经修饰干扰素β多肽和其用途
【专利摘要】本发明提供经修饰干扰素β多肽和其用途。
【专利说明】经修饰干扰素β多肽和其用途
[0001]分案说明
[0002]本申请案是申请日为2008年4月30日，申请号为200880014461.7 (国际申请号为PCT/US2008/062083)，发明名称为经修饰干扰素β多肽和其用途的专利申请的分案申请。
【技术领域】
[0003]本发明涉及视情况经至少一个非天然编码氨基酸修饰的干扰素β多肽。
【背景技术】
[0004]干扰素(Interferon，IFN)是熟知的由多种真核生物细胞分泌的细胞激素家族。干扰素具有多种生物活性，包括抗病毒性、免疫调节性、免疫调控性、赘生性和抗增殖性且已用作治疗例如癌症的疾病和各种病毒性疾病的治疗剂。干扰素已显示治疗多种疾病的效用，且在治疗多发性硬化和病毒性肝炎中获得广泛应用；目前最常见的治疗应用是治疗丙型肝炎和多发性硬化。干扰素是生长激素(GH)超基因家族的成员(Bazan, F.1mmunologyToday11:350-354 (1990) ；Mott, H.R.和 Campbell, 1.D.Current Opinion in StructuralBiology5:114-121 (1995) ；Silvennoinen,0.和 Ihle, J.N.(1996)SIGNALING BY THEHEMATOPOIETIC CYTOKINE RECEPTORS)，其表示一组具有类似结构特征的蛋白质。这一蛋白质家族的各成员包含四螺旋束(four helical bundle)。虽然还有更多这一家族的成员尚待鉴别，但这一家族的一些成员包括以下:生长激素、促乳素、胎盘催乳素、促红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、白细胞介素-2 (IL-2)、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-ll、IL-12(p35亚单元)、IL_13、IL_15、制瘤素Μ、睫状神经营养因子、白血病抑制因子、α干扰素、β干扰素、Y干扰素、ω干扰素、τ干扰素、ε干扰素、粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和心肌营养素-1 (CT-1) ( “GH超基因家族”)。尽管GH超基因家族的成员一般具有有限的氨基酸或DNA序列一致性，但其具有类似的二级结构和三级结构。共有的结构特征使基因家族的新成员容易地被鉴别。 四螺旋束和干扰素多肽描述于标题为“Modified Human FourHelical Bundle Polypeptides and Their Uses” 的 W02005/074650、标题为 “ModifiedHuman Interferon Polypeptides and Their Uses” 的 W02005/074524、标题为 “ImprovedHuman Interferon Polypeptides and Their Uses，，的 W02006/133089 和 W02006/133088中，所有这些文献都以全文引用的方式并入本文中。
[0005]干扰素包括许多相关蛋白质，例如干扰素-α (IFN-α)、干扰素-β (IFN-β)、干扰素-Y (IFN- Y )、干扰素-K (IFN- K，也称为干扰素-ε或IFN- ε )、干扰素-τ (IFN- τ )和干扰素-ω (IFN-Q)0这些干扰素蛋白质产生于多种细胞类型中:IFN-ci (白细胞)、IFN-β (成纤维细胞)、IFN-Y (淋巴细胞)、IFN-e或κ (角质形成细胞)、IFN-ω (白细胞)和 IFN- τ (滋养细胞)。IFN- a、IFN- β、IFN- ε 或 κ、IFN- ω 和 IFN- τ 归为 I 型干扰素，而IFN-Y归为II型干扰素。干扰素α由多基因家族编码，而其它干扰素似乎各由人类基因组中的单个基因编码。此外，人类群体的不同成员间的干扰素序列中存在一定的等位基因变异。
[0006]干扰素是由被病毒入侵或暴露于某些其它物质中的细胞释放的相对较小的单链糖蛋白。干扰素目前分为三个主要类别:称为I)白细胞干扰素(干扰素-α、α-干扰素、IFN-a ), 2)成纤维细胞干扰素(干扰素-β、β_干扰素、IFN-β)和3)免疫干扰素(干扰素-Y、Y-干扰素、IFN-Y)。淋巴细胞应答病毒性感染主要合成α-干扰素(和ω干扰素，IFN-ω)，而成纤维细胞感染通常引发产生β-干扰素。IFNa和IFN0共有约20-30%氨基酸序列同源性。人类IFN-β的基因缺乏内含子，且编码与人类IFN-a具有29%氨基酸序列一致性的蛋白质，表明IFN-a和IFN-β基因由共同的祖先进化而来(Taniguchi等A，Nature285547-549(1980))。相比之下，IFN-Y由淋巴细胞应答丝裂原而合成。Pestka等人在Annu.Rev.1mmunol.(2004)22:929-79(以全文引用的方式并入本文中)中描述第2类 α 螺旋细胞激素，包括干扰素(IFN-a ,IFN-β ,IFN- ε、IFN_k、IFN-ω、IFN- δ、IFN_ τ和IFN- y )以及干扰素样分子，例如limitin、IL-28A、IL-28B和IL-29以及这些分子所使用的配体、受体和信号转导路径。干扰素具有不同种类和许多等位基因变异体。另外，已从患各种疾病的患者细胞中分离出具有新颖活性和突变序列的干扰素。
[0007]最初任选地使用引 发剂从例如白细胞层(buffy coat leukocyte)和成纤维细胞的天然存在来源获得干扰素从而增加干扰素产生。也由重组DNA技术制成干扰素。成熟IFNβ 的克隆和表达由 Goeddel 等人于 Nucleic Acids Res.8, 4057(1980)中描述。
[0008]I型干扰素似乎所有都结合共同受体，即I型IFN-R，这一受体由IFNARl和IFNAR2亚单元构成。I型干扰素之间的确切结合模式和下游信号转导级联有些不同。然而，JAK/STAT信号转导路径一般在干扰素与干扰素受体结合后被激活。STAT转录因子然后移位到核，促使许多具有抗病毒活性、抗赘生活性和免疫调节活性的蛋白质的表达。
[0009]天然存在的I型干扰素蛋白质的性质对治疗用途来说并非最佳。I型干扰素会引发注射部位反应和许多其它副作用。其具有高免疫原性，在很大比例的患者中引发中和抗体和非中和抗体。干扰素从皮下注射部位不良吸收且具有短血清半衰期。最后，I型干扰素不可溶性表达于原核生物宿主中，因此迫使再折叠(refolding)或哺乳动物表达方案成本较高且困难较大。
[0010]可自市面上购得的IFN广品的具体实例包括IFN Y -1b ( AciimmuncR )、
IFN β -1a ( Avonex 和 Rebif8, )、IFN β -1b ( Betaseron'5')、复合干扰素(IFN alfacon-1,
InIcrgcn )、IFN a -2 (Intron A?:)、IFNa -2a (( Roferon-A-1 )、聚乙二醇化干扰素
a -2a (PEGASYSlgl)和聚乙二醇化干扰素a -2b ( PEG-1ntron? )。与产生聚乙二醇化形式的IFN蛋白相关的一些问题描述于Wang等人(2002)Adv.Drug Deliv.Rev.54:547-570和Pedder, S.C.Semin Liver Dis.2003 ；23 增刊 1:19-22 中。Wang 等人表征 PEG-lrUron?|白勺
位置异构体，而Pedder等人比较PEGASYSR 1 j PEG-1ntronκ,描述所使用的聚乙二醇化化
学物质的不稳定性和对调配的影响。PEGASYS8'包含9种可鉴别的同种型，这些具体同种型在抗病毒活性方面不同(Foser等人，Pharmacogenomics J2003 ;3:312)。虽然目前可在市面上获得若干IFN产品，但仍对干扰素治疗剂存在未被满足的需要。本发明针对鉴别具有改进性质的干扰素蛋白质。若干小组已产生具有改进性质的经修饰干扰素；所有以下参考文献以全文引用的方式明确并入本文中。
[0011]已产生排除半胱氨酸变异体(Cysteine-depleted variant)以使不想要的分子间或分子内双硫键的形成降到最小(美国专利第4，518，584号、第4，588，585号和第4，959，314号，以全文引用的方式并入本文中)。已产生排除蛋氨酸的变异体(Methionine-depleted variant)以使对氧化的敏感性降到最小(EP0260350,以引用的方式并入本文中)。
