专利名称：：一种提取甘薯块根rna的方法及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种提取甘薯块根RNA的方法及其应用。
背景技术：
：甘薯是重要的工业原料、生物质能源和保健食品。因此，人们亟需更为深入地了解甘薯的遗传信息，而提取高纯度、高质量的RNA是了解甘薯遗传信息的必要前提和关键。甘薯块根富含多糖(主要是淀粉)、酚类及其它次生代谢产物，严重影响了RNA的提取。其中多糖的理化性质与核糖核酸RNA非常相似，在沉淀RNA时，蛋白多糖和RNA—块沉淀下来，产生难溶的胶状物复合体，在去除多糖的同时RNA也被带走，造成RNA大量丢失。此外，甘薯块根富含的酚类化合物易产生褐化效应(Browningeffect)，使匀浆液呈褐色，其氧化产物与RNA不可逆结合，也会导致RNA活性丧失或产生不溶性复合物。因此，用常规的RNA提取方法难以提取出高质量的块根总RNA，影响了对甘薯分子生物学的研究.目前，RNA的提取方法很多，采用Trizol试剂盒、SDS法以及常规的CTAB等方法均不能提取出大量的高质量甘薯块根RNA。You等(2003)利用胍盐一SDS裂解液，结合CsCI梯度离心提取了甘薯膨大初期块根的总RNA。为了避免淀粉的膨胀和凝胶化，MohanKumar等(2007)通过SDS和高盐沉淀法从甘薯块根中提取总RNA，但是，这些方法或存在所用裂解液毒性大或存在费时费力等不足。近年来，国内外也相继开发出了一些总RNA抽提试剂(盒)用于富含多糖和多酚等特殊植物材料的RNA提取，但结果不理想。
发明内容本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种提取甘薯块根RNA的方法。该方法提取的甘薯块根总RNA获得率高、量大，并且质量好、纯度高、完整性好。本发明的另一目的在于提供上述提取甘薯块根RNA的方法的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现一种提取甘薯块根RNA的方法，包含以下步骤(1)将甘薯块根放入液氮中，迅速研磨成粉末状，加入65t:预热的RNA提取缓冲液；RNA提取缓冲液的用量为每15g甘薯块根用15ml;(2)将4ml多糖去除液加入到步骤(1)所得的混合液中，冰上放置10分钟；(3)用氯仿异戊醇混合液抽提步骤(2)得到的混合液，收集上清液；这个步骤可达到去除多糖和蛋白的目的；(4)将步骤(3)收集的上清液中的RNA沉淀，离心，回收沉淀，干燥，用DEPC处理水溶解；(5)用无RNase的DNase处理步骤(4)得到的RNA溶液，可将痕量DNA污染去除；(6)用苯酚、氯仿异戊醇混合液依次抽提步骤(5)的RNA溶液，进一步纯化RNA，取上清；(7)将步骤(6)得到的上清液中的RNA沉淀，离心，回收沉淀，洗涤，干燥，得到高纯度的甘薯块根RNA;步骤(1)中所述RNA提取缓冲液含有浓度为50mMTris-HCl(pH9.0)，14%CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)(w/v)，13MNaCl，25mMEDTA(pH8.0)，12%PVP(聚乙烯吡咯烷酮)(w/v)，l2%(体积百分比)P-巯基乙醇，l/3总体积的水饱和酚(pH4.3);步骤(1)中所述多糖去除液含有体积百分比为1030%的乙醇和终浓度为0.40.6mol/L的醋酸钾。步骤(3)和步骤(6)中所述的氯仿异戊醇混合液为氯仿与异戊醇按体积比24:1混合而得；步骤(3)中所述的氯仿异戊醇混合液的用量优选为相当于步骤(2)得到的混合液的1倍体积；步骤(3)所述的抽提为剧烈振荡后，优选至少2000Xg离心至少15min;步骤(3)中所述的抽提的次数优选为2次；步骤(4)中所述RNA沉淀是往步骤(3)中的上清液中加入LiCl，LiCl的终浓度为1.52.5mol/L，冰上放置过夜；步骤(5)中所述的处理的条件优选为37C反应30分钟；步骤(6)中所述的苯酚的用量优选为相当于步骤(5)得到的混合液的1倍体积；步骤(6)中所述的氯仿异戊醇混合液的用量优选为相当于步骤(5)得到的混合液的1倍体积；步骤(6)所述的抽提为剧烈震荡后，优选至少10000Xg离心至少10min;步骤(6)中所述的抽提的次数优选为2次；步骤(7)中所述RNA沉淀是往步骤(6)中的上清液中加入2倍体积的无水乙醇和终浓度为0.30.6mol/L的醋酸钠，-7(TC放置20分钟;步骤(7)中所述的洗涤为通过体积百分比为70%乙醇溶液洗涤。