人血清白蛋白-干扰素融合蛋白及其编码基因与应用的制作方法

专利名称：人血清白蛋白-干扰素融合蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及人血清白蛋白-干扰素融合蛋白及其编码基因与应用。
背景技术：
干扰素(interferon, IFN)是一类具有抗病毒、抗增殖以及免疫调节活性的 细胞因子。根据其活性和产生细胞的类型不同，干扰素可分为干扰素-a ，干扰素-e 和干扰素-Y等。其中干扰素-a (如干扰素-a2a，干扰素-a 2b和干扰素-a lb) 在临床上被广泛用于治疗多种病毒性疾病(乙型肝炎，丙型肝炎)和肿瘤。
然而天然干扰素-a的半衰期较短，只有频繁给药(在临床治疗中往往采用每 周注射三次的用药方式)才能获得令人满意的疗效。如此频繁的用药方式再加上较 长的治疗周期(6-12个月)使得病人较难承受。因此迫切需要研制出作用时间长的 重组人干扰素- a 。
人血清白蛋白(human serum albumin， HSA)是机体中一种稳定的且半衰期较 长的蛋白。研究表明许多蛋白药物与人血清白蛋白交联或融合后可以显著地使其半 衰期延长，从而减少用药次数。
美国HGSI (Human Genome Sciences Inc)公司的Albuferon是一个不含接头 的人血清白蛋白和干扰素-a2b的融合蛋白(HSA-IFN-a2b)，在该融合蛋白中干 扰素部分处于融合蛋白的C末端，人血清白蛋白部分处于融合蛋白的N末端。目前 Albuferon已进入了 III期临床研究。研究结果表明Albuferon具有较长的体内半 衰期，较高的安全性及较好的疗效。但是，HSA-IFN-ci2b存在不均一性和不稳定性 等缺陷。IFN-a2b-HSA是通过改变融合蛋白的相位获得的一个具有更高均一性和稳 定性的新型融合蛋白。IFN-a2b-HSA在提高表达臺和回收率，降低生产成本等方面 表现出了明显的优势，具有良好的开发前景。(2hao HL， Xue C, Wang Y， Li XY， Xiong XH， Yao XQ， Liu ZM. Circiimvehting the heterogeneity and instability of human serum albumin-interferon-alpha2b fusion protein by altering its orientation. J Biotechnol. 2007 S印15; 131 (3) :245-52)，(刘志敏赵洪亮 等人血清白蛋白-干扰素融合蛋白及其编码基因与应用。中国发明专利申请号 CN 200710099325)。蛋白药物在生产，存放和使用过程中不可避免要遇到震荡及受热等压力条件， 稳定性较差的蛋白药物必须采用生产成本高，使用不便的冻干剂型。IFN-a2b-HSA 融合蛋白在震荡及受热等压力条件下的稳定性较差，易形成共价聚体。

发明内容
本发明的目的是提供一种人血清白蛋白-干扰素融合蛋白及其编码基因与应用。
本发明所提供的人血清白蛋白-干扰素融合蛋白，命名为IFN- a 2b-HSA (C34S)， 是如下(a)或(b)的蛋白质
(a) 由序列表中序列l的氨基酸残基组成的蛋白质；
(b) 将序列表中序列1的氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且具有干扰素a2b活性的由(a)衍生的蛋白质。
为了使(a)中的IFN-a2b-HSA(C34S)便于纯化，可在由序列表中序列l的 氨基酸残基序列组成的蛋白质的N端或C端连接上如表1所示的标签。
表l.标签的序列
标签残基序列
Poly-Arg5-6 (通常为5个)RRRRR
Poly-His2-10 (通常为6个)HHHHHH
FLAG8DYKDDDDK
Strep-tag II8WSHPQFEK
c—myc11EQKLISEEDL
上述(b)中的IFN-a2b-HSA(C34S)可人工合成，也可先合成其编码基因，再 进行生物表达得到。上述(b)中的IFN-a2b-HSA(C34S)的编码基因可通过将序列 表中SEQ ID N2: 2的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密病子，和/或进行 一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的 编码序列得到。
序列表中的序列1由750个氨基酸残塞组成，自氨基末端第1-165位为 IFN-a2b的氨基酸残基序列，自氨基末端第166-750位为人血清白蛋白(HSA)的 氨基酸残基序列，自氨基末端第199位由丝氨酸残基替换了人血清白蛋白(HSA) 中的半胱氨酸残基。
上述融合蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。IFN-a2b-HSA(C34S)的编
4码基因，具体可为如下l)或2)或3)的基因
