条件性毒性的工程化酶原的制作方法

专利名称：条件性毒性的工程化酶原的制作方法
技术领域：
本发明总体上涉及生物学、生物化学、和蛋白质工程这些领域。特别是，本发明涉 及显示条件性毒性(conditional toxicity)的毒性蛋白的酶原，这些酶原在非靶宿主生物 或细胞中是良性的，而在靶生物或细胞中是有毒性的。本发明进一步涉及对这些显示条件 性毒性的毒素进行设计、制造、和使用的方法。背景细菌性ADP-核糖基化毒素是由病原性细菌产生的蛋白，它们通常被分泌到细胞 外的培养基并且通过改变真核细胞的代谢作用而导致疾病(Rappuoli and Pizza, 1991) 0 ADP-核糖基化毒素在将该ADP-核糖部分选择性地连接至它们的靶蛋白之前使NAD分解成 其组成部分(烟酰胺和ADP-核糖)。在这些毒素的大多数中，这些靶是细胞功能的关键调 节剂，并且由ADP-核糖基化所引起的对它们的活性干扰导致了关键细胞加工的严重失调 并且在大多数情况下最终导致细胞死亡。杀虫性二元毒素的新家族(被命名为Vipl和Vip2)在营养生长阶段已经从芽 胞杆菌属中分离出，其中Vipl可能靶向昆虫肠细胞，和Vip2充当将肌动蛋白核糖基化的 ADP-核糖基转移酶。这种Vipl_Vip2 二元毒素在20-40ng/g饵料(diet)下是对抗玉米根 虫(corn root worm)(玉米的重要害虫)的有效杀虫剂。Vipl_Vip2复合物代表着一类不同于经典的A-B毒素(例如，霍乱毒素)的二元 毒素，这些经典的A-B毒素必须组装到复合物(由两个功能不同的亚基或结构域组成)中 用于发挥活性。在Vipl-Vip2类的二元毒素中每种多肽很明显地是分开发挥功能的，其中 结合膜的IOOkDa的Vipl多聚体可推定结合着细胞表面受体并且有利于中这种52kDa的 Vip2 ADP-核糖基转移酶的递送以进入靶玉米根虫细胞的细胞质。Vipl和Vip2两者均是 对抗玉米根虫的最大活性所要求的。NAD-依赖的ADP-核糖基转移酶Vip2可能在Argl77 上修饰单体的肌动蛋白以阻断聚合，导致肌动蛋白细胞骨架的损失和最终细胞死亡，这是 由于在体内在肌动蛋白微丝之内快速的亚基交换的缘故。1999年，Vip2的三维结构得以解 决(Han et al. , 1999, Nature Structural Biology6 :932_936)。Han 等确定Vip2 蛋白 是混合的α/β蛋白并且被分成两个结构域，称为N-结构域(残基60-265)和C-结构域 (残基266-461)，它们可能代表这些二元ADP-核糖基化毒素的全部类别。Han等鉴定了几 种在Vip2-样毒素的生物活性方面重要的结构特征，包括在E428上的催化残基，在Y307、 R349、E355、F397、和R400上的NAD结合残基，使这种NAD结合袋稳定的“STS基序”(残基 386-388)、和由残基E426和E428形成的NAD结合袋。因为Vip2与其他二元毒素(例如，肉毒梭菌C2毒素(Clostridium botulinumm C2 toxin) (Aktories 等，1986)、产气荚膜梭菌极微小毒素(Clostridium perfringens iota toxin) (Vandekerckhove 等，1987)、螺状梭菌(Clostridium spiroforme)毒素(Popoff 禾口 Boquet, 1987)和由艰难梭菌所产生的ADP-核糖基转移酶(Popoff等，1988))的酶组分共 有显著的序列相似性，Vip2代表肌动蛋白-ADP-核糖基化毒素家族。尽管这种Vipl_Vip2 二元毒素具有商业潜在性而成为特异且有效的玉米根虫控制剂用于转基因作物(例如，玉米)，在植物中Vipl-Vip2复合物的表达一直被以下事实制 约Vip2在植物细胞中表达导致严重的发育病理学和对该植物其本身的表型的改变。因 此，存在着总体需求来提供设计并制造显示出条件性毒性活性的毒性蛋白，其中该毒素在 非靶宿主生物或细胞中作为酶原可以成为良性的，而在靶生物或细胞中是有毒的。更确切 地说，存在着需求以便保护表达ADP-核糖基化毒素(例如，Vip2)的非靶生物或细胞免于 该毒素的副作用、并且在受到靶向的活系统(例如，昆虫害虫)之内仍保持该毒性活性。当 这种非靶生物在实验室中不容易进行试验时(例如，植物)，存在着进一步的需求来研究替 代品遗传系统以便更加有效地对酶原进行设计和测试。大多数天然存在的酶原将它们的前肽定位在N-端，考虑到该前肽区域的合成在 该催化单元之前这似乎是合理的，由此防止该酶原的任何过度激活(LaZUre，2002)。然 而，已经报道来自水生栖热菌(Thermus aquaticus)的枯草杆菌蛋白酶型丝氨酸蛋白酶 (Aqualysin I)的C端前体序列妨碍了该前体的蛋白质分解激活(Lee等，1992)。然而，阻 断蛋白质分解的激活确实没有解决本发明所提出的问题。在这里，需要酶原，该酶原在活系 统(例如，植物)中是良性的，但是在靶生物系统(例如，以该植物为食的昆虫害虫)中被 蛋白质分解性地激活。概述考虑到这些需求，本发明的目的是提供对毒性蛋白的酶原进行设计、制造、并且使 用的方法，由此该酶原在非靶宿主生物或细胞中是良性的，并且其中该酶原能够在靶生物 或细胞中被激活并且是有毒的。本发明的另一目的是提供对毒性蛋白的酶原进行编码的新 颖的核酸序列，这些毒性蛋白酶原在非靶宿主生物或细胞中是良性的，而在靶生物或细胞 中是有毒的。本发明进一步涉及从这些核酸序列的表达中生成的新颖的酶原、和包含这些 酶原的组合物和配制品，它们在非靶宿主生物或细胞中是良性的，而在靶生物或细胞中是 有毒的。