[0012]已产生具有改良活性的干扰素(美国专利第6，514，729号、第4，738，844号、第4，738，845号、第4，753，795号、第4，766，106号、TO00/78266，以引用的方式并入本文中)。美国专利第5，545，723号和第6，127，332号(以引用的方式并入本文中)揭示干扰素β在位置101处经取代的突变体。已制备包含一种或一种以上干扰素的序列的嵌合干扰素(Chang等人，Nature Biotech.17:793-797 (1999)、美国专利第 4，758，428 号、第 4，885，166号、第5，382, 657号、第5，738, 846号，以引用的方式并入本文中)。也已描述干扰素β在位置49和51处的取代突变(美国专利第6，531，122号，以引用的方式并入本文中)。IFN3变异体和接合物的表达和产生论述于美国专利第7，144，574号和第6，531，111号中，这些专利以全文引用的方式并入本文中。所论述的修饰包括引入IFNβ中或从多肽中去除的糖化位点、糖化位点附近的取代、与赖氨酸或半胱氨酸残基的结合和氨基酸的引入和去除。
[0013]已论述稳定性增强的干扰素β变异体，其中疏水核心已利用合理设计方法优化(W000/68387,以引用的方式并入本文中)。也已揭示提高干扰素稳定性或溶解性的替代调配物(美国专利第4，675，483号、第5，730，969号、第5，766，582号、W002/38170，以引用的方式并入本文中)。 [0014]已论述溶解性增强的干扰素β突变蛋白，其中数个亮氨酸和苯丙氨酸残基经丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基置换(W098/48018，以引用的方式并入本文中)。改进溶解性的其它修饰论述于US2005/0054053中，这一专利以全文引用的方式并入本文中。
[0015]已论述免疫原性降低的干扰素α和干扰素β变异体(参看W002/085941和W002/074783,以引用的方式并入本文中)。
[0016]免疫原性是目前干扰素(包括但不限于干扰素β)治疗剂的主要限制。虽然对非人类蛋白质来说免疫反应通常最严重，但即使是例如干扰素β的基于人类蛋白质的治疗剂也时常观察到免疫原性。免疫原性是对感知为外来物质的物质所产生的一系列复杂反应且可包括产生中和抗体和非中和抗体、形成免疫复合物、补体激活、肥大细胞激活、发炎和过敏反应。若干患者对IFNP产生中和抗体(Int.Arch.AllergyImmunol.118:368371，1999)。已显示IFN β中和抗体的产生会降低对IFN β的生物反应，且引起治疗效果减小的倾向(Neurol.50:12661272, 1998)。中和抗体很可能也会阻碍IFN3与其它疾病治疗相关的治疗效用(Immunol.1mmuther.39:263268, 1994)。
[0017]数种因素会造成蛋白质免疫原性，包括(但不限于)蛋白质序列、投药途径和频率和患者群体。聚集与相关蛋白质治疗剂干扰素α的免疫原性相关联[Braun等人，Pharm.Res.199714:1472-1478]。另一研究表明DR15MHC等位基因的存在会增加对中和抗体形成的敏感性；有趣的是，相同等位基因还赋予对多发性硬化的敏感性[Stickler等人，GenesTmmun.20045:1-7]。[0018]因为聚集可能造成干扰素(尤其干扰素β)的免疫原性，所以经工程改造以改进溶解性的变异体还可具有减小的免疫原性。已产生排除半胱氨酸的变异体以使不想要的分子间或分子内双硫键的形成降到最小(美国专利第4，518，584号、第4，588，585号、第4，959，314号，以全文引用的方式并入本文中)；所述变异体显示减小的聚集倾向。已制备稳定性增强的干扰素β变异体，其中疏水核心已利用合理设计方法优化(W000/68387，以引用的方式并入本文中)；在一些情况下，可通过改进稳定性来增强溶解性。也已揭示提高干扰素稳定性和溶解性的替代调配物(美国专利第4，675，483号、第5，730，969号、第5，766，582号、W002/38170,以引用的方式并入本文中)。已论述溶解性增强的干扰素β突变蛋白，其中数个亮氨酸和苯丙氨酸残基经丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基置换(W098/48018,以引用的方式并入本文中)。
[0019]已通过添加聚乙二醇(“PEG”)来修饰干扰素(参看美国专利第4，917，888号、第 5，382，657 号和第 6，962，978 号、W099/55377、W002/09766、W000/23114，所有以全文引用的方式并入本文中)。PEG添加可改进血清半衰期和溶解性。在一些情况下，已观察到聚乙二醇化通过空间上阻断接近抗体抗原限制位(agretope)来降低产生中和抗体的患者比例(参看例如 Hershfield 等人,PNAS199188:7185-7189 (1991) ；Bailon 等人,Bioconjug.Chem.12:195-202(2001) ;He 等人，Life Sc1.65:355-368 (1999))。
[0020]还产生经预测以相对于野生型蛋白质减小的亲和力结合II类MHC等位基因的干扰素β变异体；在这两个实例中，主要使用丙氨酸突变减小结合[W002/074783，以引用的方式并入本文中；Stickler同上]。针对对应于一部分IFN的合成肽的抗体的免疫反应性已论述于 Redlich 等人,Proc.Natl.Acad.Sc1.(1991) 88:4040-4044 中。
[0021]已开发数种调节蛋白质免疫原性的方法；优选方法是通过去除MHC结合抗原限制位破坏T-细胞激活。这种方法比避开T-细胞受体或抗体结合易操作，因为MHC分子多样性仅包含约IO3个等位基因，而据估算抗体谱系为约IO8个且T-细胞受体谱系更大。通过在蛋白质序列内鉴别和去除或修饰II类MHC结合肽，可避开免疫原性分子基础。先前已揭示去除所述抗原限制位以产生具有较小免疫原性的蛋白质；参看例如W098/52976和W002/079232,以引用的方式并入本文中。
[0022]虽然可鉴别MHC结合抗原限制位中的大量经预测可减小免疫原性的突变，但大部分这些氨基酸取代将在能量方面不利。结果，使用上述方法鉴别出的绝大多数免疫原性减小的序列将与蛋白质的结构和/或功能不相容。为使去除MHC抗原限制位成为减小免疫原性的可行方法，关键在于同时努力维持蛋白质的结构、稳定性和生物活性。
[0023]免疫原性可以多种方式限制干扰素治疗剂的功效和安全性。治疗功效会直接因形成中和抗体而降低。还可间接降低功效，因为结合中和抗体或非中和抗体可改变血清半衰期。不想要的免疫反应可采用注射部位反应的形式，包括(但不限于)延迟型过敏反应。还有可能抗干扰素β中和抗体会与内源干扰素β交叉反应并阻断其功能。
[0024]仍对免疫原性降低的新颖干扰素蛋白质存在需要。免疫原性降低的干扰素的变异体可在许多干扰素反应性病状的治疗中获得应用。美国专利公开案第2005/0054053号(以引用的方式并入本文中)描述与野生型IFNii相比免疫原性得到调节的变异IFNii蛋白。
[0025] 结果，对开发和发现具有改进性质的干扰素蛋白质存在需要，改进的性质包括(但不限于)增加的功效、减小的副作用、减小的免疫原性、增加的溶解性和增强的可溶性原核生物表达。对需要较低注射频率和/或减小产生中和抗体的风险的干扰素多肽存在需要。改进的干扰素治疗剂可能适用于治疗多种疾病和病状，尤其包括自体免疫疾病、病毒性感染和发炎性疾病、细胞增殖疾病、细菌性感染、增强性生育(enhancing fertility)和癌症以及移植排斥反应。另外，干扰素可用于促进某些哺乳动物怀孕。
[0026]充分确定人类干扰素β (干扰素家族的一个成员)可用于治疗多发性硬化。最近在欧洲和美国已许可两种形式的重组干扰素β用于治疗这种疾病。一种形式是干扰素-β -1a (商标为 AVONEXR 且以这一商标销售，mfg.Biogen, Inc., Cambridge, Mass.,或
商标为REBIF?且以这一商标销售，mfg.Merck Serono)，且在下文中“干扰素-β -la”或
