专利名称：检测dna损伤的设备和方法
技术领域：
本发明涉及检测细胞DNA损伤的设备和原位方法。本发明特别适合在彗星测定 (Comet assay)中使用并且特别适合于自动化。
背景技术：
细胞DNA完整性的损伤可以通过多种机制发生。可以通过由于摄取或吸收与 DNA反应的药物或其它化学剂而产生的化学反应造成DNA断裂(Exon，J. H.，J. Toxicol. Environ. Health B Crit. Rev.，(2006) ,9(5), 397-412) 备选地，可以通过物理方式，如暴 露于电离辐射(Brendler-Schwaab，S.等，Mutat. Res.，(2004), 566 (1), 65-91),单独地，或 与化学剂组合通过光化学机制，引起DNA损伤。任何这种DNA损伤均有可能在细胞所携带 的遗传信息中导致遗传性缺陷，并因此加强了癌的发展。监管方针要求全部注册药物在一组测定中进行DNA损伤评估。这些测定包括细菌 中基因突变的测量和哺乳动物细胞中DNA损伤的体外和体内测定。进行所述测定通常极 其费时并且十分昂贵(约50000美元/化合物)，并因此倾向于限制在药物发现过程的末 期。在药物开发初期，准确预测毒性的失败或不能准确预测毒性的费用估计每年高达80亿 美元，约为全部药物失败费用的30% (2004年12月，剑桥健康技术研究所生命科学进步报 告毒理基因组学和预测毒理学市场和行业展望(Cambridge Healthtech Advances Life Sciences Report Dec 2004 Toxicogenomics and Predictive ToxicologyMarket and Business Outlook))。除新药测试之外，监管活动的增加将测试扩展到其它化学品和材料， 如意欲用于人类消费或使用，或可以间接或偶然消费或摄取的食品染料和化妆品(OECDK 学品测试指南新指南487的草案，2004年6月(0ECD guideline for the testing of chemicals, draftproposal for a new guideline 487, June 2004))。除对新近开发的药物和其它化学品进行DNA损伤诱导测试外，越来越多的证据表 明环境因素可以促成DNA损伤，包括饮食(Young, G. P.，Forum Nutr.，(2007) ,60,91-6), 污染(MolIer，P.，Basic Clin. Pharmacol. Toxicol.，(2006)，巡(4)，336-45)，和职业暴露 于诱变剂(Faust, F.等，Toxicology，(2004) ,98 (1-3), 341-50) 广泛的化学、物理和生理 化学机制引起DNA损伤的可能性需要可用于通过分析采自个体的血液、细胞或组织样本中 的DNA损伤以筛选和监控处于风险中的个体的方法(Lee, Ε.等，Toxicol. Sci.，(2004)， 81(1)，121-32)。彗星测定(Comet assay)是检测哺乳动物细胞中DNA损伤的单细胞电泳测定 (0stling，0.，JohansonX J. ,Biochem. Biophys. Res. Commun.，(1984), 123 (1), 291-8)。细 胞暴露于引起DNA损伤的化合物可以在基因组DNA中产生单链或双链断裂以及化学修饰。 在彗星测定中，将处理后的细胞包埋在琼脂糖中、裂解并用碱处理以使DNA变性。随后的电 泳导致远离核的碎片DNA迁移和/或染色质松弛，以此产生了彗星的外观(由此命名该测 定)并通过荧光显微镜成像。将从彗星头部释放到尾部中的DNA的量定量为DNA损伤的量 度。