1) 其核苷酸序列是序列表中序列1;
2) 在严格条件下与1)限定的DNA片段杂交且编码人血清白蛋白和干扰素组成
的融合蛋白的DNA分子；
3) 与l)或2)的基因具有90%以上的同源性，且编码人血清白蛋白和干扰素 组成的融合蛋白的DNA分子。
所述步骤3)中的基因，与l)的基因最好有95%以上的同源性。 上述严格条件可为在6XSSC， 0. 5% SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用
2XSSC， 0. 1% SDS和1 XSSC， 0. 1% SDS各洗膜一次。
序列表中的序列2由2253个核苷酸组成，编码序列表中序列1所示的蛋白。 含有所述融合蛋白的编码基因的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌均属于
本发明的保护范围。
扩增上述融合蛋白编码基因全长或其任意片段的引物对也在本发明的保护范
围之内。
本发明的另一个目的是提供一种生产所述人血清白蛋白-干扰素融合蛋白的方法。
本发明所提供的生产所述人血清白蛋白-干扰素融合蛋白的方法是将所述融合 蛋白编码基因导入宿主细胞，表达得到融合蛋白。
其中，所述宿主可为酵母菌、大肠杆菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌 等，优选为酵母菌。
所述酵母菌优选为巴氏毕赤酵母(尸ic力ia 。其中，所述巴氏毕赤
酵母优选为巴氏毕赤酵母GS115, KM71或SMD1168(可购自美国Invitrogen公司)。
所述大肠杆菌可为A c。h' JM109， ￡ coh' HB101, ￡ coh. ToplO。
本发明所述的融合蛋白、所述融合蛋白的编码基因可用来制备预防和/或治疗 肿瘤，和/或抑制病毒的药物。
预防和/或治疗肿瘤，和/或抑制病毒的药物的活性成分为所述的人血清白蛋白 -干扰素融合蛋白。
需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述 载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸 收促进剂、表面活性剂、吸附载体等。本发明的药物可以制成注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液等多种形式。 上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
上述药物的用量一般为每个成人每次注射500-1000y g的融合蛋白，每隔 14-28天给药一次，疗程为3至12个月。
实验证明，本发明的IFN-a2b-HSA(C34S)融合蛋白稳定性高、半衰期较长，在 医学上也具有较高的安全性及较好的疗效；IFN-a 2b-HSA(C34S)融合蛋白的表达量 高，易纯化，并具生产周期短，生产规模大，成本低，具有重要的应用前景和实际 意义。


图1为IFN- a 2b-HSA和IFN- a 2b-HSA(C34S)的纯化结果。 图2为凝胶过滤层析比较IFN- a 2b-HSA和IFN- a 2b-HSA(C34S)在震荡条件下 的稳定性。
图3为非还原SDS-PAGE比较IFN- a 2b-HSA和IFN- a 2b-HSA(C34S)在震荡条件 下的稳定性。
图4为凝胶过滤层析比较IFN- a 2b-HSA和IFN- a 2b-HSA (C34S)在受热条件下 的稳定性。
图5为利用非还原SDS-PAGE比较IFN- a 2b-HSA和IFN- a 2b-HSA(C34S)在受热 条件下的稳定性。
图6为比较IFN-a 2b-HSA和IFN-a 2b-HSA(C34S)在大鼠体内的药代动力学。
具体实施例方式
下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法。
下述实施例中所用试剂均可从商业途径获得。
主要试剂
1、 DNA限制性内切酶、T4DNA连接酶、聚合酶等分别购自GIBC0-BRL、 Pharmacia、 Bio-Labs及华美生物工程有限公司
2、 PCR扩增试剂盒(瑞典Pharmacia公司产品)
3、 DNA序列分析试剂盒(美国USB公司产品)
4、 酪蛋白水解物 (德国MERK公司产品)
5、 Bacto-酵母抽提物 (美国Difco公司产品)
6、 酵母菌原生质体转化法所需溶液
6(1) SED: 1M山梨醇，25mM EDTA， 50mM DTT， pH8. 0。
(2) SCE: 1M山梨醇，lOraM柠檬酸钠，10mM EDTA， pH5.8。
(3) CaS: 1M山梨醇，lOraM CaCl2。
(4) SOS: 1M山梨醇，0.3XYPD， lOraM CaCl2。
(5) CaT: 20mM Tris-HC1， pH7. 5， 20mM CaCl2。