“ IFN- β -la”或各种带连字符和不带连字符形式，其可互换使用。目前销售的AVONEX调配物具有30微克/剂量(200MIU/mg)且提供源自CHO(中国仓鼠卵巢)的IFN-β la，肌肉内给药，每周四次。目前销售的REBIF调配物具有44微克/剂量(270MlU/mg)，皮下给药，TH,且还提供源自CHO的IFN β la。另一种形式是干扰素-β -1b (商标为BETASERONκ且以这一商标销售，Berlex, Richmond, Calif.)，在下文中，称为“干扰素_β -lb”。目前销售的BETASERON调配物具有250微克/剂量(32MlU/mg)且提供源自大肠杆菌的IFN- β lb,皮下给药，每隔一 天一次或每天三次。干扰素β-1a在哺乳动物细胞中使用天然人类基因序列产生且经糖基化，而干扰素β -1b在大肠杆菌中使用在氨基酸位置17处含有基因工程改造的半胱氨酸-丝氨酸取代(C17S)的经修饰人类基因序列产生且未经糖基化。常见副作用包括(但不限于)发烧、头痛、疲劳、焦虑、抑郁、肝病和注射部位反应。Yong等人，Neurology (1998) 51:682-689论述干扰素β在多发性硬化治疗中的用途且指出因MS致残的累积率降低。
[0027]糖基化人类干扰素β的晶体结构已由Karpusas等人于Proc Natl AcadSci 199794:11813-11818中描述。这种蛋白质在单个位点经糖基化(Asn80)。当在大肠杆菌中产生时，蛋白质具有聚集倾向(Mitsui等人，Pharmacol Therl99358:93-132)。Karpusas等人描述在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中产生人类干扰素β和使用蓝色琼脂糖和SP-琼脂糖(离子交换)纯化分泌的蛋白质。
[0028]α干扰素和β干扰素已用于治疗急性病毒性疾病-带状疱疹(Τ.C.Merigan 等人，N.Engl.J.Med.298，98 卜 987 (1978) ；E.Heidemann 等人，0nkologie7, 210-212 (1984))，慢性病毒性感染，例如丙型肝炎和乙型肝炎感染(R.L.Knobler 等人,Neurology34 (10): 1273-9 (1984) ;Μ.A.Faerkkilae 等人,Act.Neurol.Sc1.69，184-185(1985))。
[0029]人类IFN β是分子量为约22kDa的由166个氨基酸残基组成的调控性多肽。其可由大多数细胞(尤其成纤维细胞)在体内应答病毒性感染或暴露于其它因素而产生。其结合多聚细胞表面受体，且产生性受体结合产生一连串细胞内事件，从而促成IFNP诱导性基因表达，基因表达又可产生可分为抗病毒、抗增殖和免疫调节的作用。
[0030]已知人类IFN β 的氛基酸序列(Taniguchi, GenelO: 11-15，1980 和 ΕΡ83069、EP41313和美国专利第4，686，191号，以引用的方式并入本文中)。人类和鼠类IFN^ 晶体结构已描述于 Proc.Natl.Acad.Sc1.USA94:11813-11818，1997 J.Mol.Biol.253:187-207，1995 ;美国专利第 5，602，232 号、第 5，460，956 号、第 5，441，734号、第4，672，108号(以引用的方式并入本文中)中且论述于Cell Mol.LifeSc1.54:1203-1206，1998 中。已报导 IFNβ 的变异体(W095/25170 ；W098/48018 ;美国专利第6，572，853号；美国专利第5，545，723号；美国专利第4，914，033号；EP260350 ;美国专利第4，588，585号；美国专利第4，769，233号；Stewart等人，DNA第6卷第2期1987第 119-128 页；RunkeI 等人，1998，J.Biol.Chem.273，第 14 期，第 8003-8008 页，以引用的方式并入本文中)。美国专利第4，966，843号、美国专利第5，376，567号、美国专利第5，795，779号、美国专利第7，144，574号(以引用的方式并入本文中)描述IFN^于CHO细胞中的表达。已报导具有特定糖基化模式的IFNii分子和其制备方法(EP287075和EP529300)。
[0031]Pharmaceut.Res.15:641-649，1998 中已比较 IFN β Ia 和 IFN β Ib 的结构和功能。已显示多发性硬化的进展被IFNβ延迟。多发性硬化是中枢神经系统的先呈复发性后呈进行性的发炎性退化疾病。IFNii可具有的其它作用可包括(但不限于)对白细胞增殖和抗原呈递的抑制作用、针对抗发炎表型调节细胞激素产生的概况和通过抑制T-细胞基质金属蛋白酶的活性减少T-细胞迁移，以说明IFNP在MS中的机制(Neurol.51:682-689, 1998)。
[0032]IFN^可用于许多疾病的治疗，包括(但不限于)骨肉瘤、基底细胞癌、子宫颈非典型增生、神经胶质瘤、急性骨髓白血病、多发性骨髓瘤、霍奇金氏病(Hodgkin' s disease)、乳癌、黑素瘤和病毒性感染(包括但不限于乳头瘤病毒、病毒性肝炎、生殖器疱疹、带状疱疹、疱疹性角膜炎、单纯疱疹、病毒性脑炎、巨细胞病毒肺炎和鼻病毒)。目前IFNii治疗剂的副作用包括注射 部位反应、发烧、发冷、肌痛、关节痛和其它流感样症状(Clin.Therapeutics, 19:883-893，1997)。
[0033]考虑目前IFNP产品存在大量副作用、与频繁注射相关、产生阻碍IFNP的期望治疗效果的中和抗体的风险和获得更优化的治疗IFNii含量且伴随增强的治疗效果的潜能，需要改进的IFNP样分子。
[0034]已比较干扰素-1a与干扰素-1b在功能测定中的相对活体外效能，且显示干扰素-β -1a的比活性是干扰素_β -1b的比活性的约10倍(Runkel等人，1998，Pharm.Res.15:641-649)。由经设计以鉴别这些活性差异的结构基础的研究，鉴别出糖基化是产品之间影响比活性的唯一一个已知的结构差异。碳水化合物的作用基本上通过其稳定结构的作用体现。碳水化合物的稳定作用在热变性实验和SEC分析中显而易见。缺乏糖基化作用还与聚集增加和对热变性的敏感性增加相关。用PNGase F从干扰素-β-1a酶促去除碳水化合物会引起去糖基化产品广泛沉淀。
[0035]本发明的干扰素分子可保持所有或大部分生物活性且可产生以下性质--促使半衰期增加和组织分布改变的改变的药物动力学和药效学(例如能够较长时间停留在血管中)、增加的于溶液中的稳定性、降低的免疫原性、防止蛋白水解消化和后续的活性废除。所述分子将在医药和医学领域获得实质性发展且将对各种干扰素具有一定效用的疾病(例如多发性硬化、纤维化和其它发炎性或自体免疫疾病、癌症、肝炎和其它病毒性疾病)的控制作出重要贡献。具体来说，能够较长时间逗留在血管中使得干扰素β可用于抑制血管生成并可能穿过血脑屏障。包含非天然编码氨基酸的干扰素β与另一分子(包括但不限于聚合物)之间形成的接合物可调节接合物的热稳定性。当调配干扰素呈粉末形式以用于后续通过吸入投药时，这种调节的热稳定性可能是优点。[0036]与亲水性聚合物聚乙二醇(缩写为PEG)共价连接是对许多生物活性分子(包括蛋白质、肽和尤其疏水性分子)增加水溶性、生物可用性，增加血清半衰期，增加治疗半衰期，调节免疫原性，调节生物活性或延长循环时间的方法。PEG已广泛用于药物、人工植入物，以及生物相容性、无毒性和无免疫原性具有重要性的其它应用中。为最大化PEG的所需性质，连接到生物活性分子上的一种或一种以上PEG聚合物的总分子量和水合状态必须足够高以赋予通常与PEG聚合物连接相关的有利特征(例如增加的水溶性和循环半衰期)，而不会不利地影响母体分子的生物活性。