由于彗星测定非常敏感、提供单细胞统计并且仅需要少量细胞样本，因此它已广 泛用于评估基因毒性(具有导致遗传性缺失或突变可能性的DNA损伤)。实施该测定最常 用的是淋巴细胞，但是近期的发展集中在使用可以通过微创手术获得的细胞，如来自口腔 拭子的口腔细胞(Szeto, Y. Τ.等，Mutat. Res.，(2005), 578 (1—2), 371—81)。由于据观察彗星测定与对体外微核测定同样灵敏，并且对测试化合物的特异 性更高，因此目前在基因毒性测试中正向更多使用彗星测定的方向发展(Witte，I.等， Toxicol. Sci.，(2007)，近(1)，21-6)。彗星测定使用的增多将需要更高效、更高通过量的彗 星测定以代替当前繁重并且主观的手工处理和分析方法。彗星测定通过细胞DNA的电泳检测DNA损伤。通过离心收获待测试细胞并用缓冲 溶液再悬浮。细胞与低熔点琼脂糖的熔融液混合并涂在显微镜载玻片上。然后将细胞的琼 脂糖悬液冷却并使其凝固(set)。接着将载玻片浸没在裂解溶液中以使细胞裂开，并通过将 载玻片浸入碱性溶液使细胞DNA变性。该裂解和变性步骤除去了大部分细胞组分，但核结 构蛋白和继续保持为不连续类核的DNA除外。DNA裂解后，用电泳缓冲液将载玻片清洗几次 并将载玻片转移到水平电泳设备上并施加电流。在此阶段，由细胞DNA损伤所产生的任何 小DNA片段在电场中向远离保留在类核中的大块DNA的方向迁移。电泳后，将载玻片在乙 醇中固定，使用荧光DNA结合染料染色并通过显微镜法显像。其中发生DNA损伤的细胞表 现出以下染色图案，即类核头部明亮而DNA片段的尾部向电泳方向拖尾。从彗星测定的首次使用以来，已发展出使用不同裂解和变性试剂的一系列方案， 并且半自动化图像分析正在取代人工评分，尽管这种自动化是以50个样品/天，不能达到 很高的通过量(Frieauff，W.等，Mutagenesis (2001)边(2)，133-7)。已经进行了 一些尝 试以将该方案中的细胞处理步骤适用于96孔板(Kiskinis, E.等，Mutagenesis, (2002)， 17(1), 37-43)；然而，使用显微镜载玻片进行电泳和成像的测定仍在继续，它们的制备限制 了该测定的潜在通过量。美国专利申请号2003/0175821说明了用于显微彗星测定的设备，其包括不透光 的箱、位于所述箱内的平台和平台移动马达，其适于保持至少一个载玻片。该设备安装了荧 光照明和CCD图像传感器以记录用荧光化合物染色的细胞图像。另外，该设备包括测量彗 星头部和尾部强度的自动算法，以定义指示是否存在DNA损伤的尾部矩值。尽管与彗星测 定人工评分相比该方法得到了改善，但是它仍然使用显微镜载玻片进行DNA电泳分离并因 此经受传统彗星测定法的大部分通过量限制。US 4，695，548说明了凝胶插入物的使用，其包括诸如琼脂糖的固化液体，其适合 在电泳方法中使用。将裂解的细胞包埋在由该固化液体形成的基质中，而来源于该裂解细 胞的诸如DNA或完整染色体的大分子可以有利地在电泳分离中使用。将凝胶插入物直接放 置在适当的支持介质中并经受一个或多个电场以分离所述大分子。然而，该方法意欲用于 基因组DNA的DNA分离，特别是为了避免吸移DNA溶液时所产生的剪切对DNA的物理损伤， 并且它既不涉及DNA损伤测量的样本处理也不涉及DNA的高通过量分析。因此，需要通过彗星方法进行DNA损伤测定的设备和方法，该方法允许快速定量 分析，稳健且不依赖主观解释，并且该方法可以以高通过量和低成本实施以最大程度地应 用该方法进行筛选。近期诸如IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare)的高容量筛选(HCS)平台的
