专利名称：：一种抗梭曼的抗体的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种抗梭曼的抗体。
背景技术：
：梭曼(Soman)属有机磷酸酯类化合物，通过不可逆地抑制乙酰胆碱酯酶活性而引起一系列的中枢及外周胆碱能症状，具有毒性强、作用快、难防难治等特点。因而对梭曼中毒的医学防护备受关注，是防化医学研究的重点之一。对于梭曼中毒，用特异性抗体结合游离的梭曼可以避免或降低毒剂对于胆碱酯酶的抑制作用，对梭曼中毒起到预防甚至一定的治疗作用。传统的杂交瘤技术制备单克隆抗体是将半抗原与载体蛋白连接，直接免疫小鼠，产生鼠源抗体。由于鼠源单克隆抗体具有异源性，不能直接对人体进行免疫，因而其在人体内的应用受到了限制，而人源抗体的制备难度很大。近年来，随着鼠单抗人源化技术、抗体库技术和转基因鼠技术的进展，人源抗体的研制技术正在得到解决，尤其是通过构建大容量、具有良好多样性的抗体库，为人源抗体的制备提供了有效的技术平台。噬菌体抗体库技术是全套抗体基因展示在噬菌体表面，并能在体外模拟抗体免疫系统的选择作用，呈现在噬菌体表面的抗体能够在体外用固相化抗原进行筛选。经过几轮"吸附一洗脱一扩增"的淘筛，可使特异性噬菌体抗体得到富集。利用噬菌体抗体库技术借助高效筛选系统，可以不经免疫方便地制备出人源抗体(王琰,化冰,刘群英,等.半合成抗体库的构建及鉴定.中华微生物学和免疫学杂志，1999;19(3):23.)。第一个来源于噬菌体抗体库的治疗性人源抗体(抗TNF-a，治疗类风湿性关节炎)已于2003年初批准上市，印证了用大容量噬菌体抗体筛选人源抗体的可行性。
发明内容本发明的目的是提供一种抗梭曼的抗体。本发明所提供的抗梭曼的抗体，包括轻链可变区和重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列l的自氨基末端第133-246位氨基酸残基，所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列l的自氨基末端第l-lll位氨基酸残基。上述抗体具体可为单链抗体。所述抗体的重链可变区和轻链可变区之间还可以有连接肽，所述连接肽的长度具体可为21个氨基酸残基。上述抗梭曼的抗体为如下l)或2)所示的蛋白质1)由序列表中序列l所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和Z或缺失和/或添加且具有抗梭曼功能的由l)衍生的蛋白质。上述抗梭曼的抗体的编码基因也属于本发明的保护范围。所述抗梭曼的抗体的编码基因为如下l)-3)中任一所述的基因1)其核苷酸序列是序列表中的序列2;2)在严格条件下可与序列表中序列2限定的DNA序列杂交且编码上述任一抗体的DNA分子；3)与l)的基因具有90X以上的同源性且编码上述任一抗体的DNA分子。含有上述抗梭曼的抗体编码基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。本发明的抗梭曼的抗体可以用于制备治疗抗梭曼的药物。本发明的另一个目的是提供一种治疗抗梭曼的药物。本发明所提供的治疗抗梭曼的药物，它的活性成分是上述任一所述抗梭曼的抗体。本发明采用单噬粒载体通过loxp—cre定位重组构建工作库。梭曼由于分子量较小(M2=182)、结构简单、无免疫原性，用梭曼水解过渡态类似物和蛋白偶联的人工抗原进行抗体库的筛选，可以筛选出与梭曼结合的抗体，甚至具有水解梭曼活性的抗体酶。在筛选的过程中，用3%的牛血清白蛋白溶解回收抗体，其目的是游离的牛血清白蛋白与抗体库发生竞争性结合，从而降低非特异性结合。在ELISA检测过程中，包被小牛血清白蛋白做为抗原，从而选择特异性与梭曼类似物结合的抗体，进而进一步鉴定其与梭曼结合的活性。用HB2151菌株进行可溶性表达和活性鉴定，是由于在构建噬菌体抗体载体时，在抗体基因与Gin基因之间引入了一个琥珀终止密码子，在含有琥珀抑制基因的宿主菌中，抗体基因和GIII成为一个开放阅读框架，这时抗体就能借助噬菌体外壳蛋白呈现在噬菌体表面，而在不带有琥珀抑制基因的宿主菌HB2151中，由于终止密码子的存在，抗体分子不与GIII融合表达，在信号肽介导下分泌到质周腔中进行折叠，便产生了可溶性的抗体片段(BaylyAM,KorttAA,HudsonPJ，etal.Large-scalebacterialfermentationandisolationofScFvmultimersusingaheat-induciblebacterialexpressionvector[J].JImmunolMethods,2002,262:217-227.)