带gfp标记pnc的高转移性肝癌细胞株及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物【技术领域】，涉及带GFP标记PNC的高转移性肝癌细胞株及其构建方法和应用，及基于肿瘤侵袭性新靶标PNC的抗转移中药单体的筛选模型及其应用。带GFP标记PNC的高转移性肝癌细胞株，通过GFP-PTB融合蛋白表达质粒转染高转移性肝癌细胞株构建。本发明的优点在于：带GFP标记PNC的高转移性肝癌细胞模型无需其他体外标记和特殊试剂及耗材，可直接用于抗转移中药单体筛选，筛选步骤简便，方法快捷，费用低，且易于操作，稳定性好。
【专利说明】带GFP标记PNC的高转移性肝癌细胞株及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及带GFP标记PNC的高转移性肝癌细胞株及其构建方法和应用，及基于肿瘤侵袭性新靶标PNC的抗转移中药单体的筛选模型及其应用。
【背景技术】
[0002]我国肝癌发病率居全球首位，肝癌病死率一直居高不下。针对早期局灶性肝癌，临床上一般采取手术结合放化疗的治疗方法。但是常规化疗药物，例如阿霉素、柔红霉素、丝裂霉素、氟脲嘧啶脱氧核苷酸等，在杀伤肿瘤细胞的同时，也对机体正常细胞造成严重伤害，具有明显毒副作用。特别是肝癌晚期患者，化疗的毒副作用会对病人本来虚弱的身体造成更大的伤害。另外，肝癌晚期常发现血行或淋巴转移，导致癌细胞扩散，而目前尚无明确有效的抗转移药物。因此探索肿瘤治疗的新靶点，并开发毒副作用较低的化疗新药，对于提高肿瘤治疗的靶向性以及减少肿瘤化疗的副反应具有重要意义。
[0003]侵袭性(浸润-转移)作为恶性肿瘤的重要标志之一，是导致癌症患者死亡的主要原因。而抗癌新药，尤其是抗转移药物长期处于市场需求“饥渴状态”。近来研究发现，PNC (perinucleolar compartment)是一个与肿瘤侵袭性密切相关的细胞核亚结构,其主要由MRP等非编码RNA和PTB、CUG-BP1等RNA结合蛋白所组成。由于肿瘤细胞核中PNC比例与其侵袭性呈正相关，并且与患者预后密切相关。因此以PNC为探针，建立具有抗肿瘤转移作用的抗癌新药的筛选模型具有潜在优势。
[0004]我国传统的中 药，例如灵芝、当归、黄芪、三七等，因其抗肿瘤效应、放化疗增敏作用以及在减轻放化疗毒副方面独具效果而越来越受到人们的重视。但中药作为一个复杂组分其具体的作用机制尚不明确，目前，随着对中药提取物，尤其是中药单体的抗肿瘤机制研究的不断深入，中药单体在肿瘤治疗中的前景日益受到关注。已有研究显示中药单体在肝癌治疗中的作用，但面对庞大的中药单体库，如何简便高效地选择出具有降低肝癌侵袭性潜能的中药单体，又是一个亟待解决的重要问题，对于药物的选择性开发至关重要。因此基于新型肿瘤转移分子标记物PNC的高转移性肝癌细胞模型的建立，对于从传统中药中发掘具有抗肝癌转移作用的中药单体，或以此为先导化合物的结构修饰型药物的开发具有重要意义。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是通过建立基于新型肿瘤转移分子标记物PNC的药物体外筛选模型，为抗肿瘤转移作用的中药单体的选择性开发提供技术平台。
[0006]首先，本发明提供了一种带GFP标记PNC的高转移性肝癌细胞株及其构建方法。
[0007]带GFP标记PNC的高转移性肝癌细胞株，通过GFP-PTB融合蛋白表达质粒转染高转移性肝癌细胞株构建。
[0008]带GFP标记PNC的高转移性肝癌细胞株的构建方法:包括如下步骤:
[0009]I)通过肿瘤细胞株体外培养获得高转移性的肝癌细胞株H印G2M ；[0010]2)构建带GFP标记的PTB表达质粒GFP-PTB:通过高保真DNA聚合酶以PCR法扩增人PTB cDNA序列，扩增后的片断在HindIII和BamHl位点处插入GFP表达质粒pEGFP-Cl，获得带GFP标记的PTB融合蛋白表达质粒；