[0037]PEG衍生物通常通过例如赖氨酸、半胱氨酸和组氨酸残基、N末端以及碳水化合物部分等反应性化学官能团与生物活性分子连接。蛋白质和其它分子通常具有有限数目的可用于聚合物连接的反应性位点。通常，最适于通过聚合物连接来修饰的位点在受体结合中起重要作用，并且对于分子的生物活性保持来说是必需的。因此，聚合物链与生物活性分子上的这些反应性位点的杂乱连接通常导致聚合物修饰的分子的生物活性显著降低或甚至完全丧失。R.Clark等人，(1996).T.Biol.Chem., 271:21969-21977。为形成具有足够聚合物分子量以赋予标靶分子以所需优点的接合物，先前技术方法通常涉及多个聚合物臂与分子的随机连接，从而增大母体分子的生物活性降低或甚至完全丧失的风险。 [0038]形成PEG衍生物与蛋白质的连接点的反应性位点由蛋白质的结构指示。蛋白质(包括酶)由多个α氨基酸序列构成，所述序列具有一般结构H2N--CHR—C00H。一个氨基酸的α氨基部分(H2N-)与相邻氨基酸的羧基部分(一C00H)连接形成酰胺键联，其可表示为一(NH--CHR--CO)n--,其中下标“η”可等于数百或数千。由R表示的片段可含有关于蛋白质生物活性和用于连接PEG衍生物的反应性位点。
[0039]举例来说，在氨基酸赖氨酸的情况下，在ε位以及α位存在一NH2部分。ε -NH2在碱性pH值条件下不反应。用PEG进行蛋白质衍生领域中的许多技术是针对开发用于连接蛋白质中存在的赖氨酸残基的ε--NH2部分的PEG衍生物。“PolyethyleneGlycol and Derivatives for Advanced PEGylation，，，Nektar Molecular EngineeringCatalog, 2003,第1_17页。然而，这些PEG衍生物都具有常见限制:其不能在蛋白质表面上存在的通常众多赖氨酸残基之间进行选择性安装。在赖氨酸残基对于蛋白质活性较为重要(例如存在于酶活性位点中)的情况下或在赖氨酸残基在介导蛋白质与其它生物分子的相互作用中起作用(如在受体结合位点的情况下)的情况下，这可能是一个重要限制。
[0040]蛋白质聚乙二醇化的现有方法的又一个同样重要的复杂情况在于PEG衍生物可能进行与除所需残基以外的残基发生的不需要的副反应。组氨酸含有反应性亚氨基部分(其结构表示为一N(H)--)，但许多与ε -NH2反应的化学反应性物质也可与一N(H)--反应。类似地，氨基酸半胱氨酸的侧链带有自由巯基，其结构表示为-SH。在一些情况下，针对赖氨酸的ε-ΝΗ2基团的PEG衍生物也与半胱氨酸、组氨酸或其它残基反应。这可以产生PEG衍生的生物活性分子的复杂的异质混合物，并且存在破坏所靶向生物活性分子的活性的风险。将需要开发出允许在蛋白质内的单一位点处引入化学官能团的PEG衍生物，其随后将使得一种或一种以上PEG聚合物能够与蛋白质表面上确定以及可预测的特定位点处的生物活性分子选择性偶合。
[0041]除赖氨酸残基之外，所属领域中也已作出相当大的努力来开发靶向其它氨基酸侧链(包括半胱氨酸、组氨酸和N末端)的活化PEG试剂。例如参看以引用的方式并入本文中的美国专利第6，610，281 号，以及“Polyethylene Glycol and Derivatives for AdvancedPEGy I at ion，，, Nektar Molecular Engineering Catalog, 2003,第 1-17 页。可使用定点诱变和所属领域中已知的其它技术将半胱氨酸残基位点选择性地引入蛋白质结构中，并且所得自由巯基部分可与带有硫醇反应性官能团的PEG衍生物反应。然而，这种方法的复杂之处在于引入自由巯基可能使所得蛋白质的表达、折叠和稳定性变得复杂。因此，将需要获得一种将化学官能团引入生物活性分子中的方法，其使得一种或一种以上PEG聚合物能够与蛋白质选择性偶合，同时可与巯基和蛋白质中通常可见的其它化学官能团相容(即，不会发生不需要的副反应)。
[0042]从所属领域中的取样来看，在已开发的用于连接蛋白质侧链(具体来说，赖氨酸氨基酸侧链上的一NH2部分和半胱氨酸侧链上的-SH部分)的这些衍生物中，已证实许多衍生物的合成和使用存在问题。一些衍生物与蛋白质形成不稳定键联，其进行水解并因此分解、降解或以其它方式在水性环境中(例如在血流中)不稳定。一些衍生物形成较稳定的键联，但在形成所述键联之前进行水解，这表示PEG衍生物上的反应性基团可能在可连接蛋白质之前已失活。一些衍生物稍有毒性并且因此不太适于活体内使用。一些衍生物因反应过慢而不能实际使用。一些衍生物因与负责蛋白质活性的位点连接而导致蛋白质活性丧失。一些衍生物在其将连接的位点中不具特异性，这也可能导致所需活性丧失并缺乏结果的再现性。为克服与用聚乙二醇部分修饰蛋白质相关的挑战，已开发出更稳定(例如，美国专利6，602，498，其以引用的方式并入本文中)或与分子和表面上的硫醇部分选择性反应(例如，美国专利6，610，281，其以引用的方式并入本文中)的PEG衍生物。所属领域中无疑需要在要求选择性反应形成稳定化学键之前在生理环境中呈化学惰性的PEG衍生物。
[0043]近年来，已报导蛋白质科学中的全新技术，其有希望克服众多与蛋白质的位点特异性修饰相关的限制。具体来说，已将新的组分添加到原核生物大肠杆菌(Escherichia coli ； Sacchromyces cerevisiae ；S.cerevisiae)(例如，J.Chin 等A,Science301:964-7 (2003))的蛋白质生物合成机制中，其使得能够在活体内将非遗传编码氨基酸并入蛋白质中。使用此方法，已回应琥珀密码子TAG而将具有新颖化学、物理或生物性质的许多新颖氨基酸(包括光亲和性标记和可光致异构化氨基酸、光交联氨基酸(例如参看 Chin, J.W.等人，(2002)Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.99:11020-11024 ;和Chin, J.W.等人，(2002) T.Am.Chem.Soc.124:9026-9027)、酮某氡某酸、含重原子氡某酸和糖基化氨基酸)有效且高保真地并入大肠杆菌以及酵母中的蛋白质中。例如参看J.W.Chin等人,(2002), Tournal of the American Chemical Societyl24:9026-9027 ；J.ff.Chin和 P.G.Schultz, (2002).ChemBioChem3(11):1135-1137 ；J.ff.Chin 等人，(2002).PNASUnited States of America99:11020-11024 ；以及 L.Wang 和 P.G.Schultz, (2002), Chem.Comm.,1:1-11。所有参考文献都是以全文引用的方式并入本文中。这些研究已证实有可能选择性地并且常规地引入蛋白质中不存在的化学官能团(例如酮基、炔基和叠氮部分)，所述官能团对20种常见的遗传编码氨基酸中存在的所有官能团都呈化学惰性并且可用于有效并选择性地反应形成稳定共价键联。
[0044]在蛋白质中并入非遗传编码氨基酸的能力允许引入可能提供天然存在的官能团(例如赖氨酸的ε-NH2、半胱氨酸的巯基-SH、组氨酸的亚氨基等)的有价值替代的化学官能团。已知某些化学官能团对20种常见的遗传编码氨基酸中存在的官能团呈惰性，但完全并有效地反应形成稳定键联。举例来说，所属领域中已知叠氮基和乙炔基在催化量的铜存在下在水性条件下进行休斯根(Huisgen) [3+2]环加成反应。例如参看Tornoe等人，(2002) T.0rg.Chem.67:3057-3064 ；和 Rostovtsev 等人，(2002) Angew.Chem.1nt.Ed.41:2596-25990举例来说，通过在蛋白质结构中引入叠氮部分，能够并入对蛋白质中存在的胺、巯基、羧酸、羟基呈化学惰性，但也与乙炔部分平稳并有效地反应形成环加成产物的官能团。重要的是，在不存在乙炔部分的情况下，叠氮化物在其它蛋白质侧链存在下在生理条件下仍保持化学惰性并且不反应。
[0045]本发明尤其涉及与IFN0多肽的活性和制备相关的问题，并且也涉及具有改良的生物或药理学性质(例如增强的抗病毒活性和/或改良的治疗半衰期)的IFNii多肽的制备。
【发明内容】
[0046]本发明提供包含一个或一个以上非天然编码氨基酸的IFNP多肽。
[0047]在一些实施例中，IFNP多肽包含一个或一个以上翻译后修饰。在一些实施例中，IFN^多肽是与连接子、聚合物或生物活性分子连接。在一些实施例中，IFNii多肽与双官能聚合物、双官能连接子或至少一个其它IFNii多肽连接。在一些实施例中，IFNii多肽包含IFNii的C17S突变体 形式的一个或一个以上翻译后修饰。
[0048]在一些实施例中，非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚乙二醇部分。在一些实施例中，非天然编码氨基酸是利用连接子与水溶性聚合物连接或与水溶性聚合物键结。在一些实施例中，聚乙二醇分子是双官能聚合物。在一些实施例中，双官能聚合物与第二多肽连接。在一些实施例中，第二多肽是IFNii多肽。本发明还包括外加在IFNii中发生C17S突变的各上述实施例。
