专利名称：一种蛋白质复合物或复合体的三维凝胶电泳分离方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白质复合物或复合体的三维凝胶电泳分离方法。
背景技术：
蛋白质复合物或复合体三维凝胶电泳(three-dimensional gel electrophoresis, 3-DE)技术最早由Wolf Werhahn等人提出(Werhahn， W. ， Braun， H. P.， Electrophoresis 2002， 23， 640-646)，它是指将蛋白质混合物先进行蓝色非变性聚丙烯酰 胺凝胶电泳(bluenative polyacrylamide gel electrophoresis, BN-PAGE)或非变性聚 丙條酉先胺凝胶电泳(native polyacrylamide gel electrophoresis, native-PAGE)方法 分离，再进行常规二维凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis, 2_DE)方法分 离。其具体方法是将线粒体中的蛋白质混合物先进行蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法 分离，切下含目标蛋白质复合物或复合体的凝胶条带，再进行蛋白质电洗脱和蛋白质沉淀 以回收胶内蛋白质，将回收的蛋白质用常规二维凝胶电泳方法进行分离，从而得到了目标 蛋白质复合物或复合体的亚基分布图。该三维凝胶电泳分离技术充分整合了蓝色非变性聚 丙烯酰胺凝胶电泳和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法的简便、经济、电泳条件温和的特点 和二维凝胶电泳方法高分辨率的优点，使其能够有效地分离大部分的蛋白质复合物或复合 体，即使该蛋白质复合物或复合体存在于复杂生物样本中，如细胞或组织粗提液(Wittig， I. ， Bra皿，H. P. ， Schagger， H. ， Nature Protocol 2006， 1， 418-428)。 然而，该方法的主要缺点是蛋白质电洗脱和蛋白质沉淀操作过程比较繁琐，还需
要专门的蛋白质电洗脱设备，且此过程将不可避免地造成蛋白质损失，并容易发生蛋白质 体外化学修饰；同时由于蛋白质复合物或复合体中各亚基的溶解性可能存在较大差异，将
导致各亚基回收量不一致，最终导致所分析的蛋白质复合物或复合体中各亚基化学计量数 不准确。因此，需要建立一种无需经过蛋白质电洗脱和蛋白质沉淀过程的蛋白质复合物或 复合体的三维凝胶电泳分离方法，以便获得生物体内的真实的生命信息。
发明内容
本发明的目的是提供一种无需经过蛋白质电洗脱和蛋白质沉淀过程的蛋白质复 合物或复合体的三维凝胶电泳分离方法。 本发明所提供的蛋白质复合物或复合体的三维凝胶电泳分离方法，包括下述步 骤 1)将蛋白质混合物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法分离，然后将其染色。
2)切下步骤1)中得到的含目标蛋白质复合物或复合体的凝胶条带，并将其脱色 和脱水。 3)用蛋白质变性溶液浸泡步骤2)中处理过的凝胶条带，将其充分碾碎后直接进 行二维凝胶电泳方法分离。 所述步骤1)中，所述电泳分离方法为采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法分离蛋白质混合物，然后将其染色。 所述步骤2)中，所述脱色为用含25慮碳酸氢铵和50% (体积分数)乙腈的溶液浸泡冲洗所述含目标蛋白质复合物或复合体的凝胶条带。 所述步骤2)中，所述脱水为用脱水剂浸泡所述含目标蛋白质复合物或复合体的凝胶条带，然后使脱水剂挥发；或者采用真空离心干燥的方法，将胶内水分完全挥发。所述脱水剂可为甲醇、乙醇、丙酮或乙腈，优选乙腈，乙腈的优点是脱水速度明显比其他脱水剂快。 所述步骤3)中，所述蛋白质变性溶液为含7M尿素、2M硫脲和0. 02g/ml3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐的溶液。 所述步骤3)中，所述用于浸泡凝胶的蛋白质变性溶液的用量不仅包括能使第一维等电聚焦电泳方法所用的固相pH梯度胶条充分水化的体积量，还包括被凝胶吸胀的体积量。能使第一维等电聚焦电泳方法所用的固相PH梯度胶条充分水化的蛋白质变性溶液推荐体积量可以根据所用的固相pH梯度胶条的长度来确定；被凝胶吸胀的蛋白质变性溶液体积量一般为每个凝胶条带20 iU 。所以，除了加入能使第一维等电聚焦电泳方法所用的固相pH梯度胶条充分水化的体积量外，还应根据凝胶条带的个数补加相应体积量的蛋白质变性溶液，避免由于固相pH梯度胶条未能充分水化而导致第一维等电聚焦电泳方法分离效果不好。 所述步骤3)中，所述碾碎后的凝胶直接进行二维凝胶电泳方法中的第一维等电聚焦电泳(isoelectric focusing, IEF)方法分离。所述步骤1)和3)中涉及的凝胶成分丙烯酰胺单体和甲叉双丙烯酰胺两者总含
量在所述非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法的分离胶中与所述二维凝胶电泳方法中的第一
