专利名称：：抗m3型受体蛋白多肽抗体测定在干燥综合征诊断中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及胆碱能M3型受体多肽的制备及其做为抗原在检测干燥综合征及其它疾病中的应用。一
背景技术：
：千燥综合征(Sjogren'sSyndrome,SS)是一种以侵及泪腺和唾液腺等外分泌腺为特征的全身性自身免疫疾病。该病最常见的临床表现为眼干、口干，并可累及肺、肾脏、淋巴系统、血管及肝脏等器官。此病无明显的地区分布差异，可发生于任何年龄，以40-60岁，特别是绝经后的女性居多，男女之比为1:9。在我国的患病率为0.77%，在老年人群中的患病率高达4%，全国有近800万患者。干燥综合征可分为原发性干燥综合征(PrimarySjogren'ssyndrome)和继发性干燥综合征(SecondarySjogren'ssyndrome)两类。该病单独发生时，称为原发性干燥综合征；与其它诊断明确的自身免疫性疾病如类风湿关节炎(rheumatoidarthritis,RA)、系统性红斑狼疮(systemiclupuserythematosus,SLE)等合并存在时，称为继发性干燥综合征。近年来，人们对干燥综合征的病因及发病机理进行了大量研究，但至今无突破性进展。目前在临床上尚未发现理想的血清学诊断方法，除临床症状外，主要靠唇腺活检及腮腺造影等有创检査明确诊断，由于患者的医从性差，常常延误诊断，并丧失最佳的治疗时机。因此，寻找一种敏感性强、特异性高而又简便易行的检测方法，对干燥综合征的早期诊断及治疗具有重要意义。为此，本发明人经过多年研究发现了可以用于干燥综合征早期诊断的血清学特异性抗原——胆碱能M3型受体多肽，该多肽可以特异性的识别干燥综合征患者血清中的特异性抗体——抗胆碱能M3型受体多肽抗体，该抗体可通过一些较为简便的免疫学检测方法(如酶联免疫吸附法)检测出来。并且具有很高的敏感性和特异性。二、发明概述本发明的目的之一是提供能够有效检测干燥综合征的特异性抗原——胆碱能M3型受体多肽。本发明的另一目的是提供所述的胆碱能M3型受体多肽在诊断干燥综合征中的用途。最后，本发明提供了将含有所述胆碱能M3型受体多肽及类似物做为抗原用于检测干燥综合征的方法。本发明所用术语"胆碱能M3型受体多肽'，指具有共同序列KRTVPPGECFIQFLSE(即Lys-Arg-Trp-Glu-Val-Pro-Pro-Gly-Phe-Cys-Gln-Phe-Ile-Gln-Phe-Leu-Ser-Glu赖氨酸一精氨酸一色氨酸J氨酸一脯氨酸一脯氨酸一甘氨酸一谷氨酸一半胱氨酸一苯丙氨酸一异亮氨酸一谷氨酰胺一苯丙氨酸一亮氨酸一丝氨酸一谷氨酸)的氨基酸、多肽类似物及蛋白。胆碱能M3型受体是一种主要分布于外分泌腺及平滑肌的胆碱能受体，也是一种G-蛋白偶联受体。它结合胆碱能神经释放的神经递质——乙酰胆碱，激活磷脂酶C、A2、D通路，电压依赖性钙通道开放，使钙内流增加，细胞内钙的浓度升高，cAMP增加，引起腺体分泌和平滑肌收縮。近年来的研究发现SS患者血清中的抗胆碱能M3型受体抗体可以识别并激活M3型受体，该抗体与M3型受体的长期结合，不仅降低胆碱能M3型受体对乙酰胆碱的敏感性，还造成M3型受体的进行性破坏，导致受体的降解，进而影响信号传导通路、干扰水通道蛋白的分布，致使SS患者出现腺体分泌减少、膀胱逼尿肌收縮力减弱等胆碱能神经功能异常的临床表现。19%年，Bacman等报道〖"了SS患者血清中存在着抗胆碱能M3型受体抗体，并进一步指出该抗体对于SS的诊断具有较高的特异性。该文献中选用的是大鼠腮腺的膜蛋白提取物，是一种混合的蛋白成分。该文献中通过测定一种可以结合所有M型受体的已知标记蛋白的含量，来间接计算M3受体的含量；而且大鼠M3受体用于检测SS患者的特异性较差。国外至今也没有这方面大样本的临床研究，而且国内外都没有建立切实可行的该抗体的临床检测方法。