专利名称：生物量浓度测量装置、方法以及电子芯片元件在测量所述生物量浓度上的使用的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用阻抗改变测量值来测量介质的生物量浓度的装置和方法。本发明 还涉及电子芯片元件在测量所述生物量浓度上的使用。
背景技术：
生物量是发酵、食品工业和临床诊断领域的重要控制参数，对其活性的适当监控 是至关重要的。这些工业领域需要能够区分并量化存在于介质中的微生物的装置。在工业领域，对诸如饮用水区域中的水溶液的微生物控制要求对每立方厘米IO2 个菌落形成单位的极低的微生物浓度进行量化，以下将每立方厘米的菌落形成单位称为 cfu. cm 3o迄今为止，最常见的用于测量较低细菌生物量浓度的方法是那些基于平板培养和 PCR技术的方法。平板培养是一种简单且十分可靠的技术，但是过于缓慢(至少需要24小 时的培育期)。电化学阻抗谱(EIS)是一种用于生物量的表征和量化的技术，该技术基于在研究 方法中施加可变频率的电势，以及基于针对每一个不同频率对介质中的电流响应所做的测 量，其中使用至少两个电极。所述电流响应使得可以获得一个电阻抗，该电阻抗在一个等效 于所研究的介质的电学模型的电路中测得。频率扫描产生如下阻抗谱，在该阻抗谱中，在特定频率处，由溶液中所产生的改变 引起的所述阻抗模块的值的降低是通过细菌新陈代谢的产物或通过溶液中的细胞自身实 现的。由生物量的存在而产生的阻抗值改变被用于确定介质的生物量浓度。现有的使用电化学阻抗谱来确定生物量浓度的阻抗分析装置，具有速度缓慢这一 缺点，因为其需要较长的测量时间，尤其对于浓度低于IO3Cfu. cm—3的情况。另一方面，所述 装置还具有在测量低生物量浓度时不可靠这一缺点，因为所进行的测量对于培养生物量时 介质中的温度和电导率的变化十分敏感。在较低的浓度下，信噪比很小，因此难以进行正确 的测量。专利ES2143911描述了一种用于测量生物量浓度的方法和设备，其旨在改进现有 方法和装置的可靠性和速度，并主要针对低生物量浓度的测量。上述专利的方法根据高频率和低频率下的阻抗之间的关系评估生物量浓度。在第 一选择方案中，直接使用在高频率和低频率时获得的阻抗值，在第二选择方案中，使用通过 调整曲线中的频率扫描的阻抗数据而得到的两个值。在所使用的方法中，按惯例接受了一 种等效于所述介质的电学模型的电路，该电学模型包括细胞外介质的阻抗、细胞内介质的 阻抗，以及细胞膜的电容。在上述专利中描述的阻抗分析装置包括读取探针，该读取探针被设计为适用于工 业生物反应器的两标准联接件一包括介质的温度和电导率传感器和一套电极。每个探针 的多个电极都被两两地放置在一个横向长孔的多个纵向边缘上，或者在另一实施方案中，被放置在培养物薄层所放置的平板或支撑物上。在两种情况下，所述电极构造均被设计为 一方面通过限定方式限制电场，以便于测量低浓度下的生物量浓度，另一方面，降低生物量 中气泡存在的可能性，气泡的存在会影响测量。但是，在上述专利中描述的装置和方法仍然具有局限性，因为在培养物中细胞外 介质的电导率(溶液电导率)发生的适度变化仍会误导对低生物量浓度的测量。专利ES2183677构成对上述专利的改进，其旨在改进低生物量浓度下的检测方法 的可靠性。所提出的改进方法包括测量在两个区域中的介质电阻抗，一个区域不具有生物 量，另一个区域具有生物量。使用多组相同的电极在上述两个区域进行测量，以取得关于在 不具有生物量的区域中的介质的电导率变化的信息。所获得的信息被用于校正在具有生物 量的区域中的介质的生物量浓度的评估结果。但是，尽管具有所提出的改进，但上述专利的测量方法复杂且低效，因为它在测量 低于IO5Cfu. cm-3的生物量浓度时，仍然存在局限。
发明内容