。将融合的噬菌体抗体转染大肠杆菌HB2151，经IPTG诱导，分泌有功能的可溶性抗体，排除了噬菌体蛋白的干扰，获得可以和梭曼结合的抗体。经ELISA鉴定，本发明的抗梭曼的抗体具有很好的特异性，与梭曼的结合活性490nm(吸光度值)达0.79士0.01。在大容量抗体库的筛选过程中发现，获得的可结合抗原的噬菌体抗体库的克隆中，有部分丧失了与抗原结合的活性，有部分则变成了非特异结合，其可能原因是一、有些克隆亲和力较低，在噬菌体表面表达时因可能存在的多价，显示强大的放大效应；二、可溶性表达时，由于抗体分子不与GIII融合表达使蛋白的立体构象发生了变化。图1为阳性克隆可变区基因的指纹图谱具体实施例方式实施例l、抗梭曼的抗体的获得一、工作库(大容量噬菌体抗体库)的制备具体制备方法参见如下文献SblatteroD,BradburyA.Exploitingrecombinationinsinglebacteriatomakelargephageantibodylibraries.NatBiotechnol,2000;18:74.从原始噬菌体抗体库(乔媛媛，王琰，陈晓穗，王欲晓，化冰.大容量噬菌体抗体库的构建及鉴定，中华微生物学和免疫学杂志,2004,24(3),194-197.中国人民解放军海军总医院)中取出7X10^cfti的噬菌体颗粒以100:1的感染复数(multiplicityofinfection,MOI=100/1)超感染BS1365细胞(王琰，王欲晓,陈晓穗，化冰,刘晓林,用于大容量噬菌体抗体库的表达载体的构建及鉴定,中国免疫学杂志,2003,19(2)，93-96.中国人民解放军海军总医院)，37。C水浴保温l小时，使多副本载体进入同一个细胞，通过cre-loxp介导的定位重组使同一细胞内不同载体之间的轻、重链随机交换配对。加入2YT培养基(含有1.6X质量百分含量的蛋白胨、1%质量百分含量的酵母提取物和0.5%质量百分含量的氯化钠)至400ml，补足Amp，使其在培养基中的终浓度为100yg/ml，振荡培养至OD49^0.5。再在培养基中加入5ml辅助病毒VCSM13(pfu=3X1012)(MerckST200251)，3(TC培养过夜，次日收集噬菌体抗体库，测定滴度。所获噬菌体上清再以M01《1的比例感染1000ml对数生长期的XL1-Blue菌(Stratagen,货号:200228)，37"C静置30min;取少许菌铺含Amp的培养盘计算库容，补足Amp至100ug/ml，再加入10mlVCSM13，3(TC培养过夜，次日回收上清，PEG8000(购自Promege公司)进行沉淀，获得工作库。计算工作库的库容和抗体库滴度，结果表明，获得库容为7X10^的大容量人源噬菌体抗体库，所获抗体库的滴度为lX1013cfu/ml。二、抗梭曼噬菌体抗体的筛选、制备及ELISA检测具体的筛选方法参见如下文献乔媛媛,王琰，陈晓穗,等.大容量噬菌体抗体库的构建及鉴定.中华微生物学和免疫学杂志，2004;24(3):194.王琰，刘群英,化,冰,等.从人源性噬菌体抗体库分离出1株含有异常序列的抗HBsAgFab克隆.中国免疫学杂志，1998，14(1):115.将梭曼水解过渡态类似物3-羟基-1-对硝基苯基甲膦酸单频哪基醇酯(P6)和蛋白进行偶联得到偶联物，以得到的偶联物为半抗原，以牛血清白蛋白(购自Merck公司，货号12659)为载体蛋白进行反应，得到P6-BSA。P6和P6-BSA的具体制备过程见如下文献:杨日芳,恽榴红,王字玲,荣康泰梭曼抗体酶研究II:"潜过渡态"半抗原设计策略及其在梭曼抗体酶研究中的应用军事医学科学院院刊，2000年24(2):105-109.中国人民解放军海军总医院)。以上述获得的P6-BSA作为抗原进行下面的实验。将上述获得的P6-BSA稀释至50ug/ml，以lml包被免疫管(购自丹麦NUNC公司)，4t过夜，次日以含3%质量百分含量脱脂奶粉的封闭液加满免疫管，37°C封闭2小时，倒去封闭液，加入lml上述步骤一构建的噬菌体抗体库(抗体库滴度为lxl013cfu/ml)，37。C孵育2小时，吸去噬菌体抗体液，以含0.05%质量百分含量吐温20的PBS溶液洗涤5次(第二轮洗15次，以后各轮洗涤20次以上)，然后用蒸馏水洗涤一次。