[0049]在一些实施例中，IFNβ多肽包含至少两个与包含聚乙二醇部分的水溶性聚合物连接的氨基酸。在一些实施例中，至少一个氨基酸是非天然编码氨基酸。在一些实施例中，包含至少两个与包含聚乙二醇部分的水溶性聚合物连接的氨基酸的IFN0多肽包括C17S突变，在其它实施例中，在IFN β多肽中，除一个或一个以上非天然编码氨基酸外，还包括位置17处的任何突变。
[0050]在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸并入IFNP的一个或一个以上以下位置中:位置 I (即，在 N 末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167(即，在蛋白质的羧基末端)和其任何组合(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO: 3、4中的相应氨基酸)。在一些实施例中，这些并入中的一个发生在位置17处。[0051]在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸并入对应于干扰素β中的如下二级结构的一个或一个以上以下区中的任何位置:SEQ ID Ν0:1的螺旋Α(2-22)、螺旋 B (51-71)、螺旋 C (80-107)、螺旋 D (118-136)、螺旋 E (139-162)、AB 环=ABl (23-35)、ΑΒ2 (36-40)、ΑΒ3 (41-50)或在SEQ ID NO: 3、4中的相应氨基酸。在其它实施例中，非天然编码氨基酸在选自由干扰素β的残基25-35、80-100和121-135 (SEQ ID Ν0:1或在SEQ IDΝ0:3、4中的相应氨基酸)组成的群组的位置处经取代。在其它实施例中，非天然编码氨基酸在选自由SEQ ID Ν0:1的干扰素β的残基41-49或在SEQ ID NO: 3、4中的相应氨基酸组成的群组的位置处经取代。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸并入IFN3的一个或一个以上以下位置处:28、36、76、80、107、108、111、8、15、19、36、42、46、48、49、80、108、111、113、155和其任何组合(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO: 3、4中的相应氨基酸)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸并入IFNii的一个或一个以上以下位置处:SEQ ID Ν0:1 的 28、36、76、80、107、108、111 和其任何组合或在 SEQ ID Ν0:3、4 中的相应氨基酸。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸并入IFN3的一个或一个以上以下位置处:SEQ ID NO:1 的 8、15、19、36、42、46、48、49、80、108、111、113、155 和其任何组合或在SEQ ID N0:3、4中的相应氨基酸。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸并入IFNP的一个或一个以上以下位置处:SEQ ID NO:1的15、42、80、108、111、155和其任何组合或在SEQ ID N0:3、4中的相应氨基酸)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸并入IFNβ的一个或一个以上以下位置处:SEQ ID NO:1的36、111或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸)。在一些实施例中，本发明的多肽包含一个或一个以上天然氨基酸取代、添加或缺失。在一些实施例中，本发明的多肽包含SEQ ID N0:1的C17S取代(在位置17处用丝氨酸取代半胱氨酸)或在SEQ ID N0:3、4中的相应氨基酸。在一些实施例中，本发明的多肽包含C17S取代(在位置17处用丝氨酸取代半胱氨酸)和一个或一个以上天然氨基酸取代、添加或缺失。在一些实施例中，本发明的多肽在信号序列中包含一个或一个以上非天然编码氨基酸取代、添加或缺失。在一些实施例中，本发明的多肽在SEQ ID N0:4的信号序列中包含一个或一个以上非天然编码氨基酸取代、添加或缺失。在一些实施例中，本发明的多肽在SEQ ID N0:4的信号序列中包含一个或一个以上天然编码氨基酸取代、添加或缺失。在一些实施例中，一个或一个以上非天然氨基酸并入SEQ ID N0:4的前导序列或信号序列或其它IFNii序列中。本发明还包括外加IFNii中发生C17S突变的各以上实施例。
[0052] 在一些实施例中，一个或一个以上以下位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接，包括(但不限于)以下位置:位置1(即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、I46、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167(即，在蛋白质的羧基末端)和其任何组合(SEQ ID N0:1或在SEQ ID N0:3、4中的相应氨基酸或在另一个IFNii序列中的相应氨基酸)。
[0053]在一些实施例中，一个或一个以上以下区中的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接，包括(但不限于):SEQ ID N0:1的螺旋A(2-22)、螺旋B(51-71)、螺旋C(80-107)、螺旋 D (118-136)、螺旋 E (139-162)、AB 环:AB1 (23-35)、AB2 (36-40)、AB3 (41-50)或在 SEQ IDN0:3、4中的相应氨基酸。在其它实施例中，一个或一个以上以下区中的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接，包括(但不限于):干扰素β的残基25-35、80-100和121-135 (SEQID Ν0:1或在SEQ ID NO: 3、4中的相应氨基酸)。在其它实施例中，一个或一个以上以下区中的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接，包括(但不限于):SEQ ID N0:1的干扰素β的残基41-49或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸。在一些实施例中，一个或一个以上以下位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接，包括(但不限于)位置:28、36、76、80、107、108、111、8、15、19、36、42、46、48、49、80、108、111、113、155和其任何组合(SEQ ID NO:1或在SEQ ID Ν0:3、4中的相应氨基酸)。在一些实施例中，一个或一个以上以下位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接，包括(但不限于)位置:SEQ ID NO:1的28、36、76、80、107、108、111和其任何组合或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸。在一些实施例中，一个或一个以上以下位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接，包括(但不限于)位置:SEQ ID Ν0:1 的 8、15、19、36、42、46、48、49、80、108、111、113、155 和其任何组合或在 SEQID Ν0:3、4中的相应氨基酸)。在一些实施例中，一个或一个以上以下位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接，包括(但不限于)位置:SEQ ID NO:1的15、42、80、108、111、155和其任何组合或在SEQ ID N0:3、4中的相应氨基酸。在一些实施例中，一个或一个以上以下位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接，包括(但不限于)位置:SEQ IDNO:1的36、111或在SEQ ID NO: 3、4中的相应氨基酸)。在一些实施例中，信号序列或前导序列中的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接(SEQ ID N0:4或其它IFNii序列)。本发明还包括外加IFNii中发生C17S突变的各以上实施例。