4发展已允许对基于细胞的测定进行自动图像采集和数据分析，并因此很有可能对DNA损伤 进行自动测试。这些测定的自动化以及通过摆脱人工评分而随之带来的时间和成本的降低 有可能允许对大量样本进行测定。在制药工业中，与传统方法相比，这一进步有可能使得在 药物开发的早期对新的化学实体进行测试，并且通过在对药物化学项目投入时间和资源之 前显示出导致DNA损伤的化合物从而得到相关的节约。在其它领域，如开发新型食品染料、 化妆品或其它家用产品时，低成本自动DNA损伤测定的可用性将用于抵消与监管当局所要 求的测试增加有关的成本升高。
发明内容
在一个方面中，本发明提供了用于确定细胞中DNA损伤的设备，该设备包括诸如 微量滴定孔板的多孔板，所述板包括孔的阵列，所述孔彼此保持固定关系并且每个孔具有 轴、侧壁和底，其中所述孔设置了布置在其中的电极对；并且其中提供了将所述电极对并联 到外部电压供给的装置。本发明的设备特别适合于进行彗星测定。在第二个方面中，本发明提供了通过使用本文所定义的设备确定细胞中DNA损伤 的原位方法，该方法包括a)在存在流体培养基的情况下将待测细胞提供在如本文所定义的设备的一个或 多个孔中；b)任选地将这些细胞暴露于测试试剂；c)用固定化基质覆盖这些细胞；d)用细胞裂解和变性试剂处理所述细胞从而提供包含变性细胞DNA的基质；e)将变性细胞DNA与电泳溶液接触；f)在造成DNA片段电泳分离的条件下对所述一个或多个孔中的电极施加电压；g)将所述DNA片段与染色剂接触；和h)使用检测手段以观察DNA片段的图案(pattern)。因此，本发明提供了通过使用如本文所述的设备检测来源于多种组织和细胞类型 的细胞中DNA损伤的高通过量、自动化的测定。本发明的方法特别适合于进行彗星测定。彗 星测定是基于单细胞的技术，它能够对DNA损伤进行检测和/或定量。因此，使用如本文所 述的设备提供了方便的平台，其用于高通过量地测试试剂的体外和体内诱变活力，并用于 高通过量地监测细胞和组织的由环境因素所引起的DNA损伤。适合地，所述多孔板的孔的侧壁是不透明的并且所述多孔板的每个孔的底是光学 透明的。优选地，所述多孔板的每个孔均安装了具有阳电极和阴电极的一个电极对。在一个实施方式中，每个孔的底均包括定向细胞位置的装置以辅助DNA彗星的分 析。因此，每个孔的底板可包括结构特征的阵列，如用于定向细胞从而使细胞在底的表面上 非随机分布的微通道和/或凹点。所述多孔板可以包括板盖，在一个实施方式中，其支撑对每个孔施加电泳电流的 电极和电连接装置。在一个实施方式中，置于每个孔中的阳电极和阴电极彼此处于相同的 水平，从而在平行于容器的底的平面上进行电泳。在备选实施方式中，定向电极对从而使阳电极和阴电极相对于孔的底处于不同平
5面以使得DNA片段的电泳分离在不平行于该孔的底的方向进行。在一个实施方式中，所述阳电极和阴电极包括可以连接到该孔相对侧的直杆。在另一实施方式中，可以将所述电极弯曲以符合孔壁的曲率，因此，由于在该孔中 不同位置处的电极间距的差异从而横跨(across)该孔产生了变化的场强度。在另一实施方式中，所述多孔板的底板包括延伸通过(extend through)该板的 电极对阵列，所述电极对在每对之间保持固定关系并且其中每个电极对的布置使其配合 (fit)在所述多孔板的单独的孔内。合适地，所述多孔板包括24、48、96或384个孔的阵列。