[0011]3)步骤2)的GFP-PTB融合蛋白表达质粒转染步骤I)的高转移性的肝癌细胞株，得到带GFP标记PNC的高转移性肝癌细胞株，并通过G418筛选获得稳转细胞株!fepG2M-GFP-PTB。
[0012]进一步的，所述在步骤I)为通过肿瘤细胞株原位接种-分离淋巴结转移灶-体外培养得到转移性肿瘤细胞株-再次原位接种，重复5次，获得高转移性的肝癌细胞株HepG2M0
[0013]另外，本发明还提供了带GFP标记PNC的高转移性肝癌细胞株的应用。 [0014]带GFP标记PNC的高转移性肝癌细胞株用于制备肝癌诊断试剂。
[0015]带GFP标记PNC的高转移性肝癌细胞株用于制备肝癌药物筛选模型。
[0016]本发明还提供了一种抗转移中药单体的筛选模型及其构建和使用方法。
[0017]基于PNC的抗转移中药单体的筛选模型，所述筛选模型采用带GFP标记PNC的高转移性肝癌细胞株，通过中药单体对带GFP标记PNC的高转移性肝癌细胞株的PNC抑制率进行筛选。
[0018]基于PNC的抗转移中药单体的筛选模型的构建方法，包括如下步骤:
[0019]I)通过肿瘤细胞株原位接种-分离淋巴结转移灶-体外培养得到转移性肿瘤细胞株-再次原位接种，如此重复5次，获得高转移性的肝癌细胞株H印G2M ；
[0020]2)通过PTB抗体的免疫荧光实验，检测上述高转移肝癌细胞株中的PNC比例，3株细胞的PNC比例均在95%以上；
[0021]3)带GFP标记的PTB表达质粒(GFP-PTB)的构建:通过高保真DNA聚合酶以PCR法扩增人PTB cDNA序列，扩增后的片断在HindIII和BamHl位点处插入GFP表达质粒pEGFP-Cl，即得到带GFP标记的PTB融合蛋白表达质粒；
[0022]4)上述GFP-PTB融合蛋白表达质粒通过Lipofofectamine? 2000分别转染步骤I中的3株细胞，并通过G418筛选2-3周获得稳转肝癌细胞株；HepG2M-GFP-PTB ；
[0023]5)采用荧光显微镜验证上述稳转细胞株中的PNC比例，与步骤2的PTB免疫荧光检测结果一致，即得到可用于抗转移中药单体筛选的带GFP标记PNC的高转移性肿瘤细胞模型。
[0024]基于PNC的抗转移中药单体的筛选模型的使用方法，包括如下步骤:
[0025]I)采用CCK8法分析备选中药单体对带GFP标记PNC的高转移性肝癌细胞株的生长抑制情况，计算48h时间点对细胞生长抑制达50% (GI50% )和99% (GI99% )的药物浓度；
[0026]2)带GFP标记PNC的高转移性肝癌细胞株爬片过夜后，分别加入GI50%和GI99%浓度的中药单体作用24小时后，用4%多聚甲醛固定，并水洗封片后于镜下观察；
[0027]3)采用荧光显微镜检测中药单体作用后的PNC比例，每次计数100个细胞，计数3次后取平均值；或采用激光共聚焦显微镜成像后，配合Stereo Investigator软件计数中药单体作用后的肿瘤细胞PNC比例；
[0028]4)计算PNC抑制率:PNC抑制率=(助溶剂DMSO组的PNC比例-中药单体组的PNC比例)/助溶剂DMSO组的PNC比例X 100%，再行统计分析；
[0029]5)以中药单体的PNC抑制率作为筛选依据:在GI50%浓度时达到30%以上PNC抑制率的作为优先选择，以GI99%浓度达到30%以上PNC抑制率的作为第二选择。
[0030]抗癌新药，尤其是抗转移药物长期处于市场需求“饥渴状态”。近年来，中药单体在肝癌治疗中的前景日益受到关注。但如何简便高效地从庞大的中药单体库筛选出具有降低肿瘤侵袭性潜能的中药单体，又是一个亟待解决的重要问题。而肝癌细胞核中PNC比例与其侵袭性呈正相关，因此有望作为新型的肿瘤转移分子标记物而用于抗转移新药的筛选。因此基于PNC标记的高转移性肝癌细胞模型的建立，对于从传统中药中发掘具有抗肿瘤转移作用的中药单体具有重要意义。
