发明所属领 域的技术水平。发明详述本发明人已进行深入研究，以开发在酵母特别是毕赤酵母属(Pichia)中高产率 的重组巴曲酶的表达系统。作为结果，我们已发现通过使用突变的巴曲酶cDNA或突变的编 码α因子前导肽的核苷酸序列，可以以较高产率收集生物学上有活性的重组巴曲酶。因此，本发明的一个目的是提供编码巴曲酶的核苷酸序列。本发明的另一个目的是提供包含所述核苷酸序列的载体。本发明的另外一个目的是提供由该载体转化的转化体。本发明的进一步目的是提供重组巴曲酶的制备方法。本发明的再进一步目的是提供编码α因子分泌信号肽的核苷酸序列。本发明的另一个目的是提供包含所述核苷酸序列的载体。本发明的另外一个目的是提供由该载体转化的转化体。本发明的进一步目的是提供重组巴曲酶的制备方法。根据下述详述连同随附的权利要求和附图，本发明的其他目的和优点将是显而易 见的。在本发明的一个方面，提供了编码巴曲酶的核苷酸序列，其中包含SEQ ID NO :3、 NO :5或NO :7的核苷酸序列。本发明人已进行深入研究，以开发在酵母特别是毕赤酵母属中高产率的重组巴曲 酶的表达系统。作为结果，我们已发现通过使用突变的巴曲酶cDNA或突变的编码α因子 前导肽的核苷酸序列可以以较高产率收集生物学上有活性的重组巴曲酶。本发明中代表的SEQ ID NO :3、Ν0 5或NO 7的核苷酸序列包括这些核苷酸序列， 以在酵母中，优选在毕赤酵母属中有关的微生物中，并且最优选在巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)中，以高产率表达巴曲酶。术语“核苷酸序列”在本文中用于指具有经修饰的糖或碱基的类似物以及天然 核昔酸(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980) ；UhIman 禾口 Peyman, Chemical Reviews,90 :543_584(1990))。根据一个优选实施方案，本发明的核苷酸序列是SEQ ID NO :5或NO :7，且最优选 是 SEQ ID NO :7ο如下文实施例中举例说明的，与天然存在的编码巴曲酶的序列相比较，通过使用 本发明的核苷酸序列，以4-13倍产率获得重组巴曲酶。在本发明的另一个方面，提供了包含上述编码巴曲酶的核苷酸序列的载体。本发明的载体系统可以通过本领域技术人员已知的各种方法进行构建，所述方法 公开于 Sambrook 等人，Molecular Cloning, ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)中，所述参考文献通过引用合并入本文。一般地，本发明的载体可以构建为克隆或表达载体。本发明的载体利用酵母，优选 毕赤酵母属中有关的微生物，并且更优选巴斯德毕赤酵母，作为宿主。使用酵母如巴斯德毕赤酵母作为宿主，本发明的载体利用基因的启动子，所述基 因例如醇氧化酶ι (A0X1)、醇氧化酶2(A0X2)、3_磷酸甘油酸激酶、烯醇化酶、3-磷酸甘油醛 脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变 位酶或丙酮酸激酶，并且最优选醇氧化酶I(AOXl)的启动子。为了以简单方式纯化由本发明的载体表达的巴曲酶，其他序列可以与之融合。例 如，融合序列包括谷胱甘肽-S-转移酶(Pharmacia，USA)、麦芽糖结合蛋白质(NEB，USA)、 FLAGdBI, USA)和6xHis (六组氨酸；Quiagen，USA)等等。由于存在用于纯化的添加序列， 所以可以通过亲和色谱法以高通量和简单方式纯化宿主中表达的蛋白质。另一方面，本发明的表达载体包括本领域普通技术人员已知的抗生素抗性基因作 为选择标记，例如针对氨苄青霉素、庆大霉素、羧苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素、新霉 素和四环素的抗性基因。根据一个优选实施方案，本发明的载体包括编码分泌信号肽的核苷酸序列。更优 选地，本发明的载体包括编码α因子分泌信号肽的核苷酸序列作为分泌信号肽，且最优选 是由SEQ ID Ν0:11突变的编码α因子分泌信号肽的核苷酸序列。根据一个优选实施方案，本发明的载体是具有