在一个实施方式中，测试试剂与已经预分散到所述多孔板的一个或多个孔中的细 胞接触。在另一实施方式中，可以测试采自人或动物受试者的细胞或组织中由于暴露于环 境来源的诱变剂和/或其它试剂所引起的DNA损伤，例如，血液细胞或其它分离的细胞中的 DNA损伤的分析。所述测试试剂可以是化学试剂，如药物、食用染料、激素、毒素、烷化剂、氧化剂、致 癌剂或诱变剂。其它试剂包括物理作用，诸如电磁辐射(例如，紫外线、X射线、微波)、β-辐 射和热。适合地，在根据第二个方面的方法中，在暴露于测试试剂后向细胞中加入固定化 基质。适合地，该基质包含可以在不损伤细胞的温度条件下加入活细胞中的等渗的含水凝 胶或聚合物溶液。适合的基质实例包括，但不限于，低熔点琼脂糖(LMPA)和温度响应性聚 合物。可以将LMPA在诸如磷酸缓冲盐水的等渗缓冲液中制备成低百分比溶液，适合地为 0. 2-2% ( /力，优选0.5%-1% (w/v) 0为了固定细胞，将LMPA溶液在37°C融化并加入到 本发明设备的孔中的细胞。还可以使用具有相反(reverse)温度相变特性的温度响应性聚 合物，其中该聚合物在低温时为液体而在较高温时为固体。适合的温度响应性聚合物包括 CyGel (聚甲基环氧乙烷，Biostatus)，其在0-4°C为液体而在15°C或以上为固体。可以将 该类聚合物作为冷却的溶液加入到该设备的孔中并允许在室温下凝固。细胞裂解试剂优选地为去污剂，其性质可以是阳离子、阴离子、两性离子或非离子 的。适合的去污剂实例包括十二烷基三甲基溴化铵(DTAB)；十六烷基氯化吡啶撥(CPC)； 苯索氯铵(BZC)；十二烷基硫酸钠(SDS)和N-十二烷基-N，N-二甲基-3-胺基-1-丙磺酸 盐(DDAPS)。DTAB、CPC和BZC是阳离子表面活性剂；DDAPS是两性离子表面活性剂而SDS 是阴离子表面活性剂。在本领域中，这些去污剂作为细胞裂解试剂使用是熟知的。该活性 试剂的典型浓度在0. 4-4% w/v的范围内。适合DNA和DNA片段染色的适合染色剂可以选自熟知种类的DNA结合染料，例如 溴化乙锭(EtBr)、碘化丙啶、DAPI (4'，6- 二脒基-2-苯基吲哚)、Y0Y0 -1碘化物、Τ0Τ0 -3和吖啶橙。(参见，Molecular Probes公司的“荧光探针和标记技术指南(A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies)，，，第 10 版)。优选的 DNA 染色染料是 那些在红光光谱区发荧光的染料。适合地，使用物镜具有足够放大倍数以分辨单个细胞的自动显微镜进行标记的 DNA片段图案的检测。优选地，可以使用2X至60X放大倍数的镜头；更优选地，可以使用 4X至20X放大倍数的镜头。根据本发明的第三个方面，提供了确定细胞中DNA损伤的设备的用途，该设备包
6括多孔板，该板包括孔的阵列，所述孔彼此保持固定关系并且每个孔具有轴、侧壁和底，其 中所述孔设置了布置在其中的电极对；并且其中提供了将所述电极对并联到外部电压供给 的装置。这一方面特别适合使用彗星测定来确定细胞中的DNA损伤。