本小组经过多年研究发现了可以用于干燥综合征诊断的血清学特异性抗原——抗胆碱能M3型受体，该蛋白可以特异性的识别干燥综合征患者血清中的特异性抗^~~抗胆碱能M3型受体抗体，该抗体可通过一些较为简便的免疫学检测方法(如免疫印迹法)检测出来，并且具有很高的敏感性和特异性。本发明目的是提供有效检测干燥综合征特异性抗原的检测方法，并应用于干燥综合征的诊断。基于以上研究，本发明人将M3受体序列213-228之间的16个氨基酸的多肽KRTVPPGECFIQFLSE(艮卩Lys-Arg-Trp-Glu-Val-Pro-Pro-Gly-Phe-Cys-Gln-Phe-Ile-Gln-Phe-Leu-Ser-Glu赖氨酸一精氨酸一色氨酸一缬氨酸一脯氨酸一脯氨酸一甘氨酸一谷氨酸一半胱氨酸一苯丙氨酸一异亮氨酸一谷氨酰胺一苯丙氨酸一亮氨酸一丝氨酸一谷氨酸)做为抗原，用ELISA的方法检测干燥综合征、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮及正常人血清中的抗胆碱能M3型受体多肽抗体，从而达到通过血清学的方法诊断干燥综合征的目的，为干燥综合征的临床诊断提供客观的实验室依据。本发明的抗胆碱能M3型受体多肽及其类似物可通过多种方法(例如酶联免疫吸附法、免疫印迹法、金标记法等)对干燥综合征患者进行检测，其检测方法为本领域技术人员所熟知的。同时，检测的M3型受体多肽抗体类型可为IgG型、IgA型或其它类型的免疫球蛋白。本发明所述的抗胆碱能M3型受体可以用本领域人员所熟知得方法得到，例如固相合成法、基因工程表达纯化法等。图1.酶联免疫吸附法(ELISA)检测原理示意图图2.抗M3型受体蛋白多肽-IgG抗体在不同疾病中的滴度水平由图可见，ELISA方法检测抗M3型受体蛋白多肽-IgG抗体的吸光度(OD)在pSS、sSS、RA、SLE及正常对照组中的平均值分别为0.85、0.62、0.25、0.31、0.27。在SS患者组中抗体吸光度平均水平明显高于其它结缔组织病和正常人对照组(P均0.05或<0.01)。图3.抗M3型受体蛋白多肽抗体在不同疾病的阳性率由图可见抗胆碱能M3型受体多肽抗体在原发性和继发性干燥综合征中的阳性率均明显高于SLE、RA及正常对照(P均<0.05或<0.01)。在干燥综合征患者中，抗ct-胞衬蛋白多肽抗体的敏感性明显高于SSA、SSB及抗核抗体，其特异性略低于抗SSB抗体(P均<0.01)。较SSA抗体，抗核抗体明显增高(PO.Ol)。因此，抗a-胞衬蛋白多肽抗体在干燥综合征血清学诊断中具重要价值。具体实施例方式实施例1抗胆碱能M3型受体蛋白多肽的设计及合成前述的研究工作(1—4)已经证明，从sigma公司购进s细胞真核表达的人胆碱能M3型受体蛋白能够特异性的结合干燥综合征患者体内的胆碱能M3型受体蛋白抗体，然后通过特定的方法可以将其检出。本发明的试验中首先利用Flechsler等(5)报道的固相合成法合成了一条共16个氨基酸的胆碱能M3型受体蛋白多肽，其序列如下KRTVPPGECHQFLSE(即Lys-Arg-Trp-Glu-Val-Pro-Pro-Gly-Phe-Cys-Gln-Phe-Ile-Gln-Phe-Leu-Ser-Glu)研究表明上述胆碱能M3型受体蛋白多肽具有能特异性的识别干燥综合征患者血清中的特异性抗体的作用，对干燥综合征的诊断具有重要的意义。实施例2抗胆碱能M3型受体蛋白多肽对干燥综合征患者血清中抗体的检测本研究采用酶联免疫吸附法(即ELISA法)对干燥综合征、类风湿关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)患者血清中的抗M3型受体蛋白多肽抗体进行检测，以评价该多肽抗体在各种疾病中的分布。