图19的基因图的载体。优选地， ColEl代表图19中pBR322衍生的复制起点，并且大肠杆菌的氨苄青霉素抗性基因和酵母 的组氨酸氨基酸生物合成基因(His4)用作选择标记，启动子基因衍生自酵母的醇氧化酶 1(A0X1)。巴曲酶基因包括SEQ ID NO :3、N0 :5或NO :7的核苷酸序列，并且α因子分泌信 号序列包括由SEQ ID Ν0:11突变的α因子分泌信号肽序列。在本发明的另外一个方面，提供了被包含编码巴曲酶的核苷酸序列的载体转化的 转化体。本发明的载体在其中稳定且相继地克隆且表达的宿主细胞也利用本领域技 术人员已知的酵母细胞中的任何一种，例如巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica) > 多形汉森酵母(Hansenulapolymorpha)、酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)禾口栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。
最优选地，在本发明中使用的宿主细胞是巴斯德毕赤酵母。巴斯德毕赤酵母是一 类甲醇酵母，并且具有几个优点(i)以低成本在培养基中快速和方便的生长，(ii)蛋白质 的大量表达。在包含AOXl启动子的载体中，通过向培养基中加入甲醇可强烈诱导蛋白质表 达。在包含α因子分泌信号肽的载体中，通过所需巴曲酶分泌到培养基内可容易地进行蛋 白质纯化。将本发明的载体递送到宿主细胞内的系统包括CaCl2方法(Cohen，S.N.等 人，Proc. Natl. Acac. Sci USA，9 :2110-2114 (1973) )、Hanahan 方法(Cohen, S. N.等 人，Proc. Natl. Acac. Sci USA, 9 2110-2114 (1973)；和 Hanahan，D.，J. Mol. Biol.，166 557-580(1983))、显微注射(Capecchi，M. R.，Cell, 22 :479 (1980))、磷酸钙沉淀(Graham,
F.L.等人，Virology，52 456 (1973))、电穿孔(Neumann, E.，等人，EMBO J.，1 841 (1982))、 脂质体介导的转染(Wong, Τ. K.等人，Gene，10 :87 (1980))、DEAE-葡聚糖处理(Gopal, Mol. Cell Biol.，5 1188-1190 (1985))和基因轰击(Yang 等人，Proc. Natl. Acad. Sci，87 9568-9572(1990))。在本发明的另外一个方面，提供了重组巴曲酶的制备方法，其包括步骤(a)使用 本发明的载体转化宿主细胞；和(b)培养经转化的细胞以提供重组巴曲酶。经转化的细胞的培养可以通过本领域技术人员已知的各种方法来进行。微生 物培养和发酵的详细描述公开于Kubitschek，H. E.，Introduction to Research with Continuous Cultures.EnglewoodCliffs, NJ. :Prentice_Hall, Inc. , 1970 ；Mandelstam, J.，等人，Biochemistry of Bacterial Growth,第 3 版Oxford :Blackwell, 1982 ;Meynell,
