检测心脏损伤的方法
【专利说明】检测心脏损伤的方法
[0001] 本分案申请是基于申请号为200880021887. 5,申请日为2008年05月12日，发明 名称为"检测心脏损伤的方法"的中国专利申请的分案申请。
[0002] 相关申请的交叉参考
[0003] 本申请依据35USC§ 119(e)要求2007年5月10日提交的美国临时申请系列 No. 60/928, 541的优先权，在此特意将该申请全部引入作为参考。 发明领域
[0004] 本发明涉及医学诊断领域。更特别地，本发明涉及检测患者体内心脏损伤的方法。 本发明还涉及治疗鉴定为患有心脏损伤的患者的方法。本发明还涉及评价设计用来治疗患 者受损心脏的正在进行中的治疗方案的功效的方法。
[0005] 发明背景
[0006]该申请中提及了几个出版物和专利文件，以更全面地描述本发明所属领域的进展 情况。这些出版物和文件每篇的公开内容在此引入作为参考。
[0007]心力衰竭在原因上与损害心脏的多种病症相关，包括冠心病，伴有或没有心脏病 发作；高血压；影响心肌的疾病、感染或毒素；和心瓣膜的疾病。心力衰竭的发作可以快速 发生，从几天至几周，但更常见的是随着心脏逐渐和渐进地变弱，在几年的过程中缓慢发 展。
[0008] 针对患者体内癌细胞负荷降低的治疗干预常常（如果不是总是）伴随各种有害的 副作用。实际上，用作治疗各种癌症的化疗剂的细胞生长抑制剂常常呈现出潜在的致命副 作用，包括心脏毒性。细胞抑制治疗中常用的药剂包括大环内酯类柔红霉素及其前药，佐柔 比星，阿霉素（亚德里亚霉素）和表柔比星，以及合成的抗生素米托蒽醌。大环内酯类，例 如，代表一类基于柔红糖胺和四氢-萘并萘-二酮的化疗剂。将这些化合物用于治疗各种癌 症，包括白血病和淋巴瘤，和乳房、子宫、卵巢和肺的实体肿瘤。除了在正在接受化疗的患者 体内观察到的预期的不利反应，如脱发和恶心以外，涉及大环内酯给药的治疗干预因这类 化合物的明显心脏毒性而复杂化和受到限制。与大环内酯使用相关的心脏毒性与给药的总 剂量相关并且常常是不可逆的。这些化合物的抑制细胞效应和心脏毒性是由于（至少部分 地）由大环内酯结合细胞膜成分引起的膜流动性和渗透性的改变所引起的。还认为心脏中 自由基形成和大环内酯代谢产物的蓄积引起心脏损伤。心脏毒性常常呈现于心电图（EKG) 异常和心律失常中或表现为心肌病，其最终可能导致充血性心力衰竭。
[0009] 发明概述
[0010] 本发明涉及提供新的诊断方法，用于筛选患者以鉴定呈现出心脏损伤病征的那 些。然后用药物制剂治疗如此鉴定的患者，该药物制剂用于治疗在此所述的心脏损伤。在本 发明的特定方面中，提出了筛选患者的方法，以鉴定呈现出由于例如心脏毒性、高血压、瓣 膜障碍、心肌梗塞、病毒性心肌炎或硬皮病引起的心脏损伤信号的那些。在特定的方面中， 本发明集中于鉴定呈现出由化疗干预引起的心脏毒性的患者。这些患者的归类用来鉴定需 要治疗干预以缓解心脏毒性的短期和长期影响的患者亚组。可以用药物制剂治疗如此鉴定 的患者亚组，该药物制剂用于治疗与使用心脏毒性剂量的药物或化学物质相关而产生的心 脏损伤。在其中鉴定的患者的心脏损伤是由于正患有的病症（如高血压、瓣膜障碍、心肌梗 塞、病毒性心肌炎或硬皮病）引起的情况下，也可以配制合适的药物制剂来治疗患有心脏 损伤的患者。
[0011] 本发明还包括根据心脏损伤的程度或类型将患者分级的方法，该知识指导熟练的 医师来选择合适的治疗方案。本发明还包括评价治疗方案的功效的方法。