本发明进一步提供能够有效选择的方法和遗传系统用于对酶原前体进行识别，其 中在这些前体中所包含的毒性蛋白是无活性的或基本上无活性的。在一方面，本发明提供了毒性蛋白的工程化的酶原，该酶原具有融合至该毒性蛋 白的C端或N端的多肽链延伸(extension)，其中该酶原在非靶生物或细胞中是良性的，并 且其中当该酶原靶生物在靶生物或细胞中时该酶原被转变为毒性蛋白。在该方面的一个实 施方案中，该毒性蛋白是ADP-核糖基转移酶。这种ADP-核糖基转移酶典型地将靶生物或 细胞的肌动蛋白核糖基化。在另一个方面，本发明提供了工程化的酶原，其中这种ADP-核糖基转移酶包括氨 基酸序列，该氨基酸序列具有与SEQ ID NO :9至少69%、或78%、或85%、或93%、或95% 的序列同一性，并且其中这种ADP-核糖基转移酶具有催化残基(该残基对应于SEQ ID NO 9的E428)、和NAD结合残基(这些残基对应于SEQ ID NO 9的Y307、R349、E355、F397、和 R400)。在该方面的一个实施方案中，该ADP-核糖基转移酶是杀虫性的。在该方面的其他 实施方案中，这种杀虫性ADP-核糖基转移酶是Vip2毒素。在该方面的其他实施方案中，这 种 Vip2 毒素选自下组SEQ ID NO :9、10、15、16、17、18、和 19。在一方面，本发明提供了酶原，其中该多肽链延伸包括氨基酸序列，该氨基酸序列 长度为至少21个残基并且在位置3、14、和19上具有色氨酸(Trp ；W)。在该方面的一个实 施方案中，该多肽延伸包括SEQ ID NO :6。
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在另一方面，本发明提供了酶原，其中该多肽链延伸包括SEQ ID NO :8。在又另一方面，本发明的多肽链延伸被融合至该ADP-核糖基转移酶的C端。在另一方面，本发明提供了酶原，其中该非靶生物或细胞是植物或植物细胞。在 这一方面的一个实施方案中，该植物或植物细胞选自下组高粱、小麦、番茄、甘蓝类作物 (cole crops)、棉花、稻、大豆、糖甜菜、甘蔗、烟草、大麦、油籽油菜(oilseed rape)、和玉 米。在又另一方面，本发明提供了酶原，其中该非靶生物或细胞是酵母。在该方面的一 个实施方案中，该酵母是酿酒酵母。在另一方面，本发明提供了酶原，该酶原包括SEQ ID NO 11或SEQ IDNO :12。在另一方面，本发明提供了分离的核酸分子(包括对本发明的酶原进行编码的核 酸序列)；包括该核酸分子的重组载体；包括该重组载体的酵母细胞；和包括该重组载体的 转基因植物或植物细胞。在该方面的一个实施方案中，该酵母细胞是酿酒酵母。在又另一 实施方案中，该转基因植物或植物细胞是玉米植物或玉米植物细胞。在又另一方面，本发明提供了制造毒性蛋白的酶原的方法，该方法包括以下步骤 a)设计从该毒性蛋白的一端延伸的多肽链；b)形成表达质粒的库，这些表达质粒在转化进 入遗传系统时将表达包括该多肽链的酶原前体；c)在天然地易受该毒性蛋白影响的遗传 系统中表达该酶原前体；d)回收在步骤(c)中存活的遗传系统的生物或细胞；e)将这些前 体从步骤(d)的这些生物或细胞中分离；f)对这些前体测试针对靶生物或细胞的生物活 性；并且g)鉴定作为酶原的这些具有生物学活性的前体。在该方面的一实施方案中，该毒 性蛋白是杀虫性的肌动蛋白核糖基化的ADP-核糖基转移酶。在该方面的其他实施方案中， 该ADP-核糖基转移酶是Vip2毒素。在该方面的又另一实施方案中，该Vip2毒素选自下 组SEQ ID N0:9、10、15、16、17、18、和19。在该方面的其他实施方案中，该库包括多个随机 的氨基酸序列，这些序列具有至少21个残基并且在位置3、14、和19上具有色氨酸(Trp ； W)残基。在该方面的又另一实施方案中，该遗传系统是真核生物或细胞。在该方面的其他 实施方案中，该遗传系统是酵母。在又另一实施方案中，该酵母是酿酒酵母。在该方面的其 他实施方案中，该靶生物或细胞是真核的或原核的。在又另一实施方案中，该靶生物或细 胞是昆虫或昆虫细胞。在该方面的其他实施方案中，该昆虫或昆虫细胞是属于根萤叶甲属 (Diabrotica)的。在又另一实施方案中，该昆虫或昆虫细胞是玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera西方玉米根虫)、长角叶甲(D. Iongicornis北方玉米根虫)、或D. virgifera zeae (墨西哥玉米根虫)。在该方面的其他实施方案中，该酶原在该靶细胞中是具有生物学 活性的。在另一方面，本发明提供了遗传系统，该遗传系统允许有效识别毒性蛋白的工程 化的酶原，其中在该前体中这种毒性蛋白是无活性的或基本上无活性的，并且其中该酶原 在非靶宿主生物或细胞中是良性的，并且其中当该酶原靶生物在靶生物或细胞中时该酶原 被转变为毒性蛋白。在该方面的一实施方案中，该遗传系统作为针对非靶生物或细胞的替 代品。在另一实施方案中，这种工程化的酶原包括从该毒性蛋白的C端或N端延伸出的多 肽链。在该方面的又另一实施方案中，该遗传系统是酵母，并且该非靶生物或细胞是植物或 植物细胞。在该方面的其他实施方案中，该植物或植物细胞是玉米。在该方面的又另一实 施方案中，该靶生物是病原性细胞或生物，并且该毒性蛋白是肌动蛋白核糖基化的ADP-核糖基转移酶。在又另一方面中，提供了包含本发明的新酶原的药用组合物。此类药用组合物作 为例如抗癌剂应当具有疗效。本发明的其他目的、特征、和优点在考虑以下详细说明时将会变得清楚。这些附图的几份视图的简要说明