图1显示了根据第一方面的适合于DNA片段电泳分离的96孔板以及显微镜成像；图2示出了弯曲的(curved)电极对在多孔板的孔中的定位；和图3示出了本发明的实施方式，其中每个孔的底板包括蚀刻到该底的表面中的微 通道阵列。发明详述图1显示了适于DNA片段电泳分离和显微镜成像的96孔板[1](例如，Packard View Plate, Packard)的图。该板[1]包括具有光学透明的底[2]的孔阵列，所述孔可以 用于提供单独的容器的阵列从而在其中实施彗星测定。将细胞加入孔[2]中并且在需要的 情况下，用测试试剂培育适当的时间段以允许该测试试剂的潜在DNA损伤活力发生。用适 合的基质覆盖细胞从而这些细胞固定化。然后，通过向孔中添加溶液、培育并倾倒从而用 裂解和碱性变性溶液处理细胞。接着用电泳缓冲液充满该板上的孔，通常用TBE(45mM的 Tris-硼酸盐，ImM的EDTA，pH 8. 3)缓冲液充满，并且将模制塑料板盖[3]盖于96孔板上。 该板盖[3]支撑适合于将电泳电流施加到96孔板的每个孔(目的是将DNA片段与所研究 的细胞的类核体分离)的电极和电连接。在板盖[3]的一侧安装了电连接器[4]，其通向沿 板盖长度走向的第一被绝缘的电轨道[5]。该电轨道[4]并联到在模制插脚上支撑的一系 列电极[6]上，所述模制插脚从盖[3]的下侧指向下方并且被隔开使得将盖[3]置于该板 [1]上时，电极[6]位于每个孔中。类似地，在板盖[3]的另一侧，提供了第二电连接器[7] 和第二电轨道以支撑第二系列电极[8]，所述第二系列电极的间隔使其可进入板的孔中，并 且第二系列电极提供的电极与连接到第一电轨道[5]的对侧电极形成电极对。通过连接器 [4]和[5]将电极连接到适合的电源(例如，EPS 3501XL，GE Healthcare)并施加适合的电 压(例如，1伏/厘米电极间距)导致在每个孔中的电极对之间产生电流并随后导致由于细 胞中任何DNA损伤所引起的DNA片段的迁移。可以改变电极在孔中的设计和布置以实现DNA片段与类核体之间电泳分离的不 同图案。例如，可以将电极在孔内定位在相同水平从而在平行于该板底部的平面上实现电 泳。在期望全部DNA片段在单一平面上迁移从而当DNA染色时全部彗星可以在单一图像上 清晰成像的情况下，这种电极定位是有用的。备选地，可以定位这些电极从而使阳电极和阴 电极相对于该板的底位于不同平面以实现DNA片段在不平行于该板的底的方向上实现电 泳分离。在细胞密度(即，每孔的细胞数)使细胞紧密靠近从而在平行于该板的底的平面 上电泳会导致染色的DNA彗星重叠的情况下，这种电极定位可以是有利的。在不同平面上 定位电极将产生从板的底向上成某一角度的DNA彗星，所述角度由电极之间的电压场和电 极形状所决定。可以通过共焦或伪共焦成像在平行于该板的底的平面上采集两个或更多个 图像并基于平面图像分析三维复原中的DNA强度从而分析远离设备的底定位的DNA彗星。 备选地，可以在使用共焦或伪共焦对平面外荧光成像所采集的单一图像中测量DNA强度从 而仅目视观察了迁移到该成像平面内的DNA。
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改变电极形状也可以用于根据需要改变DNA彗星与固定化在本发明所述板的孔 中的细胞之间的分离图案从而实现有效的分离和分析。例如，在两个电极都定位在相同平 面中的情况下，电极可以包括位于孔的相对侧上的直杆从而产生电压场，其包括电极之间 横穿该孔的平行力线，从而导致DNA彗星在电泳期间平行定位。备选地，可以将所述电极弯 曲以符合孔壁的曲率，从而由于在该孔中不同位置处电极间距的差异而产生横穿该孔的变 化的场强。在期望处于测试样本内的DNA彗星长度范围能够选择来自紧密相间细胞的彗星 不重叠的分析区域的情况下，后一种电极设计可以是有利的。在电极位于孔内不同平面的情况下，为了实现DNA片段远离该板的底向上迁移， 可以将电极定位在孔的相对侧和不同的高度从而实现相对于该板的平面成角度的分离。例 如，相同尺寸和形状的电极可以放置在孔的相对侧从而使一个电极位于该孔的底而第二个 电极位于该孔向上的中间。