(6) PEG: 20o/o PEG-3350， 10mM CaCl2， lOraM Tris-HCl (pH 7.4)。
(7) 1M PBS缓冲液132ml 1M K2HP04， 868ml 1M KH2P04， pH 6.0。 7、引物由上海生工合成
F: 5' -CCCTCGAGAAAAGATGTGACTTGCCACAAACCCACTCC-3';
R: 5' -GGGAATTCCTATTACAAACCCAAAGCAGCTTGAGAAGC-37 。
C34SF: 5' -TACTTGCAACAATCTCCATTCGAAGAC-3';
C34SR: 5' -GTCTTCGAATGGAGATTGTTGCAAGTA-3'。
IAR : 5' -GGGAATTCCTATTACAAACCCAAAGCAGCTTGAGAAGC--3';
NF: 5' -CAAGAGTCCTTGAGATCCAAGGAGGACGCTCACAAGTCTGAAGTTGCT-3'
IAF: 5' -CCCTCGAGAAAAGATGTGACTTGCCACAAACCCACTCC-3';
NR: 5' —AGCAACTTCAGACTTGTGAGCGTCCTCCTTGGATCTCAAGGACTCTTG—3'
实施例l、 IFN- a 2b-HSA和IFN- a 2b-HSA(C34S)融合蛋白的制备 1. IFN-a2b-HSA融合蛋白基因的获得
(1) 干扰素-a2b基因
干扰素-a 2b基因是根据巴斯德毕赤酵母偏爱密码子合成的人工基因。干扰素 -a 2b基因的合成按照文献(Martinez et al: PCR-based gene synthesis as an efficient approach for expression of the A+T—rich malaria genome. Protein Engineering. 1999, 12 (12) : 1113-1120)中描述的方法进行。
(2) HSA基因
HSA基因系由刘志敏等根据巴斯德毕赤酵母偏爱密码子合成的人工基因。HSA 基因的合成按照文献(刘志敏等人血清白蛋白改构基因、表达载体及其宿 主。中国发明专利专利号CN 99102794.9)中描述的方法进行。
(3) IFN-a2b-HSA融合蛋白基因的获得
融合蛋白IFN-a2b-HSA基因的构建以步骤(2)中得到的HSA基因为模板，在引物NF和引物IAR的引导下，利用PCR扩增试剂盒(瑞典Pharmacia公司产品) 扩增HSA基因；以步骤(1)中得到的IFN-a2b基因为模板，在引物IAF和引物NR 的引导下，利用PCR扩增试剂盒(瑞典Pharmacia公司产品)扩增IFN-a 2b基因。 以上述两步中的扩增产物为模板，以引物IAF和引物IAR为引物扩增出 IFN- a 2b-HSA融合蛋白基因。PCR反应的扩增体系为
HSA基因 lpl IFN-a 2b基因 lul
引物IAF 2nl
引物IAR 2 yl
dNTP 1 u 1 10x pfu酶缓冲液 5 u 1
pf u酶 1 w 1
蒸馏水 37 yl 总体积 50wl。
反应条件为94°C 30秒，55°C 30秒，72°C 4分钟，共进行30个循环。 将酵母表达载体pPIC9和得到的IFN- a 2b-HSA基因分别用Xhol和EcoRI限制 性内切酶酶切后，用T4DNA连接酶将IFN-a2b-HSA基因克隆入pPIC9，得到重组表 达载体IFN-a2b-HSA/pPIC9。并用DNA序列分析试剂盒(美国USB公司产品)对该 重组载体进行测序，结果表明IFN-a2b-HSA基因序列与预期相符。 2. IFN-a 2b-HSA(C34S)融合蛋白基因的获得
通过定点突变将IFN-a 2b-HSA融合蛋白中HSA部分的第34位非配对半胱氨酸 残基替换为丝氨酸残基，并将改造后的融合蛋白命名为IFN-a2b-HSA(C34S)。
具体的实施方法为以IFN-a2b-HSA融合蛋白基因为模板，在引物F和引物 C34SR的引导下，利用PCR扩增试剂盒(瑞典Pharmacia公司产品)扩增 IFN-a2b-HSA(C34S)融合蛋白基因的5 '部分；以FN-a 2b-HSA融合蛋白基因为模 板，在引物C34SF和引物R的引导下，利用PCR扩增试剂盒(瑞典Pharmacia公司 产品)扩增IFN-a2b-HSA(C34S)融合蛋白基因的3'部分。以上述两步中的扩增产 物为模板以引物F和引物R为引物扩增出IFN-a2b-HSA(C34S)融合蛋白基因。PCR 反应的扩增体系为
IFN-a2b-HSA(C34S)融合蛋白基因的5'部分 1
8IFN-a2b-HSA(C34S)融合蛋白基因的3，部分 lyl
<formula>formula see original document page 9</formula>
10x pfu酶缓冲液 5 u 1
pfu酶 1 " 1
蒸馏水 38 ill
总体积 50ul