本发明的目的在于通过开发一种呈现出快速、简便和可靠的优势的用于测量低生 物量浓度的装置和方法，来解决上述缺陷。为实现这一目的，根据第一方面，本发明提供了一种用于测量介质中的生物量浓 度的装置，该装置包括用于测量由生物量的存在所产生的电阻抗的改变的器件，以及用于 确定阻抗改变的处理和控制器件。所述装置的特征在于所述的测量阻抗的改变的器件包括 至少两个电极，该至少两个电极具有合适的构造以允许测量由生物量静电吸附所产生的电 极/溶液界面的双电层的电容的改变，并且其特征在于，所述处理和控制器件通过一个将 所述电容改变与生物量浓度相关联的标定曲线来确定生物量浓度。为实现相同的目的，根据第二方面，本发明提供了一种使用所述的要求保护的装 置来测量介质的生物量浓度的方法，其特征在于该方法包括以下步骤a)通过向所述的要求保护的装置的电极施加一电势将所述介质极化，以便在所述 电极的表面上吸附生物量；b)测量所述的被极化的介质的电阻抗的改变；c)根据步骤b)的阻抗改变值确定电极/溶液界面(Cdl)的双电层的电容改变值， 所述电容改变值在与介质电学模型等效的电路中被确定；d)使用将所述电容改变值与介质的生物量浓度相关联的相应标定曲线，根据双电 层的电容改变值确定介质的生物量浓度。最后，根据第三方面，本发明涉及电子芯片元件的使用，该电子芯片元件包括集成 在材料衬底中的至少两个电极，其使用电化学阻抗谱来测量介质生物量浓度。所述的要求保护的装置和方法基于对由于生物量吸附而引起的电极/溶液界面 中发生的改变的测量。迄今完成的实验已能够观察到，在定植(colonizacWn)的开始几分钟被吸附至 工作电极的表面的生物量修改了电极界面的双电层的电化学特征。所探测的改变取决于被 吸附的生物量的数量，该数量同时与介质中所述生物量的生物量浓度成比例。这一事实使 得开发一种用于量化生物量浓度、用于介质中的装置的预标定、量化温度和量化感兴趣的生物量的装置和方法成为可能，所述装置和方法具有快速、直接和简单的优势。所述溶液/电极界面的双电层通常被认为类似于电容器，因此该层中产生的改变 可以通过电化学阻抗谱被轻易监控。所做的实验已使得能够观察到吸附至工作电极表面的生物量，其以确定的工作频 率表现得如同介电材料，改变装置电极的双电层(Cdl)的电容值。所述双层(Cdl)的电容 改变被认为取决于介质生物量浓度，这就是为什么会认识到，监控该层的电容的改变可以 简单且可靠地实现对介质中的生物量浓度的探测一其中使用相应的标定曲线。在所述的要求保护的装置中，电极的构造(尤其是它们的面积和间距)应适于允 许测量由生物量吸附所产生的电极/溶液界面的电容的改变。也就是说，电极的构造应适 于允许将电场限制在界面区域，该界面区域是测量由吸附至工作电极的生物量的存在所产 生的电化学改变的区域。出人意料的是，已经发现，由于所提出的方法基于在电极界面上的测量，介质特征 诸如电导率并不会显著地影响测量值。具体而言，已经发现，尽管双层电容随着生物量浓度持续地增长，溶液阻抗——其 体现了介质的平均电导率——随着生物量浓度的增长保持恒定。因此，出人意料的是，在培 养过程中，界面的电容改变值并不随介质的电导率的改变而改变，因此构成了一个用于测 量生物量浓度的十分可靠的参数。因为如此，所述的要求保护的装置和方法体现出如下优 势能够十分可靠地探测十分低的生物量浓度——低至IO2Cfu. cm_3。所述装置和方法的另一优势是其能够快速地测量浓度。这是因为已经发现，由生 物量吸附产生的阻抗信号的改变可以在十分短的曝光时间——大约仅几分钟——内测出。一旦被标定，所述装置就允许根据唯一的阻抗测量来确定生物量浓度，以及允许 在介质培育期监控所述生物量浓度。在每次测量之后，需要清洁电极表面，以及在需要时重 新标定装置。在本发明中，生物量一般被理解为由一个或多个原核或真核细胞——更具体而 言，诸如酵母、真菌等微生物——构成的生物材料。所述生物量将被提供悬浮在任意类型的 介质中，虽然优选使用的介质是水溶液或水介质。装置的电极的尺寸会影响测量的灵敏度，在这个意义上，电极将优选地是微电极。 但是，可选择地，已预见到电极也可以是纳米电极，以进一步改进所述灵敏度。根据优选的实施方案，装置的电极被集成在衬底材料中，所述集成在衬底中的电 极构成了尺寸缩小的电子元件，或能够被浸没在于其内执行生物量浓度测量的介质中。因为如此，生物量测量可以通过电子芯片元件来执行，由于该元件尺寸小，使得能 够在很小的样本容积中进行测量，且只需要很短的测量时间——少于一分钟。尺寸缩小的芯片或电子元件提供了适用范围极广的生物量传感器装置，其可以用 于需要进行介质的微生物控制的多种工业领域食品、临床诊断、水工业，等。有利的是，所述电子芯片元件包括无线地连接至装置的处理和控制器件的器件。 这样，所述装置的适用范围更加广泛，适合于更多的情形。还有利的是，电子芯片元件在同一衬底或在紧邻的衬底上具有至少一个集成的传 感器，以用于测量于其内执行生物量浓度测量的介质。所述传感器可以选自流量传感器、温 度传感器、电导率传感器、PH传感器、氧气传感器，或例如可以是选择性抗微生物剂传感器。