[0054]在一些实施例 中，IFNP多肽包含调节IFNP多肽对IFN多肽受体或结合搭配物(包括(但不限于)蛋白质、多肽、小分子或核酸)的亲和性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，IFN0多肽包含与不具有取代、添加或缺失的相应IFNii的稳定性相比增加IFN3多肽的稳定性的取代、添加或缺失。稳定性和/或溶解性可使用所属领域的技术人员已知的许多不同测定测量。这些测定包括(但不限于)SE-HPLC和RP-HPLC。在一些实施例中，IFN^多肽包含与不具有取代、添加或缺失的相应IFNii的免疫原性相比调节IFNii多肽的免疫原性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，IFNP多肽包含与不具有取代、添加或缺失的相应IFNii的血清半衰期或循环时间相比调节IFNii多肽的血清半衰期或循环时间的取代、添加或缺失。
[0055]在一些实施例中，IFN0多肽包含与不具有取代、添加或缺失的相应IFNβ的水溶性相比增加IFNP多肽的水溶性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，IFNP多肽包含与不具有取代、添加或缺失的相应IFNii的溶解性相比增加宿主细胞中产生的IFNii多肽的溶解性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，IFN β多肽包含与不具有取代、添加或缺失的相应IFNii的表达或合成相比增加IFNii多肽在宿主细胞中的表达或增加活体外合成的取代、添加或缺失。包含这种取代的IFNii多肽保持激动剂活性并且保持或提高在宿主细胞中的表达水平。在一些实施例中，IFNii多肽包含与不具有取代、添加或缺失的相应IFN3的蛋白酶抗性相比增加IFNP多肽的蛋白酶抗性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，IFN^多肽包含与在与不具有取代、添加或缺失的相应IFNii多肽相互作用后受体的活性相比调节IFN受体的信号转导活性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，IFNii多肽包含与不具有取代、添加或缺失的相应IFNii多肽的结合相比调节其与另一分子(例如受体)的结合的取代、添加或缺失。在一些实施例中，IFNβ多肽包含与不具有取代、添加或缺失的相应IFNii多肽的抗病毒活性相比调节其抗病毒活性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，IFNii多肽包含与不具有取代、添加或缺失的相应IFNii多肽的抗病毒活性相比增强其抗病毒活性的取代、添加或缺失。
[0056]在一些实施例中，IFN0多肽包含与不具有取代、添加或缺失的相应IFNβ的相容性相比增加IFNii多肽与医药防腐剂(例如，间甲酚、苯酚、苄醇)的相容性的取代、添加或缺失。这一增加的相容性将使得能够制备贮存期间保持蛋白质的生理化学性质和生物活性的防腐医药调配物。
[0057]在一些实施例中，一个或一个以上工程改造过的键是由一个或一个以上非天然氨基酸产生。分子内的键可以多种方式产生，包括(但不限于)蛋白质中两个氨基酸(一个或两个氨基酸可能为非天然氨基酸)在合适条件下反应；两个氨基酸(其各自可能经天然编码或非天然编码)与连 子、聚合物或其它分子在合适条件下反应等。
[0058]在一些实施例中，IFNP多肽中的一个或一个以上氨基酸可经一个或一个以上天然存在或非天然存在氨基酸取代。在一些实施例中，IFNβ多肽中的氨基酸可经天然存在或非天然存在氨基酸取代，条件是至少一个经非天然编码氨基酸取代。在一些实施例中，IFN β多肽中的一个或一个以上氨基酸可经一个或一个以上天然存在氨基酸取代，并且另外至少一个经非天然编码氨基酸取代。
[0059]在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含羰基、乙酰基、氨氧基、肼基、酰肼基、氨基脲基(semicarbazide group)、叠氮基或炔基。
[0060]在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含羰基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸具有以下结构:
[0061]
【权利要求】
1.一种IFNii多肽，其包含一个或一个以上非天然编码氨基酸。
2.根据权利要求1所述的IFNP多肽，其中所述IFNP多肽包含一个或一个以上翻译后修饰。
3.根据权利要求1所述的IFNii多肽，其中所述多肽是与连接子、聚合物或生物活性分子连接。
4.根据权利要求3所述的IFNii多肽，其中所述多肽是与水溶性聚合物连接。
5.根据权利要求1所述的IFNii多肽，其中所述多肽是与双官能聚合物、双官能连接子或至少一个其它IFNii多肽连接。
6.根据权利要求5所述的IFNii多肽，其中所述双官能连接子或聚合物是与第二多肽连接。
7.根据权利要求6所述的IFNii多肽，其中所述第二多肽是IFNii多肽。
8.根据权利要求4所述的IFNii多肽，其中所述水溶性聚合物包含聚乙二醇部分。
9.根据权利要求4所述的IFNii多肽，其中所述水溶性聚合物是与所述IFNii多肽中存在的非天然编码氨基酸连接。
10.根据权利要求1所述的IFNii多肽，其中所述非天然编码氨基酸是在选自由以下残基组成的群组的位置处经取代:位置I (即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、I10、I11、I12、I13、I14、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167 (B卩，在所述蛋白质的羧基末端)和其任何组合(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸)。
11.根据权利要求10所述的IFNii多肽，其中所述非天然编码氨基酸是在选自由残基28、36、76、80、107、108、111、8、15、19、36、42、46、48、49、80、108、111、113、155 和其任何组合(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO: 3、4中的相应氨基酸)组成的群组的位置处经取代。
12.根据权利要求10所述的IFNii多肽，其中所述非天然编码氨基酸是在选自由残基28、36、76、80、107、108、111 和其任何组合(SEQ ID NO:1 或在 SEQ ID NO:3、4 中的相应氨基酸)组成的群组的位置处经取代。
13.根据权利要求10所述的IFNii多肽，其中所述非天然编码氨基酸是在选自由残基8、15、19、36、42、46、48、49、80、108、111、113、155 和其任何组合(SEQ ID ΝΟ:1 或在 SEQ IDNO:3、4中的相应氨基酸)组成的群组的位置处经取代。
14.根据权利要求10所述的IFNii多肽，其中所述非天然编码氨基酸是在选自由残基15、42、80、108、111、155和其任何组合(SEQ ID ΝΟ:1或在SEQ ID NO: 3、4中的相应氨基酸)组成的群组的位置处经取代。
15.根据权利要求1所述的IFNii多肽，其中所述非天然编码氨基酸是在选自由SEQIDN0:4的前导序列或信号序列中的残基组成的群组的位置处经取代。
