专利名称：：一种偶联物及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种偶联物及其制备方法与应用。
背景技术：
：根据世界卫生组织的报告，目前全球每年新发生的肿瘤患者约有1000万，死亡600万。自20世纪70年代以来，我国恶性肿瘤发病率和死亡率一直呈上升趋势，2000年癌症发病人数约200万，死亡150万。目前肿瘤死亡率已经超过心脑血管病而跃居首位。恶性肿瘤已经成为人类的"第一杀手"。研究表明，上皮源性肿瘤，包括肺癌、胃癌、肝癌、食管癌、结直肠癌、宫颈癌、鼻咽癌和乳腺癌等恶性肿瘤，其产生、形成、增殖、转移和预后不良等，均与人体表皮生长因子/表皮生长因子受体(EGF/EGFR)信号通道相关。在上皮源性肿瘤细胞表面，EGFR过度表达，因此，与正常细胞相比，上皮源性肿瘤细胞的EGF/EGFR信号通道过于活化，导致肿瘤细胞无休止的增殖、分化，并最终形成实体肿瘤。因此，以EGF/EGFR信号通道为靶点，降低该信号通道的活性，抑制肿瘤细胞的增殖、分化，最终达到对上皮源性肿瘤进行特异性治疗，已成为该领域研究的焦点。目前，针对EGF/EGFR信号通道为靶点的上皮源性肿瘤特异性治疗手段主要包括抗EGFR的单克隆抗体的研究以及对信号通道中酪氨酸激酶抑制剂的研究。单克隆抗体作为癌症被动治疗的一种主要手段，在世界范围内得到广泛的应用。在上皮源性肿瘤中，肿瘤细胞表面EGFR过度表达，因此，抗EGFR的单克隆抗体与人体内的EGF竞争性地与EGFR结合后，抑制EGF/EGFR信号通道的活性，从而抑制肿瘤细胞的增殖、分化，进而到达癌症治疗的目的。目前，全球已经上市三种针对EGFR的单克隆抗体，用于EGFR高表达的上皮源性肿瘤的治疗，已取得了明显的效果。三种针对EGFR的单克隆抗体及其适应症如下表所示产品名称适应症尼妥珠单抗NimotuzuMab鼻炎癌、非小细胞肺癌、胃癌、结直肠癌、神经胶质瘤、食管癌西妥昔单抗CetuxiMab非小细胞肺癌、头颈部肿瘤、胃癌帕尼单抗PanitumuMab结直肠癌但由于单克隆抗体价格昂贵，且需要多次注射，因此包括我国在内的广大发展中国家普通患者使用存在一定的困难。研究表明，EGF与EGFR结合后可以激活细胞内酪氨酸激酶活性，从而使肿瘤细胞增殖、分化。因此，抑制细胞内酪氨酸激酶活性也是上皮源性肿瘤治疗的一种途径。特罗凯(Erlotinib)和易瑞沙(Gefitinib)是两种口服的表皮生长因子受体-酪氨酸激酶(EGFR-TK)拮抗剂，前者于2002年9月经美国FDA批准作为标准方案治疗无效的晚期NSCLC的二线或三线治疗方案，后者于2003年5月经美国FDA批准作为三线单药用于晚期非小细胞肺癌的治疗。但这两种小分子药物在治疗过程中易产生耐药性，且对不同人种、不同生活环境的患者治疗效果存在争议。由于针对EGF/EGFR信号通道的单克隆抗体、小分子酪氨酸激酶抑制剂存在各种不足，因此，开发一种疗效显著、价格低廉的治疗和/或预防上皮源性肿瘤的药物成为迫切需求。在EGF/EGFR系统中，信号通道的激活是EGF与EGFR两者特异性结合后共同完成的。由于抗EGFR单克隆抗体可以通过竞争性的与EGFR结合达到抑制信号通道活性，提示抗EGF的抗体与EGF特异性结合后，也可能起到抑制EGF/EGFR信号通道激活、抑制肿瘤细胞增殖分化，最终达到肿瘤治疗的目的。重组人表皮生长因子是人体自身产生的细胞因子之一，具有多种生物学功能。由于免疫耐受，人体不会对游离的表皮生长因子产生免疫应答。随着免疫学研究和疫苗开发技术的进展，人们发现弱免疫原性的多糖抗原(如肺炎多糖、C群奈瑟氏脑膜炎多糖、流感嗜血杆菌多糖)在与合适的载体蛋白偶联后，可以增加抗原的免疫原性，使机体对该类抗原产生记忆性免疫应答。研究同时表明，小分子的多肽与载体蛋白偶联后，同样可以增加多肽的免疫原性。在中国专利95115090.1中，研究人员将表皮生长因子(EGF)通过化学方法与破伤风类毒素偶联形成偶联物，动物实验表明，用上述偶联物免疫小鼠，产生高水平的抗EGF抗体。在中国专利03818573.3(WO03/106487Al)中，研究人员将来自血管内皮生长因子(VEGF)的多肽片断与匙孔虫戚血蓝蛋白偶联，动物实验表明，用上述偶联物免疫小鼠，不但产生高水平的抗VEGF多肽片段的抗体，而且能显著抑制肿瘤细胞转移的能力。
发明内容本发明的目的是提供一种偶联物及其制备方法与应用。本发明所提供的偶联物是将重组人表皮生长因子和下述三种重组人表皮生长5因子突变体这四种蛋白中的至少一种与载体蛋白偶联得到的；所述重组人表皮生长因子的氨基酸序列如序列表中序列2所示；所述重组人表皮生长因子突变体为下述任一种蛋白1)序列表中序列2的第53位精氨酸缺失得到的蛋白；2)序列表中序列2的第53位精氨酸和第52位亮氨酸缺失得到的蛋白；3)序列表中序列2的第1位天冬酰胺前添加甲硫氨酸得到的蛋白。上述偶联物中，所述载体蛋白为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白、白喉类毒素、破伤风类毒素或热休克蛋白；所述偶联物的结构式为-Xm(rhEGF)n;其中，X为载体蛋白，rhEGF为重组人表皮生长因子和所述三种重组人表皮生长因子