首先将M3型受体蛋白多肽包被于酶联免疫吸附微孔板上，与待测血清一起孵育，如果血清中存在的抗M3型受体蛋白多肽抗体，该抗体就会与包被的固相抗原结合，形成抗原-抗体复合物。将未结合的抗体及其它成分冲洗干净后，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人IgG抗体(IgG-HRP)—起孵育，此时1gG-HRP就会与抗原-抗体复合物结合，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，洗去未结合的成分，加入底物，若血清中含有M3型受体蛋白多肽抗体，则会显出特定的颜色，且抗体滴度越高颜色越深。加终止液后在450mn波长下测定OD值。检测原理示意图见图1。本研究共检测78例原发干燥综合征(pSS)，16例继发干燥综合征(sSS)，80例类风湿关节炎(RA),80例系统性红斑狼疫，17例系统性硬化及200例正常人血清中的抗M3受体多肽抗体。采用待测标本OD值(A值)>正常人平均OD值(X)±2X标准差(2s)为阳性阈值。本实施例主要通过以下几个方面阐明本发明多肽在干燥综合征患者诊断中的意义1、M3型受体蛋白多肽抗体阳性率在干燥综合征、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、其他结缔组织病及正常人的比较。本研究用ELISA方法检测了M3型受体蛋白多肽抗体在干燥综合征、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮及正常人的阳性率，见表l。应用u检验比较各组数据，结果显示，M3型受体蛋白多肽抗体在原发和继发性干燥综合征的阳性率显著高于类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、其他结缔组织病和正常人，p值均0.05。原发和继发性干燥综合征的M3型受体蛋白多肽抗体的阳性率相近，无统计学差异。而M3型受体蛋白多肽抗体在系统性红斑狼疮和类风湿关节炎的阳性率显著高于正常人(p<0.05)。表1.抗M3型受体蛋白多肽-IgG抗体在各风湿免疫病中的阳性準<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注P值为各组抗M3型受体蛋白多肽抗体的灵敏性与原发性SS组灵敏性的比较2、抗M3型受体蛋白多肽抗体在不同疾病中的滴度比较ELISA方法检测抗M3型受体蛋白多肽-IgG抗体的吸光度(OD)在pSS、sSS、RA、SLE及正常对照组中的平均值分别为0.85、0.62、0.25、0.31、0.27。在SS患者组中抗体吸光度平均水平明显高于其它结缔组织病和正常人对照组(图2)。3、抗M3型受体蛋白多肽-IgG，IgA，IgM抗体三种亚型在SS中阳性率的比较为了验证以合成的多肽抗原检测SS患者自身抗体的方法能否应用于区分不同亚型抗M3受体多肽自身抗体的检测，我们同时测定了33例pSS患者和7例sSS患者的抗M3型受体蛋白多肽-lgG，IgA和IgM抗体的水平(见表2),在pSS和sSS中抗M3型受体蛋白多肽-IgG抗体的阳性率均明显的高于抗M3型受体蛋白多肽-IgA和抗M3型受体蛋白多肽-lgM的阳性率(PO.Ol)。此外，在pSS患者中抗M3型受体蛋白多肽-IgG抗体阳性的患者IgG的平均水平为28.23g/L，明显高于阴性患者的11.25g/L(P<0.05)。_表2抗M3型受体蛋白多肽自身抗体在SS中的阳性率桥,M3想孕汰虽内名pSSfa-3Ti_sSS(n=7)_自身抗体类型阳性例数阳性率％阳性例数阳性率％IgG2884.8*571.4*igA618.2116.71gM26.10-陽--注*表示为抗M3型受体蛋白多肽-lgG抗体的阳性率与抗M3型受体蛋白多肽-IgA和IgM抗体阳性率相比P〈0.014抗M3型受体蛋白多肽抗体与其他自身抗体在SS检测中的阳性率的比较抗M3型受体蛋白多肽抗体在pSS患者中的敏感性为84.6%，明显的高于抗a-胞衬蛋白抗体，抗SSA抗体，抗SSB抗体及抗ANA(P<0.01，见表3)。