G.G.,等人，Theory and Practice in ExperimentalBacteriology,第 2 版 Cambridge Cambridge University Press,1970 ；禾口 Gerhardt, P.,编辑，Manual of Methods for GeneralBacteriology, Washington :Am. Soc. Microbiol, 1981 Ijf1SIffi 合并入本文。例如，经转化的细胞通过接种在BMG(缓冲的小量甘油)液体培养基中进行培养， 并且当细胞密度达到预定点时，通过向培养基中加入甲醇诱导通过AOXl启动子的巴曲酶 蛋白质表达，获得分泌到培养基内的巴曲酶。根据本领域技术人员已知的各种纯化方法以纯化形式收集分泌到培养基内的巴 曲酶。例如，使用纯化方法例如使用硫酸铵的溶解度分级、大小分级过滤(超滤)和各种色 谱法(使用大小、电荷、疏水性或亲和力的分离)，获得纯化形式的巴曲酶。在本发明的一个方面，提供了由SEQ ID NO 11的核苷酸序列组成的编码α因子 分泌信号肽的核苷酸序列。由SEQ ID NO=Il的核苷酸序列组成的编码α因子分泌信号肽的核苷酸序列包括 所述核苷酸序列，以在酵母中，优选在毕赤酵母属中有关的微生物中，并且最优选在巴斯德 毕赤酵母中，以高产率比表达蛋白质。术语“核苷酸序列”在本文中用于指具有经修饰的糖或碱基的类似物以及天然 核昔酸(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980) ；UhIman 禾口 Peyman, Chemical Reviews,90 :543_584(1990))。如下文实施例中举例说明的，与用天然的编码α因子分泌信号肽的序列相比较， 通过使用本发明的核苷酸序列，以高约2-3倍的产量获得到重组蛋白质(例如巴曲酶)。
在本发明的另一个方面，提供了包括核苷酸序列的载体，所述核苷酸序列包含突 变的α因子分泌信号。本发明的载体系统可以通过本领域技术人员已知的各种方法进行构建，所述方法 公开于 Sambrook 等人，Molecular Cloning, ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)中，所述参考文献通过引用合并入本文。一般地，本发明的载体可以构建为克隆或表达载体。本发明的载体利用酵母，优选 毕赤酵母属中有关的微生物，并且更优选巴斯德毕赤酵母，作为宿主。使用酵母如巴斯德毕赤酵母作为宿主，本发明的载体利用基因的启动子，所述基 因例如醇氧化酶ι (A0X1)、醇氧化酶2(A0X2)、3_磷酸甘油酸激酶、烯醇化酶、3-磷酸甘油醛 脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变 位酶或丙酮酸激酶，并且最优选醇氧化酶I(AOXl)基因的启动子。为了以简单方式纯化由本发明的载体表达的蛋白质，其他序列可以与之融合。例 如，融合序列包括谷胱甘肽-S-转移酶(Pharmacia，USA)、麦芽糖结合蛋白质(NEB，USA)、 FLAGdBI, USA)和6xHis (六组氨酸；Quiagen，USA)等等。由于存在用于纯化的添加序列， 所以可通过亲和色谱法以高通量和简单方式纯化宿主中表达的蛋白质。另一方面，本发明的表达载体包括本领域普通技术人员已知的抗生素抗性基因作 为选择标记，例如针对氨苄青霉素、庆大霉素、羧苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素、新霉 素和四环素的抗性基因。由本发明的载体表达的蛋白质并无特别限制，并且包括但不限于激素、激素类似 物、酶、酶抑制剂、信号转导蛋白质或其部分、抗体或其部分、单克隆抗体、结合蛋白质或其 结合结构域、抗原、粘附蛋白质、结构蛋白质、调节蛋白质、毒性蛋白质、细胞因子、转录因 子、血液凝固因子和植物防御相关蛋白质。优选地，由本发明载体表达的蛋白质是巴曲酶。优选地，SEQID NO :1、NO :3、NO 5 或 NO 7 的核苷酸序列，更优选 SEQ ID NO :3、 NO :5或NO :7的核苷酸序列，且最优选地SEQ ID NO :5或NO :7的核苷酸序列在巴曲酶表达 中使用的本发明载体中用作编码巴曲酶的序列。在酵母中，优选在毕赤酵母属中有关的微 生物中，并且最优选在巴斯德毕赤酵母中，SEQ ID NO :3、NO :5或NO :7的核苷酸序列以高 产率表达巴曲酶。