图1是Vip2毒素的模型，它证明了前肽概念。A 显示了 NAD的Vip2_NAD复合物 在Vip2的C端酶结构域之内结合在劈开部分(cleft)上。B:显示了 C端多肽链(存在于 proVip2(箭头1和2)中，作为干扰该NAD结合部位)的延伸的可能效应。分子绘图程序 WebLab ViewerPro 3. 7 (Accelrys, San Diego, CA)用于将蛋白质结构可视化。Vip2 同等物 可见于在PDB数据库，登录号为IQSl。图2是体内遗传系统的例证，用于选择功能失常的Vip2变体。使用质粒来转化酿 酒酵母的感受态细胞，这种质粒携带对天然Vip2蛋白或无活性的Vip2突变体(E428G)进 行编码的基因。在转化之后，将细胞在具有棉子糖的板上进行铺板，提供了来自GALl启动 子的渗漏表达。图3是在诱变之后所选择的前肽序列。在对21个氨基酸残基进行随机化之后所选 择的核心前肽序列(4-4-12)和在第二轮诱变之后所选择的proVip2序列。单一的核苷酸 突变(A至T)产生了在该前肽区域中第九个氨基酸(E至V)的取代。在易错PCR过程中所 获得的核苷酸插入部分(insertion)产生了多肽链从21位至49位氨基酸的移码和延伸。 移码(*)点在该多肽链延伸的氨基酸#11 (F)之后发生。图4是用野生型酶(Vip2)及其工程化的前酶(proVip2)进行的肌动蛋白ADP-核 糖基化的时间过程。这种ADP-核糖基化反应是如在实施例5中所说明进行的。将等分部 分在不同时间点下从反应中取出，并且通过SDS-PAGE对其进行分辨。将蛋白转移到PVDF 膜上，并且通过放射线照相术使ADP-核糖基化的肌动蛋白显像。图5是在来自转基因proVip2植物的根提取物中ADP-核糖基化活性的显示。根 蛋白的提取和ADP-核糖基化反应时如在实施例7中所说明进行的。将酶促反应的等分部 分在不同的时点(1、3、5、15、60分钟)下取出并且经受SDS-PAGE。在印迹到PVDF膜上之 后，通过自动放射线照相术使ADP-核糖基化的肌动蛋白显像。图6显示了在西方玉米根虫中Vip2蛋白的消化结果。在进食30分钟 和90分钟之后，在西方玉米根虫全虫(whole body)均浆中检出的Vip2变体。泳 道1. S-tag-proVip2 (30min)、2. S-tag-proVip2 (90min)、3· proVip2(30min)、 4.proVip2 (90min),5. S-tag-Vip2(30min)、6. S-tag-Vip2(90min),7. Vip2(30min)、 8. Vip2 (90min)o实心箭头表示与Vip2 (空心箭头)共移动的被推定的活化型的proVip2 蛋白。图7显示了(A)酶测定和(B)工程化的酶前体(泳道2和4)和在进食之后3天 从WCRW幼虫的粪便中收集的它们的经处理的形成物(泳道3和5)的蛋白质印迹结果。泳 道1· MW标记物；2. proVip2 ；3.从虫粪中收集的proVip2 ；4. S_tag-proVip2 ；5.从虫粪中 收集的 S-tag-proVip2 ；6. Vip2。在序列表中序列的简要说明SEQ ID NO 1_5是在本发明中有用的寡核苷酸引物。
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SEQIDNO6是在所述4-4-12酶原中所包含的前肽的氨基酸序列。
SEQIDNO7是核心前肽序列。
SEQIDNO8显示了在proVip2-39T和proVip2_39A酶原中包含的前肽的氨基酸序列。
SEQIDNO9是天然的全长Vip2A ADP-核糖基转移酶的氨基酸序列。
SEQIDNO:10是平截的Vip2 ADP-核糖基转移酶的氨基酸序列。
SEQIDNO11是这种4-4-12酶原的氨基酸序列。
SEQIDNO:12是proVip2-39-T和proVip2_39A酶原的氨基酸序列。
SEQIDNO:13是pN0V4500的核苷酸序列。
SEQIDNO:14是pN0V4501的核苷酸序列。
SEQIDNO15-19是杀虫性的ADP-核糖基转移酶的氨基酸序列。
SEQIDNO20-23是非芽胞杆菌ADP-核糖基转移酶的氨基酸序列。
定义
除非另外定义，在此所使用的全部技术术语和科学术语具有与属于本发明的领域
之内的普通技术人员通常所理解的相同的意思。在此提及的全部专利、申请、已公布的申请 和其他公开文件和来自GenBank及其他数据库的序列都通过引用以其全文进行结合。为清 楚起见，在本说明书中所使用的某些术语被定义并呈现如下。在本发明的背景下，“对应于”(corresponding to)是指在将某些蛋白的氨基酸序 列与参比氨基酸序列比对时，在该参比氨基酸序列中与某些列举的位置比对的氨基酸(例 如但不限于，Vip2毒素(SEQ ID NO 9或SEQID NO 10)(但是那不是必须在这些相对于该 参比氨基酸序列的精确位置中彼此“对应”。这种比对的实施例显示在表1中。例如，该催 化残基 Isp2a(SEQ ID NO 18)的 E423 “对应于”Vip2 (SEQ ID NO 9)的 E428 残基，这是在 SEQ ID NO :9用作这种参比氨基酸序列时进行的。如在此所使用的，酶原是毒性蛋白的无活性的或基本上无活性的前肽，该前肽是 可以在靶生物或细胞中激活的。酶原总体上是较大的，尽管不必大于该毒性蛋白。酶原在 靶生物或细胞中可以被激活剂转变成具有活性的毒素。这种激活剂(例如但没有限制性) 可以是蛋白酶或蛋白酶的组合，它在靶生物或细胞中产生成熟的具有活性的毒素。因此，本 发明的酶原在非靶生物或细胞(例如，植物或植物细胞或酵母细胞)中是良性的(具有很 少或无有害的作用)，并且在靶生物或细胞(例如，在昆虫或昆虫细胞中)中被转变成毒性 蛋白。