此外在抗a-胞衬蛋白抗体阴性，抗SSA抗体阴性，抗SSB抗体阴性和抗ANA阴性的pSS患者中抗抗M3型受体蛋白多肽抗体的阳性率分别为85%，89.3%，88.9%和95.2%(见表4)。表3自身抗体在SS中的敏感性比较抗体类型_pSS(n=7ii)__sSS<n=16、抗体阳性例数阳性率(％)抗体阳性例数阳性率(％)抗M3RP抗体6684.61381.3抗a-胞衬蛋白抗体5874.443.8抗SSA抗体5064.1850.0抗SSB抗体3443.6531.3ANA5773.11062.5表4抗M3RP抗体在抗a-胞衬蛋白抗体，抗SSA抗体，抗SSB抗体和抗ANA阴性的pSS患者中的阳性率组别例数抗M3RP阳性例数阳性率(％)抗a-胞衬蛋白抗体(-)201785.0抗SSA抗体(-)282589.3抗SSB抗体(-)363288.9抗ANA(-)212095.25、抗M3型受体蛋白多肽-IgG抗体与SS患者临床表现及与其他实验室指标的相关性在SS中抗M3RP抗体阳性与患者肺间质纤维化，肾小管酸中毒，血小板减少，肝功能损害的发生率无显著相关性(PX).05)。此外，免疫循环复合物(CIC),血沉(ESR)，白细胞和红细胞水平在两组间也无显著性差异(结果未显示)。6、抗M3型受体蛋白多肽抗体等自身抗体在干燥综合征的敏感性和特异性的比较。表5显示了抗M3型受体蛋白多肽抗体、SSA抗体、SSB抗体及ANA在千燥综合征中的敏感性和特异性。SSB抗体的特异性明显高于or胞衬蛋白多肽抗体、SSA抗体和ANA，但敏感性仅为17.9%，显著低于cc-胞衬蛋白多肽等抗体。因此，结合敏感性和特异性，a-胞衬蛋白多肽抗体在诊断中的意义可能优于其他自身抗体。表5自身抗体在SS中的敏感性比较<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>序列表<110>北京大学人民医院<120>抗M3型受体蛋白多肽抗体测定在干燥综合征诊断中的应用<140><141>2002-08-06<160>1<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>16(氨基酸)<213>人工序列<223>合成<400>1LysArgTrpGluValProProGlyPheCysGinPhelieGinPheLeuSerGlu权利要求1.具有胆碱能M3型受体多肽序列KRTVPPGECFIQFLSE(即Lys-Arg-Trp-Glu-Val-Pro-Pro-Gly-Phe-Cys-Gln-Phe-Ile-Gln-Phe-Leu-Ser-Glu赖氨酸-精氨酸-色氨酸-缬氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-谷氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-异亮氨酸-谷氨酰胺-苯丙氨酸-亮氨酸-丝氨酸-谷氨酸)的氨基酸、多肽类似物及蛋白。2.权利要求1的胆碱能M3型受体多肽及其类似物的制备。3.权利要求l的胆碱能M3型受体多肽及其类似物在用不同检测方法(如ELISA、Westernblot、金标记法等)制备诊断试剂盒(IgG、IgA型等)中的应用。全文摘要本发明提供了一种M3型受体蛋白多肽及其类似物用于干燥综合征的检测。这种多肽抗原可特异性的结合干燥综合征患者体内的特异性抗体，具有很高的敏感性和特异性。文档编号C07K7/00GK101186635SQ20071017658公开日2008年5月28日申请日期2007年10月31日优先权日2007年10月31日发明者栗占国申请人:北京大学人民医院