回收结合于固相的噬菌体抗体，先加入lml新鲜XLl-Blue菌直接感染，37"C孵育15min后，加入10ml含20ug/mlAmp的SB培养基(每升SB培养基中含有胰蛋白胨30克,酵母粉20克,3-(N-吗啉代)丙磺酸10克，其余为水)；再将细菌感染回收后的免疫管用PBS及蒸馏水各洗涤2次，加入lml洗脱液(含O.lmlHCl，以甘氨酸调至pH至2.2，再加入BSA使其在洗脱液中的质量百分含量为0.1%)37'C静置15min后再进行洗脱回收。用吸管将洗脱液吸出后，加入45^12mol/LTris中和，再加入10mlXL1-Blue细胞37。C静置15min后，加入10ml含100ug/mlAmp的SB培养基。从两次回收的菌液中分别取出适量铺盘测定CFU，其余细菌37r培养3小时，扩大体积到100ml，加入3X1012pfu的辅助病毒VCSM13，3(TC振荡培养过夜。每轮筛选后均测定次级库的滴度，并计算噬菌体抗体库的投入产出比(即回收率)，作为特异性噬菌体抗体富集的指标，噬菌体抗体库投入产出比的结果如表2所示。次日回收上清，PEG8000(购自Promege公司)进行沉淀，所得次级噬菌体抗体库再进行下一轮的筛选。表2噬菌体抗体库的投入产出比轮数投入产出投入产出比11X10107X1057X10—521,2X10102.24X1051.87XId531.8X10'02.06X1061.14X10—41.5X10")5X1073.33X10—:'51.6X101"6.2X1073.87X10—3经过4轮的筛选，测定每轮洗脱回收的噬菌体滴度，发现得到了约一百倍富集。从第三和第四轮筛选得到的菌落中随机挑取350个单克隆，接种在含有100吗/mlAmp的2YT培养液中培养过夜，第二天分别取30ul菌液到lmlSB培养基中，37'C培养至对数生长期，加入辅助病毒VCSM13，3(TC培养过夜，收取上清即得到噬菌体抗体。将上述制备的噬菌体抗体进行ELISA检测，同时以卵清蛋白(OA)(购自Sigma公司)和牛血清白蛋白(BSA)作为对照。将浓度为50yg/ml的P6-BSA作为抗原包被ELISA板，l小时后弃去孔内液体，用含3。/。质量百分含量脱脂奶粉的PBS封闭后分别加入上述制备的噬菌体抗体，37"C孵育1小时；用含0.05%质量百分含量Tween20的PBS溶液洗涤3次，加入HRP标记的抗M13羊单抗(Pharmacia,27-9420-01)37。C孵育l小时，洗涤后加入OPD底物显色，读取A490。显色阳性的克隆再以P6-BSA、BSA和卵清蛋白为抗原同时包被ELISA板，鉴定其抗原抗体反应的特异性。实验设三次重复，结果表明，所制备的噬菌体抗体中，有105个能与P6-BSA结合，阳性率为30%，其中，有52个与牛血清白蛋白或卵清蛋白不结合，具备特异性(14.9%)。选取其中3个结合活性高的克隆的噬菌体抗体进行ELISA检测，结果如表3所示。表3噬菌体抗体与不同抗原反应的ELISA检测<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>OA0.06±0.020.01±0.000.12±0.01BSA-O,Ol土O.01-0.01±0.02O.OO士O.00表3中，OA表示卵清蛋白，BSA表示牛血清白蛋白，l-3分别为3个结合活性高的克隆的噬菌体抗体。三、可溶性抗梭曼抗体的表达与ELISA鉴定将上述步骤二ELISA鉴定出的52个特异性阳性的梭曼噬菌体抗体108倍稀释后感染大肠杆菌HB2151(王琰，刘群英,化冰,陈宇萍,朱迎春,陈晓穗,从半合成抗体库克隆抗TNF-a人单链抗体,免疫学杂志,1999,15(4):87-89.中国人民解放军海军总医院)，37。C孵育15分钟后铺培养盘。挑取单个集落接种于含有100|ag/mlAmp的2YT培养液中培养过夜，第二天取30ul菌液接种到lmlSB培养基中，37"C培养至对数生长期，加入IPTG(购自Promege公司)使其在培养基中的终浓度为lmmol/L，3(TC培养过夜，收取上清即得到可溶性抗体。非抑制表型菌HB2151中，ScFv以游离可溶的形式存在，在GIII信号肽介导下分泌表达。将上述获得的可溶性抗体进行ELISA检测，同时以卵清蛋白(OA)(购自Sigma公司)和牛血清白蛋白(BSA)作为对照。