反应条件为94°C 30秒，55°C 30秒，72°C 4分钟，共进行30个循环。 将酵母表达载体pPIC9和得到的IFN- a 2b-HSA(C34S)融合蛋白基因分别用 Xhol和EcoRI限制性内切酶酶切后，用T4 DNA连接酶将IFN- a 2b-HSA(C34S)融合 蛋白基因克隆入pPIC9，得到重组表达载体IFN-a2b-HSA(C34S)/PPIC9。用DNA序 列分析试剂盒(美国USB公司产品)对该重组载体进行测序，结果表明 IFN-a 2b-HSA(C34S)基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示，编码序列表中序列 l所示的蛋白。
3.人血清白蛋白和干扰素融合蛋白基因在巴斯德毕赤酵母中的表达 将IFN- a 2b-HSA(C34S) /pPIC9和IFN- a 2b-HSA/pPIC9用酵母原生质体转化法 转化巴斯德毕赤酵母宿主菌GS115 (Mut+his—)，并将转化产物涂布在MD平板(1. 34 g/100ral YNB， 2g/100ml葡萄糖，4x10—5g/100ml生物素，1 g/100ml琼脂)上，得 到转化子。随机挑取24个转化子，接种于4ml BMGY培养基(1 g/100ral酵母抽提 物，2 g/100ml胰蛋白胨，1. 34 g/100ml YNB， 4x10—5 g/100ml生物素，1 g/100ml 甘油，lOOraM p朋.O磷酸钾缓冲液)培养液中，每隔12小时加入0. 5 ml/100ral甲 醇进行诱导表达，在30。C ， 200rpra下培养36-48小时。将培养液用5000rpm离心 10min，各取100pL上清液，真空抽干，将样品分别进行10% SDS-PAGE电泳鉴定， 用pPIC9空载载体表达物作对照，鉴定出高表达克隆。然后将这些筛选出来的高表 达克隆分别用15 g/100ml甘油低温保菌、斜面培养，用于作为进一步表达的工程 菌。
挑取上述工程菌接种于4 ml BMGY培养液中，30°C 100rpm摇培12-24小时。 取1 ml酵母菌液转接于50 ml BMGY培养液内，继续摇培18小时，再将40 ml上 述培养18小时的培养液接入1000 ml BMGY培养液内，在30。C, 200rpm继续摇培30小时，将得到的培养液在5000rpm离心5min，弃上清，然后将工程菌用200 ml B丽Y (lg/100ml酵母抽提物、2g/100ml胰蛋白胨、1. 34g/100mlYNB、 4x10—5g/100ml 生物素、0. 5ml/100ml甲醇、100mM pH6.0磷酸钾缓冲液)诱导表达培养基悬浮菌 体，在3(TC 100rpm摇培3天，每隔24小时补加甲醇(终浓度为0. 5ml/100ml)。 巴斯德毕赤酵母工程菌的细胞密度达到OD,为18，表达的融合蛋白大多数分泌到培 养液内。4°C 10000 rpm离心20min，弃菌体，获得含大量融合蛋白表达产物的上 清液。
4.融合蛋白的分离纯化
将步骤3中的培养上清的pH调至4. 5，并用蒸馏水稀释5倍后用S S印harose F.F进行初步纯化。阳离子交换层析所用平衡缓冲液为50mM pH4. 5的醋酸缓冲液， 洗脱缓冲液为含1M NaCl的50mM pH4. 5醋酸缓冲液。经阳离子交换层析后再用 Phenyl S印harose HP疏水层析进行纯化。疏水层析所用平衡缓冲液为含1M (NH4)2S04的PH 6. 0的20raM磷酸盐缓冲液，洗脱缓冲液为PH 6. 0的20mM磷酸盐缓 冲液。经疏水层析纯化的样品用S印hadex G25将缓冲体系交换为pH为6. 0的20mM 磷酸盐缓冲液后用Source 30Q阴离子交换层析进行纯化。阴离子交换层析所用平 衡缓冲液为pH 6. 0的20raM磷酸盐缓冲液，洗脱缓冲液为含200mM NaCl的pH 6. 0 的20mM磷酸盐缓冲液。最后用Superdex200分子筛进行进一步纯化获得最终产物， 分子筛所用缓冲液为pH 7. 0的20raM磷酸盐缓冲液。
IFN-a 2b-HSA和IFN-a 2b-HSA(C34S)的纯化结果见图1。其中1为表达上清， 泳道2-5分别为经阳离子交换层析、疏水层析、阴离子交换层析和分子筛层析纯化 的样品。电泳结果表明IFN-a 2b-HSA(C34S)的回收率(33%)比IFN-a 2b-HSA的回 收率(25%)高。
实施例2、 IFN- a 2b-HSA和IFN- a 2b-HSA(C34S)融合蛋白稳定性的比较 将IFN- a 2b-HSA和IFN- a 2b-HSA(C34S)融合蛋白的蛋白浓度调整至lmg/ml 后利用凝胶过滤层析和非还原SDS-PAGE比较IFN- a 2b-HSA和IFN- a 2b-HSA (C34S) 在震荡(30°C， 200rpm震荡24， 48和72小时)和受热(60°C ， 2h)条件下的稳 定性。