如在此所使用的，同源的是指大于或等于25%的核酸或氨基酸序列同一性，典型 地 25%,40%,60%,61%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,75%,78%, 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99% ；若有必要，可以对 精确的百分数进行限定。出于在此的目的，术语“同源”和“同一性”经常是可互换地使用 的。总体上，为了确定同一性百分比，对多个序列进行了比对，这样就获得了最高次序的匹 配(参见例如!Computational Molecular Biology, Lesk, Α. Μ.，ed.，Oxford University Press，New York，1988 ；Biocomputing Jnformatics and Genome Projects，Smith，D. W.， ed.，Academic Press，New York，1993 ；Computer Analysis of Sequence Data，Part I， Griffin，A. M.，and Griffin，H. G.，eds.，Humana Press，New Jersey, 1994 ；Sequence
8Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G. , Academic Press,1987 ；禾口 Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J. , eds. , M Stockton Press, New York, 1991 ；Carillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48 :1073)。通过序列同一性，通过标准 比对算法程序来确定保守的氨基酸的数目，并且将其与由每个供应商所建立的默认缺口罚 分一起使用。基本上同源的核酸分子将典型地在中等严格条件或在高严格条件下沿着所感 兴趣的核酸的长度进行杂交。还考虑了以下核酸分子，这些核酸分子含有代替这种杂交性 的核酸分子中的密码子的简并密码子。任何核苷酸或氨基酸序列的同一性或同源性可以使用已知的计算机算法(例 如，“FAST Α” 程序)来确定，使用了(例如)Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 2444中的默认参数(其他程序包括GCG程序包(Devereux，J.，et al.，Nucleic Acids Research 12(1) :387(1984))、BLASTP, BLASTN, FASTA(Atschul，S. F.，et al.，J Molec Biol 215:403(1990) ；Guide to Huge Computers,Martin J. Bishop,ed. ,Academic Press, San Diego，1994，和 Carillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073)。例如， 国家生物技术情报数据库中心(the National Center for Biotechnology Information database)的BLAST功能可用于确定同一性。其他可商购的或公众可获得的程序包括 DNAStar "MegAlign，，程序(Madison、Wis.)禾口 the University of Wisconsin Genetics Computer Group (UffG)的“Gap”程序(Madison Wis)。蛋白和/或核酸分子的同源性或同 一性百分数可以通过以下方式来确定，例如通过使用GAP计算机程序将序列信息进行比 较(例如，Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48 :443，如由 Smith 和 Waterman 所修订 ((1981) Adv. Appl. Math. 2 482)。简言之，这种GAP程序将相似性定义为相似的比对符号 (即，核苷酸或氨基酸)的数目除以在这两种序列中较短序列的符号的总数目。用于该GAP 程序的默认参数可以包括(1) 一元的比较矩阵(包含数值1(对于同一性)和数值0(对 于非同一性))和 Gribskov et al. (1986)Nucl. Acids Res. 14:6745 的权重比较矩阵(如 由 Schwartz and Dayhoff, eds.，ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, National Biomedical Research Foundation,pp. 353 358(1979)所说明)；(2)(罚分 3.0)对于每个 缺口(gap)，和额外的0. 10罚分(对于每个缺口中的每个符号)；和(3)没有罚分(对于末 端缺口)。所以，如在此使用的，术语“同一性”代表在测试品与参比多肽或多核苷酸之间的 比较。如在此所使用的，例如术语至少“与90% —致的”(90%同一性)是指相对于这些 参比多肽从90%至99. 99%的同一性百分率。在90%或更高水平的同一性指示了以下事 实推定出于示范性目的，将测试品与长度为100个氨基酸的参比多核苷酸进行比较。在这 种试验多肽中不超过10% (即，100个有10个)的氨基酸区别于这些参比多肽的氨基酸。 类似的比较可以在试验品与参比多核苷酸之间进行。此类差异可以被表示为随机地分布于 氨基酸序列的全部长度内的点突变、或者可以将它们簇集在一个或多个位置，这些位置具 有不同长度(高达可允许的最大值，例如100个中有10个氨基酸差异(大约90%的同一 性))。差异被称为核酸或氨基酸的取代、或缺失。在大约85%至90%以上的同源性或同一 性的水平下，该结果应当不依赖与该程序和这些缺口参数设置；此类高水平的同一性可以 容易地进行评定，经常不需要依靠软件。两核酸序列基本上相同的另一指标是这两种分子在严格条件下彼此杂交。短语