[0012] 本发明的新方法是基于以下发现：完整的心脏组织中心脏肌钙蛋白I(cTnl)和心 脏肌钙蛋白T(cTnT)的胞内水平变化可以用作心脏损伤存在的指示。更具体地，本发明已 经发现了完整心脏组织中胞内cTnl和cTnT水平的降低作为诊断标记来鉴定处于心脏损伤 风险中或经历心脏损伤的患者。可以从患者摘除心脏组织，并使用本领域已知的分子成像 实验方案在体外测试或在体内分析。
[0013] 使用任一种方法，将对于患者的心脏组织确定的胞内cTnl和cTnT水平与表达野 生型或正常水平的胞内cTnl和cTnT的对照心脏组织的胞内cTnl和cTnT水平相比较。通 过下列方法容易确定患者心脏组织中降低水平的胞内cTnl和/或cTnT，S卩，定量蛋白水平， 这可以使用标准方法来实现，和分析结果以确定相对于对照胞内cTnl和cTnT水平的统计 学上显著的下降在患者的心脏组织中是否明显。将显示出降低的胞内cTnl和/或cTnT水 平迹象的患者作上标记，以使用选定的合适组合物进行治疗，从而恢复（至少部分地）正常 的心脏功能，如通过胞内cTnl和cTnT水平的升高或胞内cTnl和cTnT正常水平的恢复所 反映的。
[0014] 在本发明的实施方案中，通过测定心脏功能正常患者的心脏组织中cTnT或cTnl 任一种胞内水平来建立心脏组织中cTnT或cTnl任一种的对照或正常胞内水平。在本发明 的另一个实施方案中，通过在能够引起心脏损伤的治疗开始之前确定患者心脏组织中cTnT 或cTnl任一种的胞内水平来建立心脏组织中cTnT或cTnl任一种的对照或正常胞内水平。
[0015] 在本发明的一个方面中，心脏损伤是心脏毒性、高血压、瓣膜障碍、心肌梗塞、病毒 性心肌炎或硬皮病的结果。在本发明的再一个方面中，心脏毒性是由使用化疗剂或辐射的 治疗所引起的。
[0016] 通过测量治疗过的患者的心脏组织中的胞内cTnl和cTnT水平来评价设计用来至 少部分地恢复正常心脏功能的治疗方案的功效也在本发明的范围之内。根据本发明，相对 于治疗前测定的胞内cTnl和cTnT水平，治疗过的患者的心脏组织内的胞内cTnl和cTnT 水平的升高是治疗正起作用以恢复心脏功能的阳性指示。
[0017] 应当理解心脏组织中cTnl或cTnT任一种的胞内水平或心脏组织中cTnl和cTnT 两者的胞内水平可以用作心脏组织活动和/或功能的指示。这适用于本发明的所有方面， 包括涉及评价或诊断心脏损伤的方法，涉及相对于特定的治疗方案将患者分级的方法和涉 及评价治疗方案的功效的方法。
[0018] 根据本发明，心脏组织中降低的cTnl和/或cTnTmRNA水平也表示心脏损伤，并 可以用来将患者群分级。因此，正常cTnl和/或cTnTmRNA水平的部分或完全恢复也是如 上所述就蛋白水平而论的治疗功效的阳性指示。
[0019] 一般来说，本发明涉及动物，更具体地，涉及哺乳动物，更特别地，涉及人。因此，患 者优选是动物，包括但不限于如奶牛、猪、马、鸡、猫、狗等的动物，并且优选哺乳动物，最优 选人。因此，术语"患者"或"病人"可以用来指人。
[0020] 本发明还包括联合治疗方案，其中将GGF2或由神经调节蛋白基因编码的表皮生 长因子样（EGFL)结构域和蛋白酶体抑制剂一起来给药，以治疗心脏损伤。用于本发明中的 示例性蛋白酶体抑制剂是Proscript519,其是有效的和选择性的蛋白酶体抑制剂。在本发 明中有用的其他蛋白酶体抑制剂包括Velcade?和乳胞素。另外的蛋白酶体抑制剂是本领 域技术人员已知的。实际上，蛋白酶体抑制剂已经用作治疗剂，用于治疗各种疾病，包括一 些癌症和神经变性疾病。