震荡处理后凝胶过滤层析结果如图2，图2中，I-IV代表IFN-a2b-HSA蛋白在 30°C， 200rpm震荡0、 24、 48和72小时凝胶过滤层析结果；V-VIII代表 IFN- a 2b-HSA(C34S)蛋白在30°C ， 200rpm震荡0、 24、 48和72小时凝胶过滤层析
10结果。IFN-a 2b-HSA蛋白和IFN-a 2b-HSA(C34S)蛋白在震荡前单体的含量均为 100%;震荡24时，IFN-a2b-HSA蛋白单体的含量为80%， 二聚体含量为12%,多聚 体含量为8%， IFN-a 2b-HSA(C34S)蛋白单体的含量为95%， 二聚体含量为5%，多聚 体含量为0°/。；震荡48时，IFN- a 2b-HSA蛋白单体的含量为67%， 二聚体含量为20%， 多聚体含量为13%， IFN-a 2b-HSA(C34S)蛋白单体的含量为94%, 二聚体含量为16%， 多聚体含量为0%;震荡72时，IFN-a2b-HSA蛋白单体的含量为58y。， 二聚体含量 为17%，多聚体含量为25%， IFN-a 2b-HSA(C34S)蛋白单体的含量为92%， 二聚体含 量为8%，多聚体含量为0%。
震荡处理后非还原SDS-PAGE结果如图3所示，IFN- a 2b-HSA蛋白在30°C ， 200rpm震荡24、 48和72小时后非还原SDS-PAGE出现分子量比IFN- a 2b-HSA大的 条带，而IFN-a 2b-HSA(C34S)蛋白在30°C， 200rpm震荡24、 48和72小时后非还 原SDS-PAGE只有IFN- a 2b-HSA(C34S)蛋白单体的带。
受热处理后凝胶过滤层析结果如图4，图4中①代表IFN- a 2b-HSA蛋白在60°C ， 处理2h凝胶过滤层析结果；②代表IFN-a 2b-HSA(C34S)蛋白在6(TC，处理2h凝 胶过滤层析结果。6(TC处理2h IFN-a2b-HSA蛋白单体的含量为69%， 二聚体含量 为31%, IFN-a 2b-HSA(C34S)蛋白单体的含量为97%, 二聚体含量为3%。
受热处理后非还原SDS-PAGE结果如图5所示，IFN- a 2b-HSA蛋白60。C处理2h 后非还原SDS-PAGE出现分子量比IFN- a 2b-HSA大的条带，而IFN- a 2b-HSA(C34S) 蛋白60。C处理2h后非还原SDS-PAGE只有IFN-a 2b-HSA (C34S)蛋白单体的带。
上述实验结果表明在震荡及受热等压力条件下，IFN-a 2b-HSA(C34S)具有比 IFN- a 2b-HSA更高的稳定性。
实施例3、 IFN- a 2b-HSA和IFN- a 2b-HSA(C34S)融合蛋白抗病毒活性的测定
利用细胞病变抑制法测定IFN- a 2b-HSA和IFN- a 2b-HSA(C34S)的活性。
细胞培养Wish细胞(购自中国药品与生物制品检定所)为贴壁细胞，采用 0.25% (质量百分含量)胰酶消化，含10g/100ml小牛血清的RPMI 1640培养基加 入双抗(青霉素、链霉素各IOO单位)，37°C， 5%二氧化碳培养隔天传代。
VSV病毒悬液取9 10日龄的鸡胚，去头、翅膀、内脏制成细胞悬液，接种 在细胞培养瓶中培养24小时形成致密的单细胞层，接种VSV病毒(购自中国药品 与生物制品检定所)在细胞瓶中培养30小时收取培养上清-45。C保存待用。
微量板染色法将处理干净的微量板放在紫外线灯下照射30分钟，每孔加入
11100Wl细胞培养液，分别加入标准品(IFN-a2b)(安福隆，购自天津华立达生物 工程有限公司)、不同倍比稀释的IFN-a2b-HSA融合蛋白和不同倍比稀释的 IFN-a2b-HSA(C34S)融合蛋白，然后每孔再加入100 w 1细胞悬液(细胞浓度约为 40万/ml)，加盖静置放入二氧化碳培养箱培养6 8小时，显微镜下观察细胞已生 长成为单层，每孔加入100ul VSV病毒悬液开始攻毒20 30小时，观察加入标准 品的孔内细胞全部病变倒去培养液，进行染色(约30 40分钟)，倒去染液冲洗 干净晾干，每孔加入200ul脱色液脱色后用酶联仪(在A 570nra)处读取结果进行 计算。实验重复3次。
IFN- a 2b、 IFN- a 2b-HSA融合蛋白和IFN- a 2b-HSA(C34S)融合蛋白的EG。分 别为1.52士0. 34 ng/ml， 132±15. 2 ng/ml，和128±13. 1 ng/ml。
上述实验结果表明将人血清白蛋白部分的第34位未配对半胱氨酸残基替换为 丝氨酸残基后并未影响该融合蛋白的抗病毒活性。
实施例4、 IFN- a 2b-HSA和IFN- a 2b-HSA(C34S)在大鼠体内的药代动力学测定
1. 125I标记IFN- a 2b-HSA和IFN- a 2b-HSA(C34S)融合蛋白样品的制备和鉴定 用Iodogen法标记IFN- a 2b-HSA和IFN- a 2b-HSA(C34S)，具体方法参照Fraker:
PJ， Speck J"C Jr. Protein and cell membrane iodinations with a sparingly soluble chloroamide， 1, 3, 4， 6-tetrachloro-3a， 6a-diphrenylglycoluri1. Biochem Bi叩hys Res Co画n 1978, 80:849-57。用分子排阻HPLC鉴定 125I-IFN- a 2b-HSA和125I-IFN- a 2b-HSA(C34S)的放射化学纯度为98. 5%，比放射活 度为36.8kBq，吗—、蛋白含量为0.74mg'm1—1。可满足SD大鼠体内代谢及生物利 用度要求。
2. 实验动物
SD大鼠，购自军事医学科学院实验动物中心，许可证号SCXK-(军)2002-001， 饲养于动物房，定时排风，光照良好，常温。雌雄分笼，饲以饲料，自由饮水。
3. 125I-IFN- a 2b-HSA和125I-IFN- a 2b-HSA(C34S)的药代动力学研究 10只SD大鼠U5只，早5只，体重250土20g)，分为两组，每组5只($3
只，早2只)。每只皮下注射给药125I- IFN- a 2b-HSA或125I-IFN- a 2b-HSA(C34S) 276 kBq (7. 5 Pg，比活为36. 8 kBq pg-"，剂量约相当于30 Pg kg人在给药后0. 5h、 2h、 12h、 24h、 48h、 72h、 120h、 144h和192h从尾静脉采血。离心分离血清。取 每个时间点的血清50A，各管分别先后加入200 W注射用生理盐水和200 Pl
1220g/100ral的三氯醋酸溶液，离心后(4minX800g)，分离上清和沉淀，分别测定 沉淀部分和上清部分的Y放射性。
在Window' s Excel版本7. 0按梯形法则计算AUC，非房室模型统计矩法估算 其它药动学参数，用SigmaPlot 2001软件求回归方程和相关统计参数以及作图。
IFN-a 2b-HSA和IFN-a 2b-HSA(C34S)在大鼠体内的药代动力学测定结果如图 6所示，表明将人血清白蛋白部分的第34位非配对半胱氨酸替换为丝氨酸后并未影 响该融合蛋白在大鼠体内的半衰期。序列表
<110〉 军事医学科学院生物工程研究所
<120〉 人血清白蛋白-干扰素融合蛋白及其编码基因与应用
<130〉 CGGNARW92013
<160〉 2
<210〉 1
<211〉 750
〈212> PRT
〈213〉 人工序列
<220〉 〈223〉
<400〉 1
Cys Asp Leu Pro Gin 1 5 Phe Leu Ala Gin Met 20
Arg His Asp Phe Gly 35
Lys Ala Glu Thr lie 50
Asn Leu Phe Ser Thr 65
Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met
10 15 Arg Arg lie Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
25 30 Phe Pro Gin Glu Glu Phe Gly Asn Gin Phe Gin
40 45 Pro Val Leu His Glu Met lie Gin Gin lie Phe
55 60 Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 70 75 80
14Leu Asp Ala Cys Glu Asp
Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gin Gin Leu Asn Asp Leu Glu
90 95 Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys
Val
Ser 115 Lys
Tyr 85
Gin Gly Val Gly
lie 100
lie Leu Ala Val
Glu
Tyr Leu 130
Ala Glu lie Met 145
Leu Arg Ser Lys
Lys Arg
Arg 120 Ser
Val 105 Lys
Pro Cys Ala
Lys Tyr 135
Phe Ser Leu Ser
Tyr Phe Gin Cys
Ser 150
Asp Ala His Lys
Glu 165
Glu Glu Asn Phe
Trp 140
Thr Asn Leu Gin 155
Glu Val Ala His
Leu 110
Arg lie Thr Leu 125
Glu Val Val Arg
Lys Asp Leu Gly 180
Leu Gin Gin Ser
Ser 170
Ala Leu Val Leu
Ala Gin Tyr 195
Val Thr Glu Phe
Lys 185
Phe Glu Asp His
Asn Glu 210