9“特异性杂交”是指分子在严格条件下仅可与特定的核苷酸序列结合、双链化或杂交，这是 在该序列存在于复合混合物(例如，总细胞的)DNA或RNA中时进行的。“基本上结合”是指 在探针核酸与靶核酸之间的互补性杂交，并且涵盖了少量错配，这些错配可以通过降低该 杂交介质的严格性来适应，从而实现对这种靶核酸序列的令人希望的检测。在核酸杂交实验的背景下(例如，DNA及RNA杂交)“严格杂交条件”和“严格杂 交洗涤条件”是序列依赖的，并且在不同的环境参数下是不同的。较长的序列在较高的温度 下进行特异性地杂交。对核酸杂交的广泛指导见于Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2" Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays" Elsevier,New York。总体上,高严格条件杂交和洗涤条件 被选定为比该特异性序列(Tm)的热解链点低大约5°C (在限定的离子强度和pH下)。典 型地，在“严格条件”下，探针将会与它的靶序列进行杂交，但不会与任何其他序列杂交。Tffl是50%的试验序列与完全匹配的探针进行杂交所处的温度(在限定离子强度 及PH下)。“极度严格条件”选择为等于针对特定探针的Tm。用于互补核酸(它们在DNA 或RNA印迹中在滤纸上具有超过100个互补的残基)的杂交的严格杂交条件的例子是具有 Img肝素的50%甲酰胺、在42°C、将该杂交过夜进行。高严格洗涤条件的例子是0. 15M NaCl 在72°C持续大约15分钟。严格洗涤条件的例子是在65°C以0. 2xSSC洗涤达15分钟(参 见Sambrook，以下针对SSC缓冲液的说明)。通常，高严格洗涤之前会先进行低严格洗涤， 以便除去背景探针信号。对于具有(例如)超过100个核苷酸的双链体的严格洗涤介质的 例子是在45°C以IxSSC持续15分钟。对于具有(例如)超过100个核苷酸的双链体的低 严格洗涤的例子是在40°C以4-6x SSC持续15分钟。对于短探针(例如，大约10-50个核 苷酸)，严格条件典型地涉及小于约1. OM的Na离子的盐浓度，典型地在pH 7. 0-8. 3下大约 0. 01至1. OM的Na离子浓度(或其他盐类)，并且该温度典型地是至少约30°C。严格条件 还可以用添加去稳定剂(例如，甲酰胺)来达到。总体上，在这种特定的杂交测定中与针对 非相关的探针所观测到的相比，2倍(或更高)的信噪比指示了特异性杂交的测定。这些在 严格条件下彼此不杂交的核酸仍然是基本上一致的，条件是它们所编码的蛋白是基本上一 致的。这是(例如)在使用由该遗传密码所允许的最大密码子简并时产生核酸拷贝时发生 的。以下是可以用来克隆同源核苷酸序列(这些序列是与本发明的参比核苷酸序列 基本上一致的)的杂交/洗涤条件的设置的例子参比核苷酸序列在以下条件下优选地与 该参比核苷酸序列杂交在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0. 5M NaPO4UmM EDTA中在50°C，并 且在2x SSC、0. 1%SDS中在50°C洗涤；更令人希望的是在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0. 5M NaPO4UmM EDTA种在50°C，并且在Ix SSC、0. 1% SDS中在50°C洗涤；仍又更加令人希望的 是在 7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0. 5M NaPO4UmM EDTA 中在 50°C，并且在 0. 5xSSC、0. 1 % SDS中在50°C洗涤；优选在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0. 5M NaPO4UmM EDTA中在50°C，并 且在0. IxSSC,0. SDS中在50°C洗涤；更优选在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0. 5MNaP04、 ImM EDTA 中在 50°C，并且在 0. IxSSC,0. 1% SDS 中在 65°C洗涤。两个核酸序列或蛋白基本上是一致的(同一性)另一指示是指由该第一核酸编码 的蛋白与由该第二核酸编码的蛋白进行免疫性交联反应或与其特异性结合。因此，蛋白典型地是与第二蛋白基本上一致的，例如其中这两种蛋白仅区别于保守性取代。如在此使用的，引物是指寡核苷酸，该寡核苷酸包含两种或多种脱氧核糖核苷酸 或核糖核苷酸(通常上超过三种)，可以从这种寡核苷酸来起始引物延伸产物的合成。有助 于合成的试验条件包括存在着三磷酸核苷和用于聚合和延伸的试剂(例如，DNA聚合酶)、 和适当的缓冲液、温度和PH。众所周知，在编码特异性氨基酸的不同密码子中存在着大量的重复。