[0031]另外，PTB作为PNC的主要组成蛋白之一，可明确显示PNC在细胞核中的定位和大小，稳转GFP标记PTB的肿瘤细胞可直观反映细胞中的PNC比例，因此在高转移性肝癌细胞中导入GFP-PTB可作为抗转移中药单体的有效筛选模型。本发明所提供的基于该类细胞的抗转移中药单体的筛选模型，对于药物的选择性开发至关重要。
[0032]本发明的优点在于:
[0033]1、带GFP标记PNC的高转移性肝癌细胞模型无需其他体外标记和特殊试剂及耗材，可直接用于抗转移中药单体筛选，筛选步骤简便，方法快捷，费用低，且易于操作，稳定性好；
[0034]2、中药较之常 规化疗药物具有低毒副作用的优势，因此基于PNC指针的高转移性肝癌细胞模型的建立，对于具有抗肿瘤转移作用的中药单体的高通量筛选及选择性开发至关;
[0035]3、带GFP标记的高转移性肝癌细胞模型亦能用于动物实验的活体成像分析，为抗转移中药单体的体内验证提供良好的肝癌细胞模型。
【专利附图】
【附图说明】
[0036]图1为HepG2M-GFP_PTB (高转移肝癌细胞株)中的PNC亚细胞定位图，细胞核仁周边的亮点，即为PNC结构。
[0037]图2为中药单体槲皮素、异甘草素、姜黄素处理H印G2M-GFP-PTB细胞后的PNC比例柱状图:其中，PNC比例在中药单体处理后显著降低，且呈剂量依赖性。
具体实施例
[0038]下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
[0039]本发明实施例中所需要的材料、试剂均可市场购得。
[0040]实施例1
[0041]一、将H印G2细胞(购至ATCC)，于肝脏原位接种-分离淋巴结转移灶-体外培养得到转移性肝癌细胞-再次肝脏原位接种(重复5次)，获得高侵袭性的肝癌细胞株H印G2M ；
[0042]二、采用PTB抗体(购至Invitrogen，1:1000稀释)进行免疫荧光检测，HepG2M细胞中的PNC比例为97.5% ;
[0043]三、构建带GFP标记的PTB表达质粒(GFP-PTB):通过高保真DNA聚合酶PCR扩增人PTB cDNA序列，扩增后的片断在HindIII和BamHl位点处插入GFP表达质粒pEGFP-Cl (购至上海和元生物技术有限公司)，即得到带GFP标记的PTB融合蛋白表达质粒；
[0044]四、上述GFP-PTB融合蛋白表达质粒通过Lipof ectamine? 2000 (购至Invitrogen)转染H印G2M细胞，并通过G418筛选约3周获得稳转细胞株H印G2M-GFP-PTB。该细胞中的PNC比例与H印G2M细胞中的基本一致，为97.8%。即得到可用于抗转移中药单体筛选的带GFP标记PNC的高转移性肝癌细胞模型；五、!fepG2M-GFP-PTB细胞(按5000个/孔)接种96孔板，贴壁过夜后，加入梯度浓度的中药单体(槲皮素、异甘草素、姜黄素、柚皮素、山奈酚等，均购至成都瑞芬思生物科技有限公司，以DMSO助溶)，继续培养48小时后，采用CCK8法分析中药单体对H印G2M-GFP-PTB细胞的生长抑制情况，并采用GraphPadPrism5软件计算细胞生长抑制达50% (GI50% )和99% (GI99% )时的药物浓度，见下表:
[0045]
【权利要求】
1.带GFP标记PNC的高转移性肝癌细胞株，其特征在于:通过GFP-PTB融合蛋白表达质粒转染高转移性肝癌细胞株构建。