添加一个或多个用于测量不同的介质参数的传感器，使本发明的装置的适用范围 进一步扩大。根据一个实施方案，电极以微型盘被集成在芯片衬底中。这一几何形状非常简单 和有效。不过，该集成电极的几何形状可以变化，一如电极的数目可以变化。同样，电极的 材料也可以各不相同，如导体或半导体类型。在电极是半导体类型的情况下，装置将特别适 于最小化某些介质的腐蚀现象。参照本发明的方法，根据所述方法的一个优选实施方案，在其上进行电阻抗测量 的等效电路的双电层(Cdl)电容近似于恒定相位元件(CPEdl)，所述恒定相位元件的模块 变化值(Kdl)在步骤c)中确定。恒定相位元件考虑了由于电极的表面粗糙所引起的界面的双电层的理想电容特 性的降低，是一个十分有用的参数，其改进了本方法中所用的标定曲线的调整。所进行的实验显示，在较大的浓度范围内，恒定相位元件的模块变化(Kdl)呈现 出与所存在的生物量具有高度线性的关系，从而是一个利用本发明的方法来测量生物量浓 度的十分适合的参数。根据本发明的另一实施方案，步骤d)的生物量浓度根据预定时间内测量的两个 电容改变测量值(Cdl)的差值确定。所实施的实验显示，双层电容改变的差值的变化在更高的浓度范围内呈现出与生 物量浓度具有线性关系。这样，可以测量更宽的生物量浓度范围，包括极低的浓度值到较高 的浓度值——从IO1Cfu. cm—3到高于IO8Cfu. cnT3。如上所述，介质的特征诸如电导率的变化不会显著地影响测量。但是，我们发现， 具有低电导率的低盐度介质是优选的，因为在这些介质中的生物量探测限制较低。由步骤b)中的阻抗的测量而产生的电流的工作频率范围能根据所使用的电极的 构造和材料而变化。不过，将优选地使用低于IMHZ的频率，尤其是使用KHz的频率，因为所 述频率已显示出更适合于测量电极/溶液界面的电容。总之，所使用的频率将是那些适于促使所吸附的生物量的表现如同电介质材 料——即，改变所述双层(Cdl)的电容值一的频率。在这个意义上，需要避免以下工作频 率在这些工作频率下，所产生的电流穿过细胞壁。优选地，执行本方法中的至少是步骤a)和b)的时间将小于1分钟。已发现，这一 测量时间改善了在电容和生物量浓度之间获得的相关性。根据一个实施方案，在使用本发明的装置监控在一确定培育期中的生物量浓度之 后，介质的初始生物量浓度通过所述生物量的相应的增长曲线被间接地确定。这样，甚至能 够间接探测到低于IO2Cfu. cm-3的介质生物量浓度。
为更好地理解所公开的内容，附示了数个实施方案的实践例，它们仅作为示 意性的、非限制性的实施例。在这些附图中，图1是用于测量生物量浓度的第一类小电极元件或电子芯片元件的结构的示意 性平面图。
图2是用于测量生物量浓度的第二类电子芯片元件的结构的示意性平面图。图3a和3b是极化后的本装置的工作电极的两幅示意图。图4a和4b是与图3相同的工作电极的两幅示意图，其示出了在生物量吸附过程 的开始时间——执行所述测量时——的电极。图5a和5b是与图3中相同的工作电极的两幅示意图，其示出了在被暴露在生物 量溶液中较长时间后的电极。图6是一个示图，示出了在具有不同电导率的两种介质中，双电层的电容随着介 质的细菌生物量浓度的变化关系。图7是一个示图，示出了在具有不同电导率的两种介质中，溶液阻抗随着细菌生 物量浓度的变化(在界面中测得)。图8是一个示图，示出了在40分钟时间的测量中，电容改变的差值随着生物量浓 度的变化关系。