根据一个优选实施方案，本发明的载体是具有图19的基因图的载体。优选地， ColEl在图19中代表pBR322衍生的复制起点，并且大肠杆菌的氨苄青霉素抗性基因和酵母 的组氨酸氨基酸生物合成基因(His4)用作选择标记，启动子基因衍生自酵母的醇氧化酶 1 (A0X1)。巴曲酶基因包括SEQ ID NO =UNO 3、NO :5或NO :7的核苷酸序列，并且α因子 分泌信号序列包括由SEQ ID Ν0:11突变的α因子分泌信号肽序列。在本发明的另外一个方面，提供了通过上文描述的载体转化的转化体。本发明的载体在其中稳定且相继地克隆且表达的宿主细胞也利用本领域技术人 员已知的酵母细胞中的任何一种，例如巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、多形汉森酵母、酿 酒酵母和栗酒裂殖酵母。最优选地，在本发明中使用的宿主细胞是巴斯德毕赤酵母。巴斯德毕赤酵母是一 类甲醇酵母，并且具有几个优点(i)以低成本在培养基中快速和方便的生长，(ii)蛋白质 的大量表达。在包含AOXl启动子的载体中，可通过向培养基中加入甲醇强烈诱导蛋白质表达。在包含α因子分泌信号肽的载体中，通过所需巴曲酶分泌到培养基内可容易地进行蛋 白质纯化。将本发明的载体递送到宿主细胞内的系统包括CaCl2方法(Cohen，S. N.等 人，Proc. Natl. Acac. Sci USA，9 :2110-2114 (1973) )、Hanahan 方法(Cohen, S. N.等 人，Proc. Natl. Acac. Sci USA, 9 2110-2114 (1973)；和 Hanahan，D.，J. Mol. Biol.，166 557-580(1983))、显微注射(Capecchi, M. R.，Cell, 22 :479 (1980))、磷酸钙沉淀(Graham,
F.L.等人，Virology，52 456 (1973))、电穿孔(Neumann, E.，等人，EMBO J.，1 841 (1982))、 脂质体介导的转染(Wong, Τ. K.等人，Gene，10 :87 (1980))、DEAE-葡聚糖处理(Gopal, Mol. Cell Biol.，5 1188-1190 (1985))和基因轰击(Yang 等人，Proc. Natl. Acad. Sci，87 9568-9572(1990))。在本发明的另外一个方面，提供了重组巴曲酶的制备方法，其包括步骤(a)使用 本发明的载体转化宿主细胞；和(b)培养经转化的细胞以提供重组巴曲酶。经转化的细胞的培养可以通过本领域技术人员已知的各种方法来进行。微生 物培养和发酵的详细描述公开于Kubitschek，H. E.，Introduction to Research with Continuous Cultures.EnglewoodCliffs, NJ. Prentice-Hall, Inc. , 1970 ；Mandelstam, J.，等人，Biochemistry of Bacterial Growth,第 3 版 Oxford :Blackwell, 1982 ;Meynell,
G.G.,等人，Theory and Practice in ExperimentalBacteriology,第 2 版 Cambridge Cambridge university Press,1970 ；禾口 Gerhardt， P.，编辑，Manual of Methods for GeneralBacteriology, Washington :Am. Soc. Microbiol, 1981 Ijf1SIffi 合并入本文。例如，经转化的细胞通过接种在BMG(缓冲的小量甘油)液体培养基中进行培养， 并且当细胞密度达到预定点时，通过向培养基中加入甲醇诱导通过AOXl启动子的蛋白质 表达，获得分泌到培养基内的蛋白质。