Glu Asn Cys Asp Lys 225
Thr Val Ala Thr
Pro 200
Lys Thr Cys Val
Glu Ser 160 Arg Phe 175 lie Ala Phe 190
Lys Leu Val
Ala 215
Leu His Thr Leu
Ala Lys
Asp Asn
Cys Thr 290 Tyr Glu 305
Gin
Leu 245 Pro
Ser 230
Arg Glu Thr Tyr
Ala 220 Gly
Val 205
Asp Glu Ser Ala
Asp
Phe 235
Glu Met Ala
Glu
Glu 260
Asn Leu Pro
Gly 250
Cys Phe Leu Gin
Lys Asp
Pro 275
Ala Phe His Asp
lie Ala Arg Arg 310
Arg Asn Glu 265
Arg Leu Val Arg Pro Glu
Leu Cys 240 Cys Cys 255
Lys Asp
Leu 280
Glu Glu Thr Phe
His 270
Asp Val Met
Asn 295
His Pro Tyr Phe
Val 285
Lys Lys Tyr Leu
Tyr 315
Leu 300
Ala Pro Glu
Leu Leu 320
15Phe Phe Ala Lys Arg 325 Ala
Ala Asp Glu Gly
Lys
Ala 340
Ala Ser Ser Ala
Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gin Ala
335
Arg Asp
Tyr
Cys Leu Leu
Phe 330 Lys
Leu
Lys 355
Phe Gly Glu Arg
Pro 345
Gin Arg Leu
Gin Lys 370
Ser Gin Arg Phe Pro 385
Thr Asp Leu Thr
Lys 360
Phe Lys Ala Trp
Ala 375
Ala Glu Phe Ala
Lys 390
Val His Thr Glu
Asp
Lys
Ala 380 Val
Glu
Cys 365 Val
Ser
Leu 350
Ala Ser Leu Ala Arg Leu
Glu Cys Gin Asp
Ala
Lys 405
Asp Arg Ala Asp
Asp 420
lie Ser Ser Lys
Ser 435
Lys Ser His Cys
Leu 425 Lys
Cys 410 Ala
Glu
Glu 395
Cys His Gly
Lys Asp
Lys Cys
Leu Glu 450
Ala Asp Leu Pro Ser 465
Cys Lys Asn Tyr
Leu 440
Ala Glu Val Glu
Tyr Cys
lie
Leu Val 400 Leu Leu 415
Glu Asn
Cys 430
Lys Pro Leu
Tyr Glu Arg Leu
Tyr
Ala 515 Pro
Ala 485 Arg
Leu 470 Glu
lie 455
Ala Ala Asp Phe Ala Lys Asp
Glu 445
Asp Glu Met Pro
Val 475 Phe
Asn 460
Glu Ser Lys
Ala 500
Lys Thr Tyr Glu
Arg Tyr
His Glu Cys
Val 490
Tyr Ser Val Val
His Pro Asp 505
Thr Leu Glu Lys
Asp Val 480
Leu Gly Met Phe Leu 495
Leu Leu
Ala Asp 530
Leu Val Glu Glu Pro 545
Thr 520
Ala Lys Val Phe
Leu 510
Cys Ala Ala
Gin 550
Tyr 535
Asn Leu lie Lys
Cys 525
Glu Phe Lys Pro
Gin 555
Asp 540
Asn Cys Glu
Leu Phe 560
16Glu Gin Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gin Asn Ala Leu Leu Val 565
Pro Gin Val Ser
Thr Lys Arg Asn
Lys
Leu 595 Met
Val 580 Gly
Pro
Asn 570
Pro Thr Leu Val
Lys Cys
Thr 585
Lys Cys Cys Lys
Arg Tyr 575
Val Ser
Lys Arg 610
Leu Cys Val Leu His 625
Cys Cys Thr Glu
Val Gly Ser 600
Asp Tyr Leu Ser
Ala
Glu 615
Lys Thr Pro Val
His 605 Val
Glu 630