16.根据权利要求4所述的IFNii多肽，其中所述非天然编码氨基酸是在选自由以下残基组成的群组的位置处经取代:位置I (即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、 147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167( 即，在所述蛋白质的羧基末端)和其任何组合(SEQ ID ΝΟ:1或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸)。
17.根据权利要求16所述的IFNii多肽，其中所述非天然编码氨基酸是在选自由残基28、36、76、80、107、108、111、8、15、19、36、42、46、48、49、80、108、111、113、155 和其任何组合(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO: 3、4中的相应氨基酸)组成的群组的位置处经取代。
18.根据权利要求16所述的IFNii多肽，其中所述非天然编码氨基酸是在选自由残基28、36、76、80、107、108、111 和其任何组合(SEQ ID NO:1 或在 SEQ ID NO:3、4 中的相应氨基酸)组成的群组的位置处经取代。
19.根据权利要求16所述的IFNii多肽，其中所述非天然编码氨基酸是在选自由残基8、15、19、36、42、46、48、49、80、108、111、113、155 和其任何组合(SEQ ID ΝΟ:1 或在 SEQ IDNO:3、4中的相应氨基酸)组成的群组的位置处经取代。
20.根据权利要求16所述的IFNii多肽，其中所述非天然编码氨基酸是在选自由残基15、42、80、108、111、155和其任何组合(SEQ ID ΝΟ:1或在SEQ ID NO: 3、4中的相应氨基酸)组成的群组的位置处经取代。
21.根据权利要求4所述的IFNii多肽，其中所述非天然编码氨基酸是在选自由SEQIDN0:4的前导序列或信号序列中的残基组成的群组的位置处经取代。
22.根据权利要求1所述的IFNii多肽，其中所述IFNii多肽包含一个或一个以上调节所述IFNii多肽对IFN受体的亲和性的氨基酸取代、添加或缺失。
23.根据权利要求1所述的IFNii多肽，其中所述IFNii多肽包含一个或一个以上增加所述IFNβ多肽的稳定性或溶解性的氨基酸取代、添加或缺失。
24.根据权利要求1所述的IFNii多肽，其中所述IFNi3A多肽包含一个或一个以上增加所述IFNii多肽在重组宿主细胞中的表达或所述IFNii多肽的活体外合成的氨基酸取代、添加或缺失。
25.根据权利要求1所述的IFNii多肽，其中所述IFNii多肽包含一个或一个以上增加所述IFNP多肽的蛋白酶抗性的氨基酸取代、添加或缺失。
26.根据权利要求1所述的IFNii多肽，其中所述非天然编码氨基酸可与不与所述多肽中的20种常见氨基酸中的任一种反应的连接子、聚合物或生物活性分子反应。
27.根据权利要求1所述的IFNii多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、餅基、酸餅基、氣基服基、置氣基或炔基。
28.根据权利要求27所述的IFNii多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基。
29.根据权利要求28所述的IFNβ多肽，其中所述非天然编码氨基酸具有以下结构:
30.根据权利要求27所述的IFNii多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含氨氧基。
31.根据权利要求27所述的IFNii多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含酰肼基。
32.根据权利要求27所述的IFNii多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含肼基。
33.根据权利要求27所述的IFNii多肽，其中所述非天然编码氨基酸残基包含氨基脲基。
34.根据权利要求27所述的IFNii多肽，其中所述非天然编码氨基酸残基包含叠氮基。
35.根据权利要求34所述的IFNii多肽，其中所述非天然编码氨基酸具有以下结构:
36.根据权利要求27所述的IFNii多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含炔基。
37.根据权利要求36所述的IFNii多肽，其中所述非天然编码氨基酸具有以下结构:
38.根据权利要求4所述的IFNii多肽，其中所述水溶性聚合物具有介于约0.1kDa与约IOOkDa之间的分子量。
39.根据权利要求38所述的IFNii多肽，其中所述水溶性聚合物具有介于约0.1kDa与约50kDa之间的分子量。
40.根据权利要求4所述的IFNii多肽，其是通过使包含含羰基的氨基酸的IFNii多肽与包含氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基的水溶性聚合物反应来制备。
41.根据权利要求40所述的IFNii多肽，其中所述氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基是通过酰胺键联与所述水溶性聚合物连接。
42.根据权利要求4所述的IFNii多肽，其是通过使包含羰基的水溶性聚合物与包含包括氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基的非天然编码氨基酸的多肽反应来制备。
43.根据权利要求4所述的IFNii多肽，其是通过使包含含炔的氨基酸的IFNii多肽与包含叠氮部分的水溶性聚合物反应来制备。
44.根据权利要求4所述的IFNβ多肽，其是通过使包含含叠氮基的氨基酸的IFN3多肽与包含炔部分的水溶性聚合物反应来制备。
45.根据权利要求27所述的IFNii多肽，其中所述叠氮基或炔基是通过酰胺键联与水溶性聚合物连接。
46.根据权利要求4所述的IFNii多肽，其中所述水溶性聚合物是分枝或多臂聚合物。
47.根据权利要求46所述的IFNii多肽，其中所述水溶性聚合物的各支链具有介于约IkDa与约IOOkDa之间的分子量。
48.根据权利要求1所述的IFNii多肽，其中所述多肽为IFNii拮抗剂。
49.根据权利要求48所述的IFNii多肽，其中所述多肽包含一个或一个以上翻译后修饰、连接子、聚合物或生物活性分子。
50.根据权利要求49所述的IFNii多肽，其中所述聚合物包含选自由水溶性聚合物和聚乙二醇组成的群组的 部分。
51.根据权利要求48所述的IFNii多肽，其中所述多肽阻止IFN受体的活化。
52.根据权利要求1所述的IFNii多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含糖部分。
53.根据权利要求3所述的IFNii多肽，其中所述连接子、聚合物或生物活性分子是通过糖部分与所述多肽连接。
54.一种分离核酸，其包含在严格条件下与SEQ ID ΝΟ:2或编码SEQ ID ΝΟ:3或4的多核苷酸序列杂交的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含至少一个选择密码子。
55.根据权利要求54所述的分离核酸，其中所述选择密码子是选自由琥珀密码子、赭石密码子、蛋白石密码子、独特密码子、稀有密码子和四碱基密码子组成的群组。
56.一种制备根据权利要求3所述的IFNii多肽的方法，所述方法包含使包含非天然编码氨基酸的分离IFNii多肽与包含与所述非天然编码氨基酸反应的部分的连接子、聚合物或生物活性分子接触。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述聚合物包含选自由水溶性聚合物和聚乙二醇组成的群组的部分。
58.根据权利要求56所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、酰肼基、餅基、氣基服基、置氣基或炔基。