对这样的电极施加分离电压将导致DNA片段的迁移，产生与该 板的平面成约45°角的彗星，使由紧密相间的细胞产生的彗星得到分辨。备选地，电极可 以包括位于该板的底中的环形电极和位于该板的底上方的尖端电极。以这种电极定位，DNA 迁移是按照锥形电压场从该板的底向上朝向中心尖端电极的，产生了从底板向公共点向上 成角度的DNA彗星。为了产生适于通过在板底上方限定高度处单一平面成像进行分析的垂 直定位DNA彗星，电极可以包括置于该孔的底和该孔的底上方一定距离处的环。这些电极 将在孔内引起均勻的桶形电压场，以此导致DNA片段在基本垂直于该板的平面的方向上迁 移。因此，使用共焦或伪共焦成像的光学断层可以用于对迁移至该板的底上方预选择高度 的DNA片段迁移成像，并因此确定了样品中发生DNA损伤的细胞数目。可以使用高通过量的自动化仪器实现对标记的DNA片段图案的检测，所述仪器加 入了电荷耦合器件(CCD)成像器(如区域成像器)以对该多孔板的全部孔成像。因此，为 了定量DNA损伤，将板盖[3]从电源断开并拆下，倒掉电泳缓冲液并用适合的荧光染料(例 如，吖啶橙、溴化乙锭、DAPI、T0T0-3、或Y0Y0-3)对DNA染色并使用高通过量自动化显微镜 (例如，IN Cell Analyzer 1000, GE Healthcare)通过适于使用的DNA染料的荧光激发 和发射滤光器对该板成像。使用适合的图像分析软件(例如，IN Cell Investigator, GE Healthcare)分割图像而分析所采集的图像，鉴别DNA染色区域并进行适当的定量测量(例 如，彗尾强度、长度和矩)从而确定每个测试样本中DNA损伤的量。在另一实施方式中，可以将电极对整合到并延伸通过构成多孔板的板底，从而 将平的底板焊接到注射成模的多孔上部时电极位于每个孔内。使用光学透明的玻璃 或塑料的底以及任选光学不透明的孔上部生产多孔成像板的技术是熟知的。例如，US 6463647 (Corning)说明了制备多孔板的方法，其包括将挤出的并具有多个开口通道的顶板 与基本平坦的底板连接。该顶板形成该板的孔的侧壁而该底板形成孔的底部。在本发明的 实施方式中(图2)，光学透明的玻璃或塑料底板[8]包括规则的不连续孔区域阵列[9]。 每个孔区域包含电极对[11]和[13]，其中单独的电极连接到公共轨道[10]和[12]上从 而使这些电极并联到用于电泳的外部电源以在电极之间提供电压从而使得DNA损伤片段 分离并产生DNA彗星[14]。可以通过应用金属箔或通过使用导电墨水的丝网印刷制作电 极。可以配置电极的形状和尺寸以实现所需的电压场形状并因此实现如第一实施方式所述 的所需DNA彗星定位。将导电材料印刷到玻璃和塑料上的方法是熟知的并且是表征过的。 例如，US 7192752 (ACEA)说明了出于对活细胞进行阻抗测量的目的而将电极施加到多孔板的底。一旦制作完成，将底连接到无底的孔板上以形成测定设备。在该实施方式中，任选 地，可以对孔的侧面进行蚀刻、粗糙化或化学处理以促进LMP琼脂糖的粘附从而防止裂解 和变性期间琼脂糖凝胶的移动。可以为一次性板提供匹配的可重复使用的盖，以将该板与 适合的电源连接。所述盖可以包括与常规水平电泳槽的盖具有类似功能的其它特征，例如， 电源线、安全联锁等。可以使用根据基本如上所述的本发明实施方式的设备进行彗星测定。 因此，将细胞置于该板的孔中，在凝胶中固定化并使用如前所述的适当试剂进行处理。向该 板施加适当的电压会造成DNA片段与类核体在平行于该板的底的平面上分离从而允许DNA 彗星可以被高通过量的自动显微镜成像。如图3所示，每个孔的底均可以包括定位细胞位置以辅助DNA彗星分析的装置。