RNA抽提中所用的试剂和耗材均用DEPC进行处理，根据《分子克隆》的指导进行。所述提取甘薯块根RNA的方法适用于富含多糖、多酚等难提RNA植物组织的总RNA提取。本发明的方法中，RNA提取缓冲液中的13_巯基乙醇和PVP可以避免多酚类物质对RNA分离的干扰作用，而且，与PVP结合的多酚可以在氯仿抽提时直接除去。本发明同时采用了2种方法沉淀与去除多糖，一是在RNA提取缓冲液中加入高浓度的盐份NaCl，二是在RNA溶液中加入一定比例的无水乙醇和醋酸钾，可以使多糖快速沉淀下来，而RNA仍然保留于溶液中，去除了多糖对RNA提取的影响，得到了高质量的RNA，具有较大的实际应用价值。本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果本发明所述提取甘薯块根RNA的方法提取的甘薯块根总RNA获得率高、量大，并且质量好、纯度高、完整性好，可以满足反转录、Northern杂交、cDNA文库构建、转录组分析等分子生物学研究。图1为本发明的方法和常规的TRIZOL法分别提取的甘薯块根RNA的琼脂糖凝胶电泳图，其中4泳道1、2和3分别为本发明所述方法提取的甘薯块根发育初期、中期和后期的总RNA;泳道4为常规的TRIZOL法提取的甘薯块根发育初期的总RNA。图2为以本发明方法提取的甘薯块根发育初期的RNA为模板的RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1(1)试剂的配制A、DEPC水的配制加0.1%(体积比)DEPC至重蒸水中，搅拌4小时以上，置于37。C处理过夜，121。C灭菌20min;B、lmol/LTris-HCl(pH9.0):100ml灭菌的DEPC水加12.114gTris，用浓盐酸调节pH值至9.0;C、0.5mol/LEDTA(pH8.0):将18.61gEDTANa2.H20，用未灭菌的DEPC水溶解，定容至100ml，用NaOH颗粒调节其pH值至8.0，121。C灭菌20min;D、8mol/LliCl:将33.912gLiCl用未灭菌的DEPC水溶解，定容至100ml，121°C灭菌20min;E、4mol/LNaCl:将23.26gNaCl用未灭菌的DEPC水溶解，定容至100ml，12rC灭菌20min;F、5mol/L醋酸钾将49.07g醋酸钾用未灭菌的DEPC水溶解，定容至100ml，121°C灭菌20min;G、RNA提取缓冲液(配制100ml):5mllmol/LTris-HCl(p服0)、50ml4mol/LNaCl、5ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)、4gCTAB禾P2gPVP混匀，接着用灭菌的DEPC水定容至65ml，使用前加入33ml水饱和酚(pH4.3)和2mlP-巯基乙醇。H、多糖去除液(配制100ml):30ml无水乙醇、10ml5M醋酸钾和60ml灭菌的DEPC水混合而得。1、氯仿异戊醇混合液(配制100ml):96ml氯仿与4ml异戊醇混合而得。(2)不同发育时期的甘薯块根的总RNA提取A、取大田生长的甘薯品种广薯87的块根发育初期(生育期50天)、中期(生育期80天)和后期(生育期140天)的甘薯块根组织各3g，分别立即放入液氮中研磨成粉末状，然后迅速加入到65t:预热的15mlRNA提取缓冲液中，剧烈振荡10分钟。B、加入4ml多糖去除液，冰上放置10分钟C、加入等体积氯仿异戊醇，剧烈振荡10分钟，于4°C、2000Xg离心20分钟，取上清；再次加等体积氯仿异戊醇，混匀，振荡10分钟，于4t:、2000Xg离心15分钟。D、取上清，加1/3体积的8mol/LLiCl，冰上沉淀8小时以上。E、于4。C、2000Xg离心20分钟，弃上清。F、沉淀用70%乙醇漂洗1次，于4°C、11400Xg离心10分钟，吹干，加500ii1DEPC5水溶解。G、用12个单位的DNase37。C消化处理30分钟去除痕量的DNA污染。H、加入等体积苯酚抽提蛋白，剧烈振荡10分钟，于4t:、11400Xg离心IO分钟，取上清。再用等体积氯仿去除多余苯酚和蛋白，剧烈振荡10分钟，于4t:、11400Xg离心10分钟。1、取上清，加入1/10体积3mol.L—1醋酸钠(pH5.2)，2倍体积的无水乙醇，-70。C放置2小时，于4°C、11400Xg离心20分钟，回收沉淀。