59.根据权利要求56所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基部分，并且所述连接子、聚合物或生物活性分子包含氨氧基、肼、酰肼或氨基脲部分。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述氨氧基、肼、酰肼或氨基脲部分是通过酰胺键联与所述连接子、聚合物或生物活性分子连接。
61.根据权利要求56所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸包含炔部分，并且所述连接子、聚合物或生物活性分子包含叠氮部分。
62.根据权利要求56所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸包含叠氮部分，并且所述连接子、聚合物或生物活性分子包含炔部分。
63.根据权利要求58所述的方法，其中所述叠氮部分或炔部分是通过酰胺键联与连接子、聚合物或生物活性分子连接。
64.根据权利要求57所述的方法，其中所述聚乙二醇部分具有介于约0.1kDa与约IOOkDa之间的平均分子量。
65.根据权利要求57所述的方法，其中所述聚乙二醇部分是分枝或多臂聚合物。
66.一种组合物，其包含根据权利要求1所述的IFNii多肽和医药学上可接受的载剂。
67.根据权利要求66所述的组合物，其中所述非天然编码氨基酸是与水溶性聚合物连接。
68.—种细胞，其包含根据权利要求54所述的核酸。
69.根据权利要求68所述的细胞，其中所述细胞包含正交tRNA合成酶或正交tRNA。
70.一种制备包含非天然编码氨基酸的IFNii多肽的方法，所述方法包含在允许所述包含非天然编码氨基酸的IFNii多肽表达的条件下培养包含一种或一种以上包含选择密码子的编码IFNii多肽的多核苷酸、正交RNA合成酶和正交tRNA的细胞；以及纯化所述IFNβ多肽。
71.一种调节IFNii多肽的血清半衰期或循环时间的方法，所述方法包含用一个或一个以上非天然编码氨基酸取代所述IFNii多肽中的任何一个或一个以上天然存在氨基酸。
72.一种由具有SEQ ID NO: 2中所示的序列或编码SEQ ID NO: 3或4所示的多肽的多核苷酸编码的IFNii多 肽，其中所述多核苷酸包含选择密码子，并且其中所述多肽包含至少一个非天然编码氨基酸。
73.根据权利要求72所述的IFNii多肽，其中所述非天然编码氨基酸是与连接子、聚合物、水溶性聚合物或生物活性分子连接。
74.根据权利要求73所述的IFNii多肽，其中所述水溶性聚合物包含聚乙二醇部分。
75.根据权利要求72所述的IFNii多肽，其中所述非天然编码氨基酸是在选自由以下残基组成的群组的位置处经取代:位置I (即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、I10、I11、I12、I13、I14、I15、I16、I17、I18、I19、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167 (B卩，在所述蛋白质的羧基末端)和其任何组合(SEQ ID NO:1或在SEQ ID ΝΟ:3、4中的相应氨基酸)。
76.根据权利要求75所述的IFNii多肽，其中所述非天然编码氨基酸是在选自由残基28、36、76、80、107、108、111、8、15、19、36、42、46、48、49、80、108、111、113、155 和其任何组合(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO: 3、4中的相应氨基酸)组成的群组的位置处经取代。
77.根据权利要求75所述的IFNii多肽，其中所述非天然编码氨基酸是在选自由残基28、36、76、80、107、108、111 和其任何组合(SEQ ID NO:1 或在 SEQ ID ΝΟ:3、4 中的相应氨基酸)组成的群组的位置处经取代。
78.根据权利要求75所述的IFNii多肽，其中所述非天然编码氨基酸是在选自由残基8、15、19、36、42、46、48、49、80、108、111、113、155 和其任何组合(SEQ ID ΝΟ:1 或在 SEQ IDΝΟ:3、4中的相应氨基酸)组成的群组的位置处经取代。
79.根据权利要求75所述的IFNii多肽，其中所述非天然编码氨基酸是在选自由残基.15、42、80、108、111、155和其任何组合(SEQ ID N0:1或在SEQ ID NO: 3、4中的相应氨基酸)组成的群组的位置处经取代。
80.根据权利要求72所述的IFNii多肽，其中所述非天然编码氨基酸是在选自由SEQIDN0:4的前导序列或信号序列中的残基组成的群组的位置处经取代。
81.根据权利要求72所述的IFNii多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、酸餅基、餅基、氣基服基、置氣基或炔基。
82.根据权利要求74所述的IFNii多肽，其中所述聚乙二醇部分具有介于约0.1kDa与约1OOkDa之间的分子量。
83.根据权利要求74所述的IFNii多肽，其中所述聚乙二醇部分是分枝或多臂聚合物。
84.根据权利要求83所述的IFNii多肽，其中所述聚乙二醇部分具有介于约IkDa与约IOOkDa之间的分子量。
85.—种组合物，其包含根据权利要求72所述的IFNii多肽和医药学上可接受的载剂。
86.一种IFNii多肽，其包含一个或一个以上增加所述IFNii多肽在重组宿主细胞中的表达的氨基酸取代、添加或缺失。
87.一种IFNii多肽，其包含通过共价键与所述IFNii多肽在单一氨基酸处连接的水溶性聚合物。
88.根据权利要求87所述的IFNii多肽，其中所述水溶性聚合物包含聚乙二醇部分。
89.根据权利要求87所述的IFNii多肽，其中所述与所述水溶性聚合物共价连接的氨基酸是非天然编码氨基酸。
90.根据权利要求10所述的IFNii多肽，其中所述非天然编码氨基酸是与聚乙二醇分子连接。
91.一种IFNii多肽，其包含至少一个连接子、聚合物或生物活性分子，其中所述连接子、聚合物或生物活性分子是通过经核糖体并入所述多肽中的非天然编码氨基酸的官能团与所述多肽连接。
92.根据权利要求91所述的IFNii多肽，其中所述IFNii多肽是经单聚乙二醇化。
93.一种IFNii多肽，其包含与一个或一个以上非天然编码氨基酸连接的连接子、聚合物或生物活性分子，其中所述非天然编码氨基酸是经核糖体并入所述多肽中的预选位点处。
94.根据权利要求93所述的IFNii多肽，其中所述IFNii多肽包含一个所述连接子、聚合物或生物活性分子。
95.根据权利要求1所述的IFNii多肽，其中所述IFNii多肽包含一个或一个以上调节所述IFNβ多肽的免疫原性的氨基酸取代、添加或缺失。
96.根据权利要求1所述的IFNii多肽，其中所述IFNii多肽包含一个或一个以上调节所述IFNP多肽的血清半衰期或循环时间的氨基酸取代、添加或缺失。
97.一种调节IFNii多肽的免疫原性的方法，所述方法包含用一个或一个以上非天然编码氨基酸取代所述IFNii多肽中的任何一个或一个以上天然存在氨基酸。
98.根据权利要求1或4所述的IFNii多肽，其中所述多肽还包含天然编码氨基酸取代。
99.根据权利要求1或4所述的IFNii多肽，其中所述非天然编码氨基酸是在选自由残基36和Fill和其任何组合(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸)组成的群组的位置处经取代。
100. 根据权利要求1或4所述的IFN多肽，其中所述多肽还包含C17S天然氨基酸取代(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO: 3、4中的相应氨基酸)。
101.根据权利要求1所述的IFNii多肽，其中所述IFNii多肽包含一个或一个以上增强所述IFNβ多肽的抗病毒活性的氨基酸取代、添加或缺失。
102.根据权利要求4所述的IFNii多肽，其中所述水溶性聚合物是通过肟键与所述多肽连接。
【文档编号】C12P21/02GK103965347SQ201410202276
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2008年4月30日 优先权日:2007年5月2日
【发明者】瓦迪姆·克赖诺夫, 尼克·克努森, 安娜玛莉亚·A.·海斯·蒲楠, 丹尼斯·克拉维兹, 杰森·品克史塔夫, 希瑟·马拉 申请人:Ambrx公司