因 此，所述底板[15]可以包括微通道、凹槽[16]、或用于定位细胞[17]从而使细胞在该表面 上非随机分布的其它结构如凹点或通道。选择所述结构的间隔和/或周期以提供用于分析 的最佳细胞间隔，即在电泳方向上分离细胞从而使DNA彗星不重叠。当用琼脂糖[18]覆盖 细胞并通过对位于该孔的底[19]的任一侧的电极施加电压而进行电泳时，结构[16]中细 胞[17]的固定化导致形成了垂直于结构方向[20]定位的DNA彗星，其中结构的间隔确保 彗星[20]不会被电泳场[17]中其后的细胞所产生的彗星所模糊。本领域技术人员应理解，在提供原位DNA彗星分析方式的本发明的范围内，可以 对如本文所述的设备和方法进行进一步的改变。例如，可以对电极设计、构造和取向做出进 一步改变，其包括，但不限于，在每个孔中使用多于两个的电极。多电极构造广泛应用于DNA 的脉冲场分析分离(Lai，E.等，Biotechniques，(1989)，丄，34-42)，其中为了控制DNA迁移 方向以产生更长的有效分离距离，将电压顺次施加到多个电极。对本发明方法应用多个电 极并结合电压自动开关可以用于通过在3维上控制分离以改善DNA彗星之内或之间的DNA 彗星分离。类似地，对于控制设备的底上细胞间隔和定位的基底图案形成方法的变体存在相 当大的范围。当前用于制作和涂敷细胞生长和连接表面的技术提供了多种方法以限定细胞 在表面上的位置和间隔(Hasirci,V.和 Kenar，H. INanomed.，(2006)，丄(1)，73-90)，其可以 在本发明设备中使用以控制最佳DNA彗星分析的细胞与细胞之间的间隔。与现有技术相比，本发明的设备和方法显著提高了彗星测定的速度、效率和通过 量。通过允许在多孔板的孔中平行处理测定样本以及能够在相同的孔中进行原位DNA电 泳，使用本发明设备的方法将避免多种操作的需要，包括在传统彗星测定方案中使用的细 胞悬液的离心和将琼脂糖细胞悬液涂敷到显微镜载玻片上。由于对于每个测试样品来说， 从凝胶固定化到成像的全部步骤均在相同的孔中进行，因此本发明方法与使用自动液体操 作和机器人技术的自动化相兼容。除了与现有技术相比的通过量和效率优势外，本发明提供了原位实施彗星测定而 不是对解聚的(disaggregated)细胞或悬液中的细胞进行测定的手段。常规的彗星测定方 案要求用于分析的细胞悬浮在凝胶溶液中，通常为低熔点琼脂糖。这具有两个缺点。第一， 当通过电泳和成像分析细胞时，细胞会随机地分散在琼脂糖内的不同深度。因此，在任何给 定平面上，一些DNA彗星将会清晰(in focus)，而其它彗星将会模糊，从而难以通过成像进 行定量分析。第二，由于细胞需要处于悬液中以与琼脂糖混合，因此对培养物中的粘附细胞或组织中的细胞的分析需要样本破碎，通常用酶处理，以产生细胞悬液，这样破坏了样本的 形态和群体分布。在本发明方法中，可以对设备的孔中生长的细胞培养物在原位进行彗星测定。细 胞可以固定在琼脂糖中并且在不从生长底物中移出的情况下进行处理，从而允许通过彗星 测定所测量的DNA损伤与通过自动显微镜可测量的其它细胞参数相关，或允许研究样本内 不同细胞亚群中的差异DNA损伤。本方法的另一个优势是，由于细胞可以在与孔的底结合 时用琼脂糖原位覆盖，因此琼脂糖的深度被最小化至覆盖细胞所需的深度，因此将DNA的 电泳分离限制在与成像相容的薄平面。备选地，该方法可以用于组织切片中DNA损伤的原位分析。通过将冷冻组织的薄 切片置于本发明设备的孔中并用琼脂糖覆盖，本发明方法可以用于研究该组织内不同细胞 中DNA损伤的发生。如上所述的电极设计和配置的改变可以用于优化电泳方向以使得能够 实现对组织切片中紧密堆积的细胞进行分析。备选地，该方法可以用于分析采自动物或人受试者的血细胞或其它分离的细胞以 评价测试试剂或环境试剂。通过将细胞置于该设备的孔中并对该板进行离心，可以使待测 试细胞在孔的底上分布成单层，然后用固定化基质覆盖。