维等电聚焦电泳方法所用的固相PH梯度胶条中的差值在0. 02g/ml以下。 本发明的方法无需传统蛋白质混合物三维凝胶电泳方法中的蛋白质电洗脱和蛋
白质沉淀操作过程，从而避免了蛋白质损失及蛋白质的体外化学修饰；且本发明的方法操
作简单，无需另外设备。实验证明，本发明的方法产生了很好的蛋白质复合物或复合体电泳
分离效果。
图1为含20S蛋白酶体的样品的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
图2为本发明方法电泳得到的20S蛋白酶体亚基分布图
具体实施例方式
下述实施例中的方法，若无特别说明，均为常规方法。 实施例1、蛋白质混合物的三维凝胶电泳分离方法及其效果分析 经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法分离后，我们尝试将含目标蛋白质复合物或复
合体的凝胶条带不经蛋白质电洗脱和蛋白质沉淀过程，而是直接进行二维凝胶电泳方法中
的第一维等电聚焦电泳方法分离。该方法的可行性主要基于第一维等电聚焦电泳方法以下
两个特点 现阶段用于第一维等电聚焦电泳分离方法的商品化固相pH梯度胶条的浓度为T=4%，C = 3% (T是指丙烯酰胺单体和甲叉双丙烯酰胺两者总含量(g)占溶液体积(ml)的 百分比浓度，C是指甲叉双丙烯酰胺含量(g)与丙烯酰胺单体含量(g)的质量分数)，如GE Healthcare Immobiline DryStripTM和B io-rad ReadyStrip IPGStrip。该固相pH梯 度胶条浓度T = 4%与文献(Zong，C. ，Gomes，A. V. ，Drews，O. ，Li，X. ， et al. 'Circulation Research 2006， 99， 372-380 (Online Supplement Material) ;Klei j體，M. F. ， Roelofs， J. ， Park, S. ， Hathaway, N. A. ， et al. ， Nature Structural Molecular Biology2007， 14， 1180-1188 (Supplementary Methods) ;Gillette， T. G. ， K咖ar， B. ， Thompson, D.， Slaughter, C. A. ， Demartino， G.N. ， Journal of Biological Chemistry 2008,283， 31813-31822.)报道的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法中的分离胶浓度T = 3. 6-4. 5%相 差不大。 由于凝胶孔径的空间限制作用和染色过程中甲醇或乙醇的固定作用，经过非变性 聚丙烯酰胺凝胶电泳方法分离的蛋白质复合物或复合体在一定程度上是被固定在凝胶内 部，但在蛋白质变性溶液(含7M尿素、2M硫脲和0.02g/ml 3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基] 丙磺酸内盐的溶液)的变性作用下，组成蛋白质复合物或复合体的各个亚基将不受制于凝 胶孔径。在等电聚焦电泳高电压的作用下，这些亚基能够在"外来凝胶"(即切下的含目标 蛋白质复合物或复合体的凝胶条带)和固相pH梯度胶条间迁移。所以，在等电聚焦电泳方 法分离过程中，"外来凝胶"的存在并不会影响蛋白质聚焦效果。 哺乳动物20S蛋白酶体(20S proteasome)是由14种不同亚基组成的蛋白质复合 体，且每个亚基又包含数个不同的亚型。20S蛋白酶体介导胞内蛋白质的降解过程，并参与 多种细胞生物学过程的调节。现以20S蛋白酶体为研究对象，通过具体实验考察本发明的 方法的可行性与分离效果；本发明的方法具体过程如下所述
1、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离方法 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的组成成分以及电泳条件如下所述
分离胶(T = 5.5%，C = 5%)成分为90mM三羟甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四 乙酸(TBE) (pH 8. 3) ， 5mM氯化镁(MgCl2) ， lmM 二硫苏糖醇(DTT) ， 0. 08% (体积分数)四甲 基乙二胺(TEMED)和0. 001g/ml过硫酸铵； 浓縮胶(T = 4%， C = 5% )成分为20mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl) (pH 7.5)，5mM氯化镁(MgCl2) ， lmM 二硫苏糖醇(DTT)，0.1% (体积分数)四甲基乙二胺 (TEMED)和0. 001g/ml过硫酸铵; 电泳缓冲液成分为含25mM三羟甲基氨基甲烷和192mM甘氨酸的溶液；