所以，本发明 还是涉及那些包含可替换的(alternative)密码子的DNA序列，这些密码子对这种一致的 氨基酸的最终翻译进行编码。出于本说明书的目的，带有一个或多个取代的密码子的序列 被定义为简并变体。在本发明范围内还包括了在这种DNA序列或这种已翻译的蛋白中的突 变，该突变没有改变这种已表达的蛋白的最终物理性质。此类改变的例子包括脂肪族氨 基酸取代为另一脂肪族氨基酸、芳香族氨基酸取代为芳香族氨基酸、酸性氨基酸取代为另 一酸性氨基酸、或碱性氨基酸取代为另一碱性氨基酸可能不会导致在该多肽的功能方面的 变化。而且，可以进行更为明显的基团取代，条件是该残基的功能将保持多肽溶解度，包括 电荷反转。众所周知，对肽进行编码的DNA序列可以被改变，由此对多肽进行编码，该多肽 具有的特性与这种天然存在的肽的那些特性不同。改变这些DNA序列的方法包括但不局限 于位点定向诱变。如在此所使用的，毒性活性可以被理解为是指由细胞的死亡或阻止任何细胞功能 所导致的任何作用，包括但不限于有丝分裂或减数分裂。“转化”是用于将异源核酸引入到宿主细胞或生物中的过程。特别是，“转化”是指 将DNA分子整合进入到感兴趣的生物的基因组中。“转化/转基因的/重组的”是指宿主生物(例如，细菌或植物)，其中已经引入了 异源的核酸分子。该核酸分子可以被稳定地整合到该宿主的基因组中，或者该核酸分子还 可以作为染色体外分子存在。这种染色体外分子可以是自主复制的。经转化的细胞、组织、 或植物可以被理解为不仅涵盖了转化过程的最终产物，还涵盖了它的转基因子代。“非转化 的”、“非转基因的”、或“非重组的”宿主是指野生型生物(例如，细菌或植物)，该生物不包 含这种异源的核酸分子。核苷酸通过其碱基由以下标准缩写进行指示腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶 (T)、和鸟嘌呤(G)。氨基酸由以下标准缩写进行类似地指示丙氨酸(Ala ；Α)、精氨酸(Arg ； R)、天冬酰胺(Asn ；N)、天冬氨酸(Asp ；D)、半胱氨酸(Cys ；C)、谷氨酰胺(Gln ；Q)、谷氨酸 (Glu ；E)、甘氨酸(Gly ；G)、组氨酸(His ;H)、异亮氨酸(lie ;1)、亮氨酸(Leu ;L)、赖氨酸 (Lys ；K)、甲硫氨酸(Met ；Μ)、苯丙氨酸(Phe ；F)、脯氨酸(Pro ；P)、丝氨酸(Ser ； S)、苏氨酸 (Thr ；T)、色氨酸(Trp ；W)、酪氨酸(Tyr ；Y)、和缬氨酸(Val ；V)。详细说明细菌性ADP-核糖基化毒素是由病原性细菌产生的蛋白，它们通常被分泌到细 胞外的培养基中并且通过改变真核细胞的代谢作用而导致疾病(Rappuoli and Pizza, 1991)。这些酶催化了这种ADP-核糖基团从NAD向具有烟酰胺释放的靶蛋白的转移。由于 肌动蛋白这种在真核细胞中主要的细胞骨架形成蛋白是针对Vip2 ADP-核糖基转移酶的第 一核糖基化靶，Vip2在植物细胞中的细胞内表达也许是实际的挑战。使用Vip2的早期玉米转化实验表明，所有转基因植物在发育过程中都具有异常
11表现型和问题。经转化的植物其生长在非常早的发育阶段就停止下来。此外，设计为将Vip2 蛋白靶向进入细胞质外空间(非原质体)的实验没有显著性地改进植物病理学的症状。所 以，需要其他方法，从而保护植物、非靶有机体免于Vip2毒性活性同时又在靶有机体或细 胞(例如，昆虫中)保持这种毒性活性。在此显示的是有可能设计出毒性蛋白的新酶原，这些酶原在非靶生物或细胞中是 良性的，并且仅当在靶生物或细胞中被激活剂作用时成为有毒的。在此还教导的是再次工 程化的蛋白可以包括改变天毒性蛋白的C端或N端而不必是这种毒性蛋白无活性。基于 这些教导内容，目前可能的是将特定的酶原设计成仅在靶有机体或细胞中是有活性的，同 时仍保留着发挥适当的生物活性的能力。在一实施方案中，本发明涵盖了毒性蛋白的工程化的酶原，该酶原具有多肽链延 伸，该部分融合至该毒性蛋白的C端或N端上，其中该酶原在非靶生物或细胞中是良性的， 并且其中当该酶原靶生物在靶生物或细胞中时该酶原被转变为毒性蛋白。在另一实施方案中，本发明涵盖了毒性蛋白的工程化的酶原，该酶原的氨基酸序 列与该毒性蛋白的氨基酸序列通过以下变化而有所不同，这些变化包括(a)从这种毒性蛋 白的天然羧基端或氨基端延伸的一条多肽链的添加、和(b)在该酶原中新的羧基端或氨基 端的引入，该酶原能够在靶有机体或者细胞内转变成毒性蛋白。在又另一实施方案中，本发明涵盖了酶原，其中该毒性蛋白是ADP-核糖基转移 酶。典型地，该ADP-核糖基转移酶将肌动蛋白核糖基化。在另一实施方案中，本发明涵盖了酶原，其中该ADP-核糖基转移酶包括氨基酸序 列，该氨基酸序列具有与SEQ ID NO :9至少69%、或78%、或85%、或93%、或95%的序列 同一性，并且其中这种ADP-核糖基转移酶具有催化残基(该残基对应于SEQ ID N0:9的 E428)、和多个NAD结合残基(这些残基对应于SEQ ID NO 9的Y307、R349、E355、F397、和 R400)。在这一实施方案的一方面，该ADP-核糖基转移酶是杀虫性的。在又另一实施方案中，本发明涵盖了酶原，其中该ADP-核糖基转移酶是Vip2毒 素。在这一实施方案的一方面，该Vip2毒素选自下组SEQ ID NO :9、10、15、16、17、18、和 19。在又另一实施方案中，本发明涵盖了酶原，其中该多肽延伸包括氨基酸序列，该氨 基酸序列长度为至少21个残基并且在位置3、14、和19上具有色氨酸(Trp ；W)残基。在这 一实施方案的一方面，该多肽延伸包括SEQID NO :6。在另一实施方案中，本发明涵盖了酶原，其中该多肽延伸包括SEQ IDNO :8。