J、沉淀用70%乙醇漂洗，于4°C、11400Xg离心10分钟，吹干，溶于100iilDEPC-H20中，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测完整性，保存于-70°C。电泳检测RNA的完整性上样量1iU，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，结果如图1所示，泳道1、2和3分别为本发明所述方法提取的甘薯块根发育初期、中期和后期的总RNA;泳道4为常规的TRIZOL法提取的甘薯块根发育初期的总RNA。从图1可以看出，经本发明方法提取的RNA经电泳检测可见清晰的28s和18s条带，且条带无拖尾现象，无基因组DNA的污染。而用常规的TRIZOL试剂盒(Invitrogen，美国)提取的甘薯块根发育初期的RNA(操作规程严格按照试剂盒的说明书进行)有明显的降解、拖尾现象，且28s和18s的主带不明显。提取RNA的纯度检测用NanoDropspectrophotometer(ND-1000，NanoDropTechnologies，Inc.Wilmington,DEUSA)检测实施例1RNA的纯度，结果如表1所示。从表1可以看出，经本发明方法提取的RNA经NanoDrop检测其A260/A280比值均在1.99-2.11之间，A260/A230比值均在2.13-2.35之间，产量可高达528.12yg/g甘薯块根鲜重。较Kim和Hamada(2005)方法的177iig/g甘薯i央根鲜重(KimS.H.，andHamadaT.，2005，RapidandreliablemethodofextractingDNAandRNAfromsweetpotato，Biotechnol.Lett.，27(23-24):1841-1845)和MohanKumar等(2007)的237iig/g甘薯土央根鲜重(MohanK丽rG.N.，IyerS.，andRichardK丽lesN.，2007，ExtractionofRNAfromfresh，frozen,andlyophilizedtuberandroottissues,J.Agr.FoodChem.，55(5):1674-1678)的产量均高。说明所提RNA纯度较高，产量较大，可以满足不同分子生物学研究的要求。表1RNA样品的纯度检测<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(3)总RNA的逆转录及特异基因的扩增以上述提取的发育初期的甘薯块根总RNA为模板，用Promega公司的M-MLV反转录酶合成cDNA第1链后，稀释10倍作为PCR扩增的模板。PCR反应体系(25yL)中包括liilcDNA，0.4mmo1dNTP，上下游引物各lOpmol，1UTaq酶。扩增甘薯ADP葡萄糖焦磷酸化酶的引物序列分别为上游P1，5'-ATGGAATTTTGTGCAACTTTGA-3';下游P2，5'-CCCGGGCTATACGACGGTTCCATCA-3'。cDNA模板在94°C变性5分钟后，扩增(94°C40秒，60°C40秒，72t:90秒)35个循环；最后72"C延伸10分钟。用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，结果如图2所示。以本发明方法提取的总RNA为模板，甘薯AGPase基因特异引物Pl、P2进行RT-PCR，能成功扩增出预期的目的片段，说明该法提取的RNA样品质量好，可以进一步用于后续试验。实施例2(1)试剂的配制A、RNA提取缓冲液(配制100ml):5mllmol/LTris-HCl(p服0)、25ml4mol/LNaCl、5ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)、lgCTAB禾PlgPVP混匀，接着用灭菌的DEPC水定容至66ml，使用前加入33ml水饱和酚(pH4.3)和lmlP-巯基乙醇。B、多糖去除液(配制100ml):10ml无水乙醇、8ml5M醋酸钾和82ml灭菌的DEPC水混合而得。(2)甘薯块根发育后期的总RNA提取同实施例1步骤(2)的操作，区别仅在于所用样品为发育后期(生育期140天)的甘薯块根组织lg。提取得到总RNA经1.0X琼脂糖凝胶电泳检测，28S、18S和5.8S带型清晰，说明得到的总RNA完整性较好；经NanoDropspectrophotometer检测，A260/A280比值均为2.01，A260/A230比值均为2.24，产量为498.85yg/g甘薯块根鲜重。