电泳设备北京市六一仪器厂DYCZ-24DN型垂直电泳仪； 所用样本的纯化方法健康志愿者红细胞10ml(来自北京市红十字会血液中心)， 加入20ml含40mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl) (pH 7. 5)，5mM氯化镁(MgCl2)，0. 5M 氯化钠(NaCl) ， lmM二硫苏糖醇(DTT) ， lmM苯甲基磺酰氟(PMSF) ， 10mM氟化钠(NaF)和10mM 焦磷酸钠(Na4P207)的溶液，4度放置1小时后，进行超速离心。超速离心具体条件为(下述 步骤都在4度进行)步骤一，154000 X g，离心2小时20分钟，小心吸取上清溶液；步骤二， 198000Xg，离心6小时，倒去上清，用20ml上述溶液将沉淀重悬后，稍许离心去除不溶物， 小心吸取上清溶液；步骤三，离心条件同步骤二，倒去上清，用lml含50mM 4-羟乙基哌嗪乙 磺酸-氢氧化钠(HEPES-Na0H) (pH7. 5) ，5mM氯化镁(MgCl2) ， 100mM氯化钠(NaCl)和lmM二
5硫苏糖醇(DTT)的溶液将此沉淀重悬后，稍许离心去除不溶物，小心吸取上清溶液。此上清 溶液即为含20S蛋白酶体的蛋白质混合物样本。经检测该蛋白质混合物样本中20S蛋白酶 体的浓度约为3% (质量分数)。 样本上样量每个上样孔上样100 g上述蛋白质混合物样本，共2个上样孔，每个 上样孔含约3 g 20S蛋白酶体； 电泳条件50伏，1小时;150伏，4小时；温度:4度; 电泳结束后，按照文献(Candiano，G. ，Bruschi，M. ，Musante，L. ，Santucci，L. ， et al. ， Electrophoresis 2004， 25， 1327-1333)报道的方法，进行考马斯亮蓝G-250染色。
上述非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法分离结果如附图1所示，表明所述非变性聚 丙烯酰胺凝胶电泳方法能从蛋白质混合物样本中分离出20S蛋白酶体。
2、凝胶的脱色和脱水 切下含目标蛋白质复合体或复合物(即20S蛋白酶体)的2个凝胶条带，并分别 进一步将其切成约lmm3大小的胶块，将此胶块转移到一个容积为2ml的离心管中。用水洗 三次，每次5分钟。然后加入lml含25mM碳酸氢铵和50X (体积分数)乙腈的溶液，振荡 离心管，吸去溶液后，再加入lml该溶液，直至完全脱去胶块上的蓝色。根据之前凝胶染色 深浅程度，该脱色过程一般需要1至12小时。 胶块完全脱色后，加入lml乙腈，此时便可观察到胶块收縮，并由半透明逐渐变 成白色，表明胶块正被脱水。5分钟后，吸去溶液，并将胶块室温放置30分钟，使乙腈完全 挥发；或者将上述已脱色的胶块放入真空离心干燥机(SpeedVac，美国赛默飞世尔科技公 司)，运行该仪器使胶内水分完全挥发。
3、二维凝胶电泳分离方法 在装有步骤2得到的凝胶胶块的离心管中，加入490ia蛋白质变性溶液(含7M尿 素、2M硫脲和0.02g/ml 3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐的溶液)。其中，450ul 蛋白质变性溶液体积量是保证第一维等电聚焦电泳方法所用的固相pH梯度胶条能充分水 化，此例中所用的固相pH梯度胶条长度为24cm，使其充分水化的推荐体积量为450iU(可 查询美国GE Healthcare公司的固相pH梯度胶条ImmobilineTMDryStripTM产品使用说明 书)；另外40ia蛋白质变性溶液体积量是让胶块充分吸胀，一般为每个凝胶条带20ia，此 例为2个凝胶条带(最多可同时处理5个凝胶条带，而不影响第一维等电聚焦电泳方法分 离效果)，故补加了 40 iU蛋白质变性溶液。然后取干净镊子将胶块充分碾碎，碾碎后应保 证胶块在蛋白质变性溶液中成糊状，无肉眼可见胶粒。 将上述得到的样本室温放置2小时后，加入6 iU DeStreak 试剂(美国 GEHealthcare公司，货号17-6003-18)和2. 5 ii 1 IPG Buffer (pH3-10，非线性)(美国 GE Healthcare公司，货号17-6000-88)，使DeStreak 试剂和IPG Buffer终浓度分别为 1. 2% (体积分数)和O. 5% (体积分数)。将此样本均匀分布于胶条槽(StripHolder)(美 国GE Healthcare公司，货号80-6469-88)内，并小心放入固相pH梯度胶条Immobiline DryStripTM(24em，pH3-10，非线性)(美国GE Healthcare公司，货号17-6002-45)，最后加 入覆盖油(Cover Fluid)(美国GE Healthcare公司，货号:17-1335-01)。