具体实施例方式如在发明内容中已指出的，在本发明的装置的优选实施方案中，电阻抗的测量由 芯片1或尺寸缩小的电极元件实现，它们具有进行电阻抗测量的集成电极2。如已指出的，芯片1是尺寸缩小的电极元件，其具有的优势在于允许以非常舒适 的方式实现对极小样本容积中的生物量浓度的测量。图1示出了在本发明中使用的一种类型的芯片1，其在同一衬底3上具有集成为微 型盘外形的两个微电极2 ；辅助电极和工作电极；以及具有不同几何形状的第三参考电极 2。图2示出了第二类型的芯片1，其在此情形下包括五个电极2。衬底3的材料和芯片1、电极2的材料可以是各种各样的，尚未发现这方面的任何 限制。因此，在用于衬底3的测试材料中，提到玻璃和石英。所提到的用于电极2的材料是 导体材料诸如金、钼、碳、铱等。不过，也可以使用半导体材料，诸如氧化物和氮化物，这些材 料具有最小化由介质所造成的腐蚀现象的优势。如在发明内容中已指出的，所要求保护的装置和方法基于对由于生物量吸附所导 致的在电极/溶液界面中产生的变化的测量。图3至5示出了当实施生物量浓度的测量时，在芯片1的表面上产生的变化的示 意图。在图3a和3b示出的过程的第一步中，在电极2上施加电势，该电势被转化为电荷 的分离从而导致在电极/溶液界面中出现双电层4。所述电荷的分离吸引悬浮在介质中的 生物量5，该生物量5迅速地吸附至芯片1的工作电极2的表面。所施加的电势可以根据介质而变化。不过，我们发现所施加的最低电势被转化为 被生物量5覆盖的较低的电极2面积，从而便于在高介质浓度下的测量。本方法的灵敏度随 所施加的电势而变化，电势越小，标定曲线的斜率就越小，从而，所述方法的灵敏度就越低。在生物量5定植的第一步骤中，建立被吸附的细胞和自由细胞之间的动态平衡， 所述自由细胞物理和电化学地改变工作电极2界面的双电层4。图4a和4b示出了在执行 电阻抗随过程变化的测量时的双电层4的状态。阻抗测量通过频率范围低于1MHZ，优选IKHZ的电化学阻抗谱实现。在这一电学环
7境中，吸附至芯片1表面的细菌生物量表现得如同介电材料，其修改所述装置的工作微电 极2的双电层(Cdl)的电容值。电容改变这一变化通过电化学阻抗谱监控，将阻抗谱设置在以下电路中，该电路 除了包括双层(Cdl)电容之外、还包括溶液电阻(Rs)以及参考电极电容(Celec)——如果 测量中用到的话。通过在工作范围内将双层(Cdl)电容改变值与生物量浓度相关联的标定曲线，根 据电容改变(Cdl)值确定介质生物量浓度。图6示出了一个示图，其图示了在两种不同电导率的介质中，双电层(4)的电容随 着介质的生物量(5)浓度的变化关系。在该图中，电容值已被调整至恒定相位(Kdl)元件 的值，因为实验显示，在较宽的浓度范围内，所述模块变化与生物量浓度存在高度的关联。图7是一个示图，示出了在图6中使用的两种不同电导率的介质中，溶液阻抗随着 细菌生物量浓度的变化(在界面中测得)。图6和图7中示出的结果已通过对无菌血清水溶液中悬浮的细菌生物量样本所执 行的实验而获得。如所述图6和图7中可以观察到的，相位元件(Kdl)的模块变化显示了随两种不 同电导率的介质中的生物量浓度而持续增长。但是，两种介质中的溶液电阻(Rs)——其体 现平均电导率——在浓度范围内保持恒定。从这些结果中可以推测出，电容值不会因生物 量增加引起的介质的局部电导率的改变而改变，但却会因样本的细菌浓度的增加而改变， 获得在电容改变值和生物量浓度——在IO1Cfu. cm—3到IO6Cfu. cm—3范围内——之间的高度 线性关系。所获得的结果显示，界面双电层(4)的电容改变值是用于测量低生物量(5)浓度 的有用且十分可靠的参数。根据图6和图7，还可推出，界面电容改变的程度取决于介质的电导率类型。因此， 在低介质电导率的相同细菌浓度中，显示出低电容改变(Kdl)值。初始介质的电导率的差异并不意味着过程灵敏度的提高，两种情况下的灵敏度是 相同的(同一曲线斜率)。但是已观察到，工作介质电导率的降低将改进探测限制，将其从 IO2Cfu. cm-3降至IO1Cfu. cm_3。因此，低盐度的介质更适合于测量低生物量浓度。如在发明内容中已指出的，为了测量较宽的生物量浓度范围，已限定了一个度量 在确定时间段里所取的两次测量的电容值差的参数。图8示出了关于在如下试验中获得的结果的示图，在该试验中，在40分钟时间内 进行的多次测量中，测量电容改变的差值随细菌生物量浓度的变化。结果显示出在lOcfu. cm_3到108cfu. cm_3的范围内的浓度下的高度线性关联。
权利要求