权利要求
用于确定细胞中DNA损伤的设备，所述设备包括多孔板，所述板包括孔的阵列，所述孔彼此保持固定关系并且每个孔具有轴、侧壁和底，其中所述孔设置了布置在其中的电极对；并且其中提供了将所述电极对并联到外部电压供给的装置。
2.根据权利要求1所述的设备，其中所述底大体垂直于所述孔的轴。
3.根据权利要求1所述的设备，其中所述多孔板中孔的侧壁为不透明的。
4.根据权利要求1所述的设备，其中所述多孔板中每个孔的底为光学透明的。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的设备，其中所述多孔板的每个孔均安装了一个 电极对。
6.根据权利要求5所述的设备，所述多孔板包括板盖，所述板盖支撑用于将电泳电流 施加到每个孔的电极和电连接装置。
7.根据权利要求5所述的设备，其中所述多孔板的底板包括延伸通过所述板的电极对 阵列，并且其中每个电极对的布置使其配合在所述多孔板的单独的孔内。
8.根据权利要求6或权利要求7所述的设备，其中每个孔内的阳电极和阴电极彼此布 置在相同的水平。
9.根据权利要求6或权利要求7所述的设备，其中每个孔内的阳电极和阴电极相对于 所述孔的底布置在不同的平面上。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的设备，其中每个孔的所述底包括蚀刻到所述底 中的微通道和/或凹点的阵列。
11.一种原位方法，用于通过利用根据权利要求1至10中任一项所述的设备来确定细 胞中的DNA损伤，所述方法包括a)在存在流体培养基的情况下将待测细胞提供在所述设备的一个或多个孔中；b)任选地将所述细胞暴露于测试试剂；c)用固定化基质覆盖所述细胞；d)用细胞裂解和变性试剂处理所述细胞从而提供包含变性细胞DNA的基质；e)将所述变性细胞DNA与电泳溶液接触；f)在造成DNA片段电泳分离的条件下对所述一个或多个孔中的电极施加电压；g)将所述DNA片段与染色剂接触；和h)使用检测手段以观察DNA片段的图案。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述检测包括将所述多孔板中的全部孔成像的 成像手段。
13.根据权利要求11或12中任一项所述的方法，其中彗星测定用于确定细胞中的DNA 损伤。
14.用于确定细胞中DNA损伤的设备的用途，所述设备包括多孔板，所述板包括孔的阵 列，所述孔彼此保持固定关系并且每个孔具有轴、侧壁和底，其中所述孔设置了布置在其中 的电极对；并且其中提供了将所述电极对并联到外部电压供给的装置。
全文摘要
本发明涉及检测细胞DNA损伤的设备和原位方法。本发明特别适合在彗星测定(Comet Assay)中使用并且特别适合该类测定的自动化。所述设备包括多孔板，所述板包括孔的阵列，所述孔彼此保持固定关系并且每个孔具有轴、侧壁和底，其中所述孔设置了布置在所述孔中的电极对，并且其中提供了将所述电极对并联到外部电压供给的装置。
文档编号C12Q1/68GK101939106SQ200880126456
公开日2011年1月5日 申请日期2008年12月5日 优先权日2007年12月5日
发明者M·肯里克, N·托马斯, S·斯塔布斯 申请人:通用电气医疗集团英国有限公司