2.权利要求1所述的带GFP标记PNC的高转移性肝癌细胞株的构建方法:包括如下步骤: 1)制备高转移性的肝癌细胞株H印G2M； 2)构建带GFP标记的PTB表达质粒GFP-PTB:通过高保真DNA聚合酶以PCR法扩增人PTB cDNA序列，扩增后的片断在HindIII和BamHl位点处插入GFP表达质粒pEGFP-Cl，获得带GFP标记的PTB融合蛋白表达质粒； 3)步骤2)的GFP-PTB融合蛋白表达质粒转染步骤I)的高转移性的肝癌细胞株，得到带GFP标记PNC的高转移性肝癌细胞株，并通过G418筛选获得稳转细胞株!fepG2M-GFP-PTB。
3.根据权利要求2所述的带GFP标记PNC的高转移性肝癌细胞株的构建方法，其特征在于:所述在步骤I)为肝癌细胞株原位接种-分离淋巴结转移灶-体外培养得到转移性肿瘤细胞株-再次原位接种，重复5次，获得高转移性的肝癌细胞株H印G2M。
4.权利要求1所述的带GFP标记PNC的高转移性肝癌细胞株用于制备肝癌诊断试剂。
5.权利要求1所述的带GFP标记PNC的高转移性肝癌细胞株用于制备肝癌药物筛选模型。
6.基于PNC的抗转移中药单体的筛选模型的构建方法，包括如下步骤: 1)通过肿瘤细胞株原位接种-分离淋巴结转移灶-体外培养得到转移性肿瘤细胞株-再次原位接种，如此重复5次，获得高转移性的肝癌细胞株H印G2M ； 2)通过PTB抗体的免疫荧光实验，检测上述高转移肝癌细胞株中的PNC比例，3株细胞的PNC比例均在95%以上； 3)带GFP标记的PTB表达质粒(GFP-PTB)的构建:通过高保真DNA聚合酶以PCR法扩增人PTB cDNA序列，扩增后的片断在Hindi 11和BamHl位点处插入GFP表达质粒pEGFP-Cl，即得到带GFP标记的PTB融合蛋白表达质粒； 4)上述GFP-PTB融合蛋白表达质粒通过Lipofeetamine?2000分别转染步骤I中的3株细胞，并通过G418筛选2-3周获得稳转肝癌细胞株；!fepG2M-GFP-PTB ； 5)采用荧光显微镜验证上述稳转细胞株中的PNC比例，与步骤2的PTB免疫荧光检测结果一致，即得到可用于抗转移中药单体筛选的带GFP标记PNC的高转移性肿瘤细胞模型。
7.一种基于PNC的抗转移中药单体的筛选模型，其特征在于:所述筛选模型采用带GFP标记PNC的高转移性肝癌细胞株，通过中药单体对带GFP标记PNC的高转移性肝癌细胞株的PNC抑制率进行筛选。
8.权利要求7所述的基于PNC的抗转移中药单体的筛选模型的使用方法，其特征在于:包括如下步骤: 1)采用CCK8法分析备选中药单体对带GFP标记PNC的高转移性肝癌细胞株的生长抑制情况，计算48h时间点的GI50%和GI99%药物浓度； 2)带GFP标记PNC的高转移性肝癌细胞株爬片过夜后，分别加入GI50%和GI99%浓度的中药单体作用24小时；3)用4%多聚甲醛固定，并水洗封片； 4)采用荧光显微镜检测中药单体作用后的PNC比例，每次计数100个细胞，计数3次后取平均值；或采用激光共聚焦显微镜成像后，配合Stereo Investigator软件计数中药单体作用后的肿瘤细胞PNC比例； 5)计算PNC抑制率:PNC抑制率=(助溶剂DMSO组的PNC比例-中药单体组的PNC比例)/助溶剂DMSO组的PNC比例X 100%，再行统计分析； 6)以中药单体的PNC抑制率作为筛选依据:在GI50%浓度时达到30%以上PNC抑制率的作为优先选择，以GI99%浓度达到30%以上PNC抑制率的作为第二选择。
9.根据权利要求8所述的基于PNC 的抗转移中药单体的筛选模型的使用方法，其特征在于:步骤4)具体为:细胞爬片用4%多聚甲醛室温固定20分钟后，PBS洗2次，超纯水洗I次，每次3分钟。然后每张细胞爬片加10 μ I防荧光淬灭封片剂进行封片。
【文档编号】C12Q1/02GK103966170SQ201410202228
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年5月12日 优先权日:2014年5月12日
【发明者】刘艳宁, 陈智, 楼国华, 王静, 吴珊珊 申请人:浙江大学