根据本领域技术人员已知的各种纯化方法以纯化形式收集分泌到培养基内的蛋 白质。例如，使用纯化方法，例如使用硫酸铵的溶解度分级、大小分级过滤(超滤)和各种 色谱法(使用大小、电荷、疏水性或亲和力的分离)，获得纯化形式的蛋白质。本发明的特征和优点概括如下(i)本发明的编码巴曲酶的核苷酸序列在酵母、特别是巴斯德毕赤酵母中显示出 极佳的表达效率，并且重组巴曲酶以比天然存在的编码巴曲酶的序列高4-13倍的产率获得。(ii)本发明的突变的α因子分泌信号肽序列也导致重组巴曲酶的产量高约2-3倍。(iii)因此，使用本发明的编码巴曲酶的核苷酸序列以及突变的α因子分泌信号 肽序列的蛋白质表达系统以比天然存在的编码巴曲酶的序列高约20倍的产率获得重组巴 曲酶。(iv)与天然存在的巴曲酶相比较，使用本发明的序列制备的重组巴曲酶具有极佳 的活性。(ν)使用本发明的序列制备的重组巴曲酶具有显著的可靠的稳定性。附图简述
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图1代表使天然巴曲酶cDNA和本发明的突变的cDNA的表达相比较的 SDS-PAGE (十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)。图2代表使天然巴曲酶cDNA和本发 明的突变的cDNA的表达相比较的Western印迹。在图1和图2中，每个泳道如下泳道1， 对照(包含天然cDNA的pPIC-rBat)；泳道2，突变的重组克隆(pBatMd)；泳道3，pBatMx ； 泳道4，pBatSMx ；泳道M，分子大小标记；泳道5，分泌信号SMF取代的天然rbat ；泳道6， SMFbatMd ；泳道 7，SMFBatMx ；和泳道 8，SMFBatSMx。图3代表用内切酶H处理的SDS-PAGE，以检查巴曲酶蛋白质的糖基化。泳道1、泳 道2、泳道3、泳道4的每个条带代表衍生自天然rbat、SMFBatMd, SMFBatMx, SMFBatSMx的 完整巴曲酶；泳道5，天然rbat ；泳道6，SMFBatMd ；泳道7，SMFBatMx ；和泳道8，SMFBatSMx。图4-5是代表重组巴曲酶的纯化的色谱图。图4和图5分别是苯基_琼脂糖和肝 素-琼脂糖色谱图。通过使用SMFBatSMx基因制备重组巴曲酶。箭头指示包含最高量的重 组巴曲酶的级分。图6是通过使用各种核苷酸序列制备的重组巴曲酶的制备产率的曲线图。图7代表通过使用SMFBatSMx基因制备的重组巴曲酶的MALDI-TOF分析。图8-9分别是分析通过天然和重组巴曲酶的血液凝固的曲线图。图10代表通过经由使用各种核苷酸序列制备的重组巴曲酶的纤维蛋白凝固活性 的曲线图。图11-12代表通过经由使用各种核苷酸序列制备的重组巴曲酶的纤维蛋白凝固 活性的反相酶谱法(zymographies)。图13-14是代表在重组巴曲酶的动物模型系统中减少出血时间(图13)和全血凝 固时间(图14)的活性的曲线图。图15-17是测量PT(凝血酶原时间，图15)、APTT(活化的部分凝血活酶时间，图 16)和TT (凝血酶时间，图17)的曲线图。图18是关于重组巴曲酶的pH稳定性的曲线图。图19代表本发明的载体的基因图。5' A0X1,5' AOXl基因的启动子；3' AOXl, 3' AOXl基因的启动子；氨苄青霉素，氨苄青霉素抗性基因；His4，His4基因的开放读码框； MF- α , α因子分泌信号序列；CoIEl，pBR322衍生的起点；巴曲酶，巴曲酶基因。现在将通过实施例进一步详细描述本发明。对于本领域技术人员显而易见的是， 这些实施例意欲更具体地举例说明，并且如随附权利要求书中阐述的本发明的范围并不限 于实施例或受实施例限制。
实施例实施例1 毒液衍生的天然巴曲酶cDNA克隆迈阿密矛头蝮蛇的成熟形式巴曲酶的催化结构域获自包含pPIC-rBat载体(酵 母表达载体)的GSrBAT菌株(专利申请
发明者孙英德, 洪性洧, 申志勋, 郑光会, 金京俊, 金范俊, 金钰奂, 黄载勋 申请人:Biobud有限公司