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。SEQUENCELISTING〈110〉广东省农业科学院作物研究所〈120〉一种提取甘薯块根RNA的方法及其应用〈130>1〈160>2〈170>PatentInversion3.2〈210>1〈211>22〈212>DNA〈213>artificialsequence〈220〉〈223〉上游引物〈400>1atggaattttgtgcaactttga22〈210>2〈211>25〈212>DNA〈213〉artificialsequence〈220〉〈223>下游引物〈400>2cccgggctatacgacggttccatca2权利要求一种提取甘薯块根RNA的方法，其特征在于包含以下步骤(1)将甘薯块根放入液氮中，研磨成粉末状，加入65℃预热的RNA提取缓冲液；RNA提取缓冲液的用量为每1～5g甘薯块根用15ml；(2)将4ml多糖去除液加入到步骤(1)所得的混合液中，冰上放置10分钟；(3)用氯仿异戊醇混合液抽提步骤(2)得到的混合液，收集上清液；(4)将步骤(3)收集的上清液中的RNA沉淀，离心，回收沉淀，干燥，用DEPC处理水溶解；(5)用无RNase的DNase处理步骤(4)得到的RNA溶液；(6)用苯酚、氯仿异戊醇混合液依次抽提步骤(5)的RNA溶液，取上清；(7)将步骤(6)得到的上清液中的RNA沉淀，离心，回收沉淀，洗涤，干燥，得到高纯度的甘薯块根RNA；所述RNA提取缓冲液含有pH9.0、50mM的Tris-HCl，质量体积比为1～4％的十六烷基三甲基溴化铵，1～3M的NaCl，pH8.0、25mM的EDTA，质量体积比为1～2％的聚乙烯吡咯烷酮，体积百分比为1～2％的β-巯基乙醇，相当于所述RNA提取缓冲液总体积1/3的pH值为4.3的水饱和酚；所述多糖去除液含有体积百分比为10～30％的乙醇和终浓度为0.4～0.6mol/L的醋酸钾；所述的氯仿异戊醇混合液为氯仿与异戊醇按体积比24∶1混合而得。2.根据权利要求1所述提取甘薯块根RNA的方法，其特征在于步骤(3)中所述的氯仿异戊醇混合液的用量为相当于步骤(2)得到的混合液的1倍体积；步骤(3)中所述的抽提为剧烈振荡后，至少2000Xg离心至少15min。3.根据权利要求1所述提取甘薯块根RNA的方法，其特征在于步骤(4)中所述RNA沉淀是往步骤(3)中的上清液中加入LiCl，LiCl的终浓度为1.52.5mol/L，冰上放置过夜。4.根据权利要求1所述提取甘薯块根RNA的方法，其特征在于步骤(5)中所述的处理的条件为37t:反应30分钟。5.根据权利要求1所述提取甘薯块根RNA的方法，其特征在于步骤(6)中所述的苯酚的用量为相当于步骤(5)得到的混合液的1倍体积。6.根据权利要求1所述提取甘薯块根RNA的方法，其特征在于步骤(6)中所述的氯仿异戊醇混合液的用量为相当于步骤(5)得到的混合液的1倍体积。7.根据权利要求1所述提取甘薯块根RNA的方法，其特征在于步骤(6)中所述的抽提为剧烈震荡后，至少10000Xg离心至少10min。8.根据权利要求1所述提取甘薯块根RNA的方法，其特征在于步骤(7)中所述RNA沉淀是往步骤(6)中的上清液中加入2倍体积的无水乙醇和终浓度为0.30.6mol/L的醋酸钠，-70。C放置20分钟。9.根据权利要求1所述提取甘薯块根RNA的方法，其特征在于步骤(7)中所述的洗涤为通过体积百分比为70%乙醇溶液洗涤。10.权利要求18任一项所述提取甘薯块根RNA的方法用于富含多糖和/或多酚的植物组织的总RNA提取。全文摘要本发明公开了一种提取甘薯块根RNA的方法及其应用。本发明通过使用β-巯基乙醇和聚乙烯吡咯烷酮，避免多酚类物质对RNA分离的干扰作用；另外再使用高浓度的NaCl、无水乙醇和醋酸钾，使多糖快速沉淀，避免多糖对RNA提取的影响。在避免多酚类物质和多糖对RNA分离的干扰作用时，RNA仍然保留于溶液中，得到了质量好、纯度高、完整性好的RNA，而且RNA获得率高、量大。本发明具有较大的实际应用价值，可以满足反转录、Northern杂交、cDNA文库构建、转录组分析等分子生物学研究。文档编号C12N15/10GK101781646SQ20091021422公开日2010年7月21日申请日期2009年12月25日优先权日2009年12月25日发明者张雄坚,房伯平,温少旋,王章英,罗忠霞,陈新亮,陈景益,黄立飞申请人:广东省农业科学院作物研究所