Leu Val Asn Arg
Ser 645
Thr Tyr Val Pro
Ser 635 Pro
Val 620
Asp Arg Val
Glu 590
Pro Glu Ala Leu Asn Gin
Glu Val Asp Glu 660
Ala Asp lie Cys
Arg 650
Glu Phe Asn Ala
Thr Phe His 675
Gin Thr Ala Leu
Lys 665
Leu Ser Glu Lys
Thr Lys 640
Cys Phe Ser Ala Leu 655
Thr Phe
Lys Lys 690
Thr Lys Glu Gin Leu 705
Glu Lys
Thr 680
Glu Leu Val Lys
Glu 670
Arg Gin lie
Val 695
Ala Val Met Asp
Glu 685
Lys Pro Lys Ala
Cys Gly Lys Lys
Cys
Leu 740
Lys 710
Ala Asp Asp Lys
Lys 725
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Asp 715 Thr
His 700
Phe Ala Ala
Gin 745
Glu 730
Ala Ala Leu Gly
Phe Val 720
Cys Phe Ala Glu Glu 735
Leu 750
<210> 2 <211〉 2253 〈212〉 DNA <213〉人工序列<220〉
<223〉
〈400> 2
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18<formula>formula see original document page 19</formula>
权利要求
1、人血清白蛋白-干扰素融合蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列1的氨基酸残基组成的蛋白质。(b)将序列表中序列1的氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有干扰素α2b活性的由(a)衍生的蛋白质。
2、 权利要求1所述的人血清白蛋白-干扰素融合蛋白的编码基因。
3、 根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述融合蛋白的编码基因，是如 下l)或2)或3)的基因1) 其核苷酸序列是序列表中序列2;2) 在严格条件下与1)限定的DNA片段杂交且编码人血清白蛋白和干扰素组成的 融合蛋白的DNA分子；3) 与l)或2)的基因具有90%以上的同源性，且编码人血清白蛋白和干扰素组 成的融合蛋白的DNA分子。
4、 含有权利要求2或3所述融合蛋白的编码基因的重组表达载体、转基因细胞 系或重组菌。
5、 扩增权利要求2或3所述融合蛋白编码基因全长或其任意片段的引物对。
6、 一种生产人血清白蛋白-干扰素融合蛋白的方法，是将权利要求2或3所述融 合蛋白编码基因导入宿主细胞中表达得到融合蛋白。
7、 根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述宿主为酵母菌、大肠杆菌、 哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌；所述宿主优选为巴氏毕赤酵母(尸ic力h pa^on\s0 ;所述巴氏毕赤酵母优选为巴氏毕赤酵母GS115， KM71或SMD1168。
8、 权利要求l所述融合蛋白、权利要求2或3所述融合蛋白的编码基因在制备 预防和/或治疗肿瘤，和/或抑制病毒的药物中的应用。
9、 一种预防和/或治疗肿瘤，和/或抑制病毒的药物，它的活性成分为权利要求l 所述的人血清白蛋白-干扰素融合蛋白。
10、 根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述药物还包含药学上可接受的 载体。
全文摘要
本发明公开了一种人血清白蛋白-干扰素融合蛋白及其编码基因与应用。该蛋白是由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质；本发明还公开了所述的人血清白蛋白-干扰素融合蛋白的编码基因，其核苷酸序列是序列表中序列2；本发明的融合蛋白稳定性高、半衰期较长，在医学上也具有较高的安全性及较好的疗效；该融合蛋白的表达量高，易纯化，并具有生产周期短，生产规模大，成本低的优点，具有重要的应用前景和实际意义。
文档编号C07K19/00GK101463089SQ20091007624
公开日2009年6月24日 申请日期2009年1月8日 优先权日2009年1月8日
发明者刘志敏, 冲 薛, 赵洪亮 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所