本发明进一步涵盖了 ADP-核糖基转移酶的酶原，其中该多肽链延伸被融合到该 ADP-核糖基转移酶的C端上。在另一实施方案中，本发明涵盖了酶原，其中该非靶生物或细胞是植物、植物细 胞、或酵母细胞。在这一实施方案的一方面中，该植物或植物细胞选自下组高梁、小麦、番 茄、甘蓝类作物、棉花、稻、大豆、糖甜菜、甘蔗、烟草、大麦、油籽油菜、和玉米。在这个实施方 案的其他方面，该酵母细胞是酿酒酵母。在又另一实施方案中，本发明涵盖了酶原，该酶原包括SEQ ID N0:11或SEQ ID NO :12ο在又另一实施方案中，本发明涵盖了分离的核酸分子，该核酸分子包括核苷酸序列(该序列编码了本发明的酶原)；包括该核酸分子的重组载体；和包括该重组载体的酵母 细胞。在另一实施方案中，本发明涵盖了包括本发明的酶原的转基因植物。在又另一实施方案中，本发明涵盖了制造毒性蛋白的酶原的方法，该方法包括以 下步骤(a)设计从该毒性蛋白的一端延伸的多肽链；(b)形成具有表达质粒的库，这些表 达质粒在转化进入到遗传系统时将表达包括该多肽链的前体；(C)在天然地易受该毒性蛋 白影响的遗传系统中表达这些前体；(d)回收在步骤(C)中存活的遗传系统的多个生物或 细胞；(e)将这些前体从步骤(d)的这些生物或细胞中分离；(f)测试这些前体对抗靶生物 或细胞的生物活性；并且(g)识别作为酶原的这些具有生物学活性的前体。在另一实施方案中，本发明涵盖了遗传系统，该系统允许有效识别毒性蛋白的酶 原前体，其中在该前体中该毒性蛋白是无活性的或基本上无活性的，并且其中该酶原在非 靶宿主生物或细胞中是良性的，并且在该酶原是在靶生物或细胞中时被转变成毒性蛋白。
在又另一实施方案中，包含本发明的这些新酶原的药用组合物是由本发明所涵盖 的。此类药用组合物作为(例如)抗癌剂应当是有效的。在本发明的一实施方案中，披露了方法，从而创造Vip2 ADP-核糖基转移酶的酶 原用于在植物中表达时降低植物毒性。作为在自然中大多数保守的蛋白之一的Vip2核 糖基转移酶，有理由推定这种毒素对于要求肌动蛋白用于其生存的细胞而言将可能是有毒 的。在其天然形式中，在植物中Vip2蛋白的表达是致命的，并且因此不能被用于转基因目 的。然而，工程化的酶原应当需要被靶害虫的消化蛋白酶激活从而发挥其致命的功能。来 自Vip2 ADP-核糖基转移酶的一端的一条多肽链的适当延伸可以但非限制性地通过四个机 制来干扰其酶促功能1)对该活性位点进行空间阻断，2)干扰NAD-结合位点，3)在酶构象 方面给予变化，或者4)在总体蛋白质稳定性方面引入降低。由于Vip2的C端与其N端相 比是更接近这种蛋白的功能位点的(图1)，考虑了在该蛋白的C端部分上加入多肽链延伸 也许是更好的掩蔽Vip2酶活性的机会。为了发现有功能的前肽序列，必须设计出对于具有 抑制酶性功能的Vip2酶原前体应当进行有效选择的遗传系统。在此披露了体内遗传系统，用于在酵母中选择存在缺陷的Vip2变体。在这种蛋白 的C端使用随机延伸诱变并且在酵母中进行选择，鉴定出具有显著降低的酶活性的Vip2前 酶，这种前酶对于玉米植物是良性的，由此在温室条件下没有引起发育的病理学。此外，这 种工程化的酶原仍然是足够有力的以便致使根虫死亡，这是由于在这种玉米根虫的消化系 统中通过蛋白酶激活成野生型酶形式)。使用本披露，本领域的普通技术人员可以容易地将该遗传系统用于快速筛选以确 定在任何ADP-核糖基转移酶(特别是肌动蛋白ADP-核糖基转移酶)中氨基酸残基的潜在 功能的重要性，并且用于对这些关键性残基进行鉴定。Vip2与其他杀虫性的和非杀虫性的 毒素的酶组分(分别对应地包括在以下表1和表2中所列的那些)共有显著的序列相似 性。这些Vip2-样ADP-核糖基转移酶具有几种涉及其功能的常见的结构特征。在Vip2-样 ADP-核糖基转移酶的生物活性中十分重要的这些关键结构特征包括对应于Vip2(SEQ ID NO 9)的 E428 的催化残基、对应于 Vip2(SEQ ID NO 9)的 Y307、R349、E355、F397、和 R400 的NAD结合残基、对应于Vip2 (SEQID NO 9)的残基386-388的“STS基序”(它使这种NAD 结合袋稳定)、和由对应于Vip2 (SEQ ID NO 9)的E426和E428的残基形成的NAD结合袋。
13所以，酶原可以被设计成用于任何ADP-核糖基转移酶，该酶原具有与Vip2相似的结构/功 能关系，由此该酶原在非靶生物或细胞中是良性的而在靶生物或细胞中是具有活性的。表1 显示了杀虫性的毒素的比对，这些毒素具有与Vip2的同源性。表2显示了非杀虫性的毒素 的比对，这些毒素具有与Vip2的同源性。这些ADP-核糖基转移酶(表1中的SEQ ID NOs 15-19和表2中的SEQ ID NOs 20-23)中每一种均具有催化残基、NAD结合残基、STS基序、 和NAD结合袋残基(对应于Vip2(SEQ ID NO 9)的那些残基)。表1.同源的ADP-核糖基化毒素。Vip2中的催化残基Glu 428在这些序列之上用 标记。参与NAD结合的残基用丨指示。STS基序加下划线。
权利要求
毒性蛋白的工程化的酶原，该酶原具有融合至该毒性蛋白的C端或N端上的多肽链延伸，其中该酶原在非靶生物或细胞中是良性的，并且其中当该酶原在靶生物或细胞中时该酶原被转变为毒性蛋白。
2.如权利要求1所述的酶原，其中该毒性蛋白是ADP-核糖基转移酶。
3.如权利要求2所述的酶原，其中该ADP-核糖基转移酶将肌动蛋白核糖基化。