[0021] 本发明还包括GGF2或由神经调节蛋白基因编码的表皮生长因子样（EGFL)结构域 在制备药物中的用途，该药物给予通过本发明的诊断方法鉴定为呈现出心脏损伤的患者。 本发明进一步包括GGF2或由神经调节蛋白基因编码的表皮生长因子样（EGFL)结构域和蛋 白酶体抑制剂一起在制备药物中的用途，该药物给予通过本发明的诊断方法鉴定为呈现出 心脏损伤的患者。
[0022] 从以下优选实施方案的描述和从权利要求书中将清楚本发明的其他特征和优点。
[0023] 附图简述
[0024] 图1A-1C显示了存活图（A)、柱状图（B-C)和免疫印迹（C)。对于存活分析 (A)，给小鼠注射单剂量的阿霉素[20mg/kg，腹膜内（i.p.)]，使用或没用伴随的注射 NRG1(0. 75mg/kg，s.c.每日）。通过Kaplan-Meier方法分析十四天存活。关于血清肌酸激 酶（CK)水平的测定（B)，在对照、Dox-处理和阿霉素注射后四天Dox-NRGl处理的小鼠中测 量血清CK水平。图1C显示了NRG1注射减轻了小鼠中阿霉素诱导的cTnI、cTnT和cTnC蛋 白水平的下调。用阿霉素（20mg/kg，i.p.)处理小鼠，使用或没用伴随的NRG1注射（0. 75mg/ kg，s.c.每日）。阿霉素处理后五天，通过Western印迹分析测量cTnI、cTnT和cTnC的蛋 白水平。
[0025] 图2A-D显示了探测的免疫印迹，来检测所示的蛋白。图2A揭示了NRG1减轻了 新生大鼠心肌细胞（RNCM)中阿霉素诱导的cTnl和cTnT蛋白水平的下调。在NRG1 (20ng/ ml或50ng/ml)的存在或不存在下，用阿霉素（lyM)处理RNCM。阿霉素处理后48小时，通 过Western印迹分析测量cTnl和cTnT蛋白水平。图2B显示了erbB2的抑制消除了NRG1 对cTnl和cTnT的作用。在AG879(10yM)和AG1478(10yM)的存在和不存在下，用阿霉素 (1yM)和NRG1 (20ng/ml)处理RNCM。通过Western印迹分析来分析cTnl和cTnT的蛋白 水平。如图2(：中所示的，在1^294002(10 1^)、六1^1(5 1^)、？098059(50 1^)和雷帕霉素 (10nM)的存在下，用阿霉素和NRG1处理RNCM。通过Western印迹分析来分析cTnl和cTnT 蛋白水平。图2D显示了在放线菌酮（5yg/ml)、Z-VAD(100yM)或MG132(10yM)的存在 下，用阿霉素或阿霉素+NRG1处理RNCM。通过Western印迹分析来测量cTnl和cTnT的蛋 白水平。
[0026] 图3A-3D显示了免疫印迹（A、C、D)和柱状图（B)。图3A呈现了其中在不同天冬 氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂（20yM)的存在下用阿霉素（lyM)处理RNCM的结果。 通过Western印迹分析来测量cTnl和cTnT的蛋白水平。图3B显示了阿霉素处理的RNCM 中天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶激活的作用。用Dox、Dox+NRGl或Dox+NRGl+LY处理细 胞。通过天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶激活测试来分析天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶 激活。图3C显示了