第一维等电聚焦电泳方法分离在EttanTM IPGphor 3IEF System(美国 GEHealthcare公司，货号11-0033-64)中进行。其具体条件为40伏，20小时；100伏，2小时；200伏，2小时；500伏，2小时；1000伏，2小时；由1000伏升至8000伏(梯度模式)，2小时；8000伏，144000伏小时；整个过程温度为20度。 第一维等电聚焦电泳方法分离完成后，先将固相pH梯度胶条在含50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸(pH6.8)、7M尿素、30X (体积分数)甘油、0.02g/ml十二烷基硫酸钠、0. Olg/ml 二硫苏糖醇和痕量溴酚蓝的溶液中平衡15分钟，然后在含50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸(pH6.8)、7M尿素、30X (体积分数)甘油、0. 02g/ml十二烷基硫酸钠、0. 025g/ml碘乙酰胺和痕量溴酚蓝的溶液中平衡15分钟。平衡过程完成后，在EttanTM DAL TsixLarge Vertical System(美国GE Healthcare公司，货号80-6485-08)中进行第二维十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis, SDS-PAGE) (T = 12. 5%， C = 3. 3% )方法分离。电泳条件为10毫安，1小时；40毫安，直到溴酚蓝接近底部时停止电泳；整个过程温度为4度。
如附图2所示，20S蛋白酶体各亚基主要分布在等电点4-9范围和20000-30000道尔顿分子量范围内，各蛋白质点位置与文献报道一致(Claverol， S. ， Burlet-Schiltz， 0.，Girbal—Neuhauser， E. ， Gairin， J. E. ， Monsarrat， B. ， Molecular Cellular Proteomics2002， 1,567-578)，表明所述蛋白质复合物或复合体三维凝胶电泳方法具有很好的分离效果。上述实验结果证明了本发明的方法的可行性与分离效果。
权利要求
一种蛋白质复合物或复合体的三维凝胶电泳分离方法，包括下述步骤1)将蛋白质混合物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法分离，然后将其染色；2)切下步骤1)中得到的含目标蛋白质复合物或复合体的凝胶条带，并将其脱色和脱水；3)用蛋白质变性溶液浸泡步骤2)中处理过的凝胶条带，将其碾碎后进行二维凝胶电泳方法分离。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤2)中，所述脱色为用含25mM碳 酸氢铵和50% (体积分数)乙腈的溶液浸泡冲洗所述含目标蛋白质复合物或复合体的凝胶 条带。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于在所述步骤2)中，所述脱水为用脱水剂 浸泡所述含目标蛋白质复合物或复合体的凝胶条带，然后使脱水剂挥发；或者采用真空离 心干燥的方法，将胶内水分完全挥发；所述脱水剂为甲醇、乙醇、丙酮或乙腈。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于；所述脱水剂为乙腈。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于在所述步骤3)中，所述蛋白质变性溶液 为含7M尿素、2M硫脲和0.02g/ml 3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐的溶液。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于在所述步骤3)中，所述用于浸泡凝胶的 蛋白质变性溶液的体积量不仅包括能使第一维等电聚焦电泳方法所用的固相pH梯度胶 条充分水化的体积量，还包括被凝胶吸胀的体积量，被凝胶吸胀的体积量为每个凝胶条带 20ii 1。
7. 根据权利要求1-6中任意一项所述的方法，其特征在于丙烯酰胺单体和甲叉双丙烯酰胺两者总含量在所述非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法的分离胶中与所述二维凝胶电泳方法中的第一维等电聚焦电泳方法所用的固相PH梯度胶条中的差值在0. 02g/ml以下。
全文摘要
本发明公开了一种蛋白质复合物或复合体的三维凝胶电泳分离方法。该方法包括下述步骤1)将蛋白质混合物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法分离，然后将其染色。2)切下步骤1)中得到的含目标蛋白质复合物或复合体的凝胶条带，并将其脱色和脱水。3)用蛋白质变性溶液浸泡步骤2)中处理过的凝胶条带，将其充分碾碎后直接进行二维凝胶电泳方法分离。本发明的方法无需传统蛋白质复合物或复合体三维凝胶电泳方法中的蛋白质电洗脱和蛋白质沉淀操作过程，从而避免了蛋白质损失及蛋白质的体外化学修饰；且本发明的方法操作简单，无需另外设备。实验证明，本发明的方法产生了很好蛋白质复合物或复合体的电泳分离效果。
文档编号C07K1/26GK101768207SQ20091007649
公开日2010年7月7日 申请日期2009年1月5日 优先权日2009年1月5日
发明者李智立, 陈国强 申请人:中国医学科学院基础医学研究所