4.如权利要求2所述的酶原，其中该ADP-核糖基转移酶包括氨基酸序列，该氨基酸序 列与SEQ ID NO :9具有至少69%的序列同一性，并且其中该ADP-核糖基转移酶具有催化 残基和NAD结合残基，该催化残基对应于SEQ ID NO 9的E428 ；所述NAD结合残基对应于 SEQ ID NO :9 的 Y307、R349、E355、F397 和 R400。
5.如权利要求2所述的酶原，其中该ADP-核糖基转移酶是杀虫性的。
6.如权利要求2所述的酶原，其中该ADP-核糖基转移酶是Vip2毒素。
7.如权利要求6所述的酶原，其中该Vip2毒素选自下组SEQIDNO :9、10、15、16、17、 18 和 19。
8.如权利要求2所述的酶原，其中该多肽延伸包括长度为至少21个残基的氨基酸序 列，并且在位置3、14、和19上具有色氨酸(Trp ；W)。
9.如权利要求8所述的酶原，其中该多肽延伸包括SEQID NO :6。
10.如权利要求2所述的酶原，其中该多肽延伸包括SEQID NO :8。
11.如权利要求8、9或10所述的酶原，其中该多肽链延伸融合至该ADP-核糖基转移酶 的C端。
12.如权利要求1所述的酶原，其中该非靶生物或细胞是植物、植物细胞或酵母细胞。
13.如权利要求12所述的酶原，其中该植物或植物细胞选自下组高粱、小麦、番茄、甘 蓝类作物、棉花、稻、大豆、糖甜菜、甘蔗、烟草、大麦、油籽油菜和玉米。
14.如权利要求13所述的酶原，其中该植物或植物细胞是玉米。
15.如权利要求12所述的酶原，其中该酵母细胞是酿酒酵母。
16.如权利要求1所述的酶原，其中该酶原包括SEQID N0:11或SEQID N0:12。
17.分离的核酸分子，包括编码权利要求1-16所述的酶原的核苷酸序列。
18.重组载体，包括如权利要求17所述的分离的核酸分子。
19.转基因植物或植物细胞，包括如权利要求17所述的核酸分子。
20.如权利要求19所述的转基因植物，该转基因植物是玉米植物或玉米植物细胞。
21.酵母细胞，包括如权利要求17所述的分离的核酸分子。
22.如权利要求21所述的酵母细胞，其中该酵母是酿酒酵母。
23.制造毒性蛋白的酶原的方法，该方法包括以下步骤(a)设计从该毒性蛋白的一端延伸的多肽链；(b)制备表达质粒的文库，所述表达质粒在转化入遗传系统时将表达包括该多肽链的 前体；(c)在天然地对毒性蛋白易感的遗传系统中表达所述前体；(d)回收在步骤(c)中存活的遗传系统的生物或细胞；(e)从步骤(d)的生物或细胞中分离所述前体；(f)测试前体针对靶生物或细胞的生物活性；并且(g)将所述具有生物学活性的前体鉴定为酶原。
24.根据权利要求23所述的方法，其中该毒性蛋白是ADP-核糖基转移酶。
25.根据权利要求24所述的方法，其中该ADP-核糖基转移酶将肌动蛋白核糖化。
26.根据权利要求24所述的方法，其中该ADP-核糖基转移酶是杀虫性的。
27.根据权利要求24所述的方法，其中该ADP-核糖基转移酶是Vip2毒素。
28.根据权利要求27所述的方法，其中该Vip2毒素选自下组SEQIDNO :9、10、15、16、 17,18 和 19。
29.根据权利要求23所述的方法，其中该文库包括随机的氨基酸序列，序列具有至少 21个残基并且在位置3、14、和19上具有色氨酸(Trp ；W)残基。
30.根据权利要求23所述的方法，其中该遗传系统是真核生物或细胞。
31.根据权利要求30所述的方法，其中该遗传系统是酵母。
32.根据权利要求31所述的方法，其中酵母是酿酒酵母。
33.根据权利要求23所述的方法，其中该靶生物或细胞是真核的或原核的。
34.根据权利要求33所述的方法，其中该靶生物或细胞是昆虫或昆虫细胞。
35.根据权利要求34所述的方法，其中该昆虫或昆虫细胞是根萤叶甲属中的。
36.根据权利要求35所述的方法，其中该昆虫生物或细胞是玉米根萤叶甲(西方玉米 根虫)、长角根萤叶甲(北方根虫)、或D. virgifera zeae (墨西哥玉米根虫)。
37.根据权利要求23所述的方法，其中该酶原在该靶细胞中是具有生物学活性的。
38.遗传系统，该遗传系统允许有效鉴定毒性蛋白的工程化的酶原，其中该酶原在非 靶生物或细胞中是良性的，并且其中当该酶原在靶生物或细胞中时该酶原被转变为毒性蛋 白。
39.如权利要求37所述的遗传系统，其中该工程化的酶原包括从该毒性蛋白的C端或 N端延伸的多肽链。
40.如权利要求37所述的遗传系统，该遗传系统是酵母。
41.如权利要求37所述的遗传系统，其中该酵母是酿酒酵母。
42.如权利要求37所述的遗传系统，其中该靶生物或细胞是病原性细胞或生物。
43.如权利要求37所述的遗传系统，其中该毒性蛋白是ADP-核糖基转移酶。
44.如权利要求42(43)所述的遗传系统，其中该ADP-核糖基转移酶将肌动蛋白核糖
全文摘要
ADP-核糖基转移酶(Vip2)通过修饰肌动蛋白并且防止肌动蛋白聚合而在昆虫体内发挥它的细胞内毒性。由于这种毒素的特性，Vip2在植物中的表达对该植物是致命的。在此所说明的是制造毒性蛋白的酶原的方法，这些酶原在非靶生物中是良性的并且在靶生物中被激活。在此披露的是在毒性蛋白的末端对随机的前肽库进行工程化、并且对酵母中功能失常的变体进行选择的方法。使用这种方法，所选择的前酶与野生型Vip2蛋白相比具有降低的酶活性，但仍保持着对于玉米根虫幼虫的有效毒性。玉米根虫消化蛋白酶可以对这种Vip2酶原进行蛋白质分解性地激活。
文档编号C12N9/10GK101970647SQ200880126346
公开日2011年2月9日 申请日期2008年12月10日 优先权日2007年12月11日
发明者弗雷德里克·S·沃尔特斯, 米兰·朱科维克, 纳伦达·V·帕勒卡, 陈政雄 申请人:先正达参股股份有限公司