将P6-BSA稀释至10yg/ml，以50ul包被ELISA板，l小时后弃去孔内液体，用含3%质量百分含量脱脂奶粉的PBS封闭后分别加入上述获得的可溶性抗体，37"C孵育1小时，用含0.05%质量百分含量Tween20的PBS溶液洗涤3次，加入HRP标记的抗V5抗体(Invitrogen，R961-25)进行反应，再用含0.05%质量百分含量Tween20的PBS溶液洗漆3次，37。C孵育1小时后加入OPD底物显色，读取A490。实验设三次重复，结果表明，有14个克隆ELISA检测有活性，并与P6-BSA特异性结合。挑选其中3个结合活性高的克隆的可溶性抗体及进行ELISA检测，结果如表4所示。表4可溶性抗体与不同抗原反应的ELISA检测123P6-BSA0.55±0.010.58±0.020.79±0.01OA0.01±0.000,15±0.010.18±0.01BSA-0.01±0.01-0.01±0.02-0,04±0.03表4中，OA表示卵清蛋白，BSA表示牛血清白蛋白，l-3分别为3个结合活性高的克隆的可溶性抗体。上述实验结果中，可溶性表达后的活性与噬菌体表达不完全一致，可能是诱导条件发生了变化，或表面表达的抗体片段受周围膜环境的影响，立体结构有所不同导致结合活性发生了改变。此外用ELISA检测噬菌体抗体，也可导致ELISA结果有所不同。四、抗体可变区基因的多样性分析(DNA指纹)提取上述步骤三筛选到的特异性结合克隆的质粒，并以其为模板，以P1:5，國CGGCAGCCGCTGGATTGTTA-3，为上游引物，以P2:5'-CTAAACAACTTTCAACAGT-3，为下游引物，PCR扩增ScFv基因；PCR扩增产物用CL-6B凝胶(购自Phamacia公司)微型柱离心纯化，再用限制性内切酶MvaI(购自TAKARA公司)37"C消化2h，取10w1酶切产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，EB染色后根据DNA指纹图谱分析其多样性。阳性克隆可变区基因的指纹图谱如图l所示。其中，泳道M为DNA分子量标准，泳道l-14分别为来自14个阳性克隆的指纹图谱。上述14个阳性克隆共有4种指纹图谱，利用PCGENE软件对这4种指纹图谱进行序列分析，结果表明，克隆l(图1中泳道3)L链可变区基因来自VL2亚群，H链可变区基因来自VH3亚群；克隆2(图l中泳道l)L链可变区基因来自VkII亚群，H链可变区基因来自VH3亚群；克隆3(图1中泳道7)L链可变区基因来自VL1亚群，H链可变区基因来自VH3亚群；克隆4(图1中泳道9)L链可变区基因来自VL2亚群，H链可变区基因来自VH3亚群。上述ELISA检测结合活性最高的抗梭曼的抗体(图1中泳道7)的氨基酸序列如序列1所示，其中自氨基末端第133-246位为重链可变区，自氨基末端第1-111位为轻链可变区。9序列表〈110〉中国人民解放军海军总医院〈120>—种抗梭曼的抗体〈130〉CGGNARZ92023〈160〉2<210〉1<211>246<212>PRT〈213〉人工序列〈220><223〉<400>1GinSerValLeuThrGinProProSerValSerAlaAlaProGlyGin151015LysValThrlieSerCysSerGlySerSerSerAsnlieGlyAsnAsn202530TyrValSerTrpTyrGinGinLeuProGlyThrAlaProLysLeuLeu354045lieTyrAspAsnAsmLysArgProSerGlylieProAspArgPheSer505560<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>LeuGluTrpValAlaSerlieLysGinAspGlySerAspLysTyrTyr180185190ValAspSerValLysGlyArgPheThrlieSerArgAspSerAlaThr195200205AsnSerLeuHisLeuGinMetAsnSerLeuThrAlaGluAspThrAla210215220ValTyrTyrCysAlaArgGlyAspMetAspTyrTrpGlyGinGlySer225230235240LeuValThrValSerSer245<210>2<211〉738<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉<400>2cagtctgtgctgacgcagccgccctcagtgtctgcggccccaggacagaaggtcaccatc60tcctgctctggaagcagctccaacattgggaataattatgtatcctggtaccagcagctc120ccaggaacagcccccaaactcctxat"t"ta1:gacaataataagcgaccctcagggatt:cct180gaccgattctctggcttcaagt:ccggcacgtcagccaccctgggcatcaccggactccag240actggggacgeiggccgattattactgcggaacatgggatgigcagcctgagtgctgtggU300ttcggcggagggaccaagctgaccgtcctaggttccggagggtcgaccataacttcgcat360aatgtatactatacgaagttatcctcgagcggtaccgaggtgcagctggtgcagtctggg420ggaggcttggtccagcctggggggtccctgagactctcctgtgcaacctctggattcacc480tttagttcttattggatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtg540gccagcataaagcaagatggaagtgacaaatactatgtggactctgtgaagggccgattc600accatctccagagacagcgccacgaactcacttcatctgcaaatgaacagcctgacagcc660gaggacacggctgtgtattactgtgcg卿ggtga"Utggactactggggccagggatxc720ctggtcaccgtctcctca7381权利要求1、一种抗梭曼的抗体，包括轻链可变区和重链可变区，其特征在于所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列1的自氨基末端第133-246位氨基酸残基，所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列1的自氨基末端第1-111位氨基酸残基。2、根据权利要求l所述的抗体，其特征在于所述抗体为单链抗体。3、根据权利要求1或2所述的抗体，其特征在于所述抗体为如下l)或2)所示的蛋白质1)由序列表中序列l所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗梭曼功能的由l)衍生的蛋白质。4、权利要求l-3中任一所述抗体的编码基因。5、根据权利要求4所述的编码基因，其特征在于所述编码基因为如下l)-3)中任一所述的基因1)其核苷酸序列是序列表中的序列2;2)在严格条件下可与序列表中序列2限定的DNA序列杂交且编码权利要求l-3中任一所述抗体的DNA分子；3)与l)的基因具有90%以上的同源性且编码权利要求1-3中任一所述抗体的DNA分子。6、含有权利要求4或5所述基因的重组表达载体或表达盒。7、含有权利要求4或5所述基因的转基因细胞系。8、含有权利要求4或5所述基因的重组菌。9、权利要求l-3中任一所述的抗体在制备治疗抗梭曼的药物中的应用。10、一种治疗抗梭曼的药物，它的活性成分是权利要求1-3中任一所述的抗体。全文摘要本发明公开了一种抗梭曼的抗体。本发明所提供的抗梭曼的抗体，包括轻链可变区和重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列1的自氨基末端第133-246位氨基酸残基，所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列1的自氨基末端第1-111位氨基酸残基。本发明以固相化的P6-BSA为抗原，运用构建的大容量噬菌体抗体库，成功地筛选到人源抗梭曼抗体，经ELISA鉴定，本发明的抗梭曼的抗体具有很好的特异性，与梭曼的结合活性490nm(吸光度值)达0.79±0.01。文档编号C07K16/44GK101463088SQ200910076198公开日2009年6月24日申请日期2009年1月13日优先权日2009年1月13日发明者周丽君,杨日芳,琰王,王欲晓,王玉霞,贾蓓媛申请人:中国人民解放军海军总医院