用于测量介质的生物量(5)浓度的装置，该装置包括用于测量由生物量(5)的存在所产生的电阻抗的改变的器件，以及用于根据这些用于测量阻抗的改变的器件确定生物量(5)浓度的处理和控制器件，其特征在于，所述的那些用于测量阻抗的改变的器件包括至少两个电极(2)，其具有合适的构造以允许测量由生物量(5)静电吸附所产生的电极/溶液界面的双电层(4)的电容的改变，并且其特征在于，所述处理和控制器件通过一个将所述电容改变值与生物量(5)浓度相关联的标定曲线来确定生物量(5)浓度。
2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述至少两个电极(2)被集成在材料衬 底⑶中，集成在所述衬底⑶中的所述电极⑵构成一电子芯片元件(1)，该元件能够被 浸没在于其内执行生物量(5)浓度测量的介质中。
3.根据权利要求2所述的装置，其特征在于，所述电子芯片元件(1)包括无线联接至所 述处理和控制器件的器件。
4.根据权利要求2所述的装置，其特征在于所述电子芯片元件(1)包括至少一个传感 器，其用于测量于其内执行生物量(5)浓度测量的介质的参数。
5.根据权利要求2所述的装置，其特征在于所述电极(2)以微型盘的形式被集成在衬 底(3)中。
6.根据权利要求1所述的装置，其特征在于所述电极(2)的材料是半导体材料。
7.根据权利要求1所述的装置，其特征在于所述生物量(5)由一个或多个原核或真核 细胞构成。
8.一种电子芯片元件(1)的用途，所述电子芯片元件(1)包括集成在同一材料衬底 (3)中的至少两个电极(2)，其使用电化学阻抗谱来测量介质的生物量(5)浓度。
9.一种使用所述的要求保护的装置测量介质的生物量浓度的方法，其特征在于该方法 包括以下步骤a)通过向所述的要求保护的装置的电极(2)施加一电势将所述介质极化，以便在所述 电极(2)的表面上吸附生物量；b)测量所述的被极化的方法的电阻抗的改变；c)根据步骤b)的阻抗改变值确定电极/溶液界面的双电层(4)的电容改变值，所述电 容改变值在与介质电学模型等效的电路中被确定；d)使用将所述电容改变值与介质的生物量(5)浓度相关联的相应标定曲线，根据双电 层(4)的电容改变值确定介质的生物量(5)浓度。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于等效电路的双电层(4)的电容近似于恒定 相位元件，所述恒定相位元件的模块变化值在步骤c)中被确定。
11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于由步骤b)中的阻抗的测量而产生的电流 的工作频率小于1MHZ。
12.根据权利要求9所述的方法，其特征在于步骤d)的生物量浓度通过在确定时间段 中的两次电容改变测量值的差值确定。
13.根据权利要求9所述的方法，其特征在于在一确定的培养期中，在监控生物量(5) 浓度之后，使用相应的生物量(5)增长曲线，间接确定所述介质的初始生物量(5)浓度。
14.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述生物量(5)由一个或多个真核或真核 细胞构成。
全文摘要
本发明涉及一种用于测量介质的生物量浓度的装置，该装置包括用于测量由生物量的存在所产生的电阻抗的改变的器件，以及用于根据所述器件确定生物量浓度的处理和控制器件。本发明的特征在于，所述的那些用于测量阻抗的改变的器件包括至少两个电极，其具有合适的构造以允许测量由生物量静电吸附所产生的电极/溶液界面的双电层的电容的改变。本发明的特征还在于，所述处理和控制器件通过一个将所述电容改变值与生物量浓度相关联的标定曲线来确定生物量浓度。本发明还涉及使用阻抗改变测量器件来测量介质的生物量浓度的方法。本发明还涉及电子芯片元件在测量生物量浓度上的使用。
文档编号C12M1/34GK101939408SQ200880126472
公开日2011年1月5日 申请日期2008年12月17日 优先权日2008年1月16日
发明者F·J·德尔坎波加西亚, F·J·穆尼奥斯帕索尔, J·马斯高迪, N·维格斯弗朗曾, R·埃斯卡德普杰尔, X·穆尼奥斯波贝尔 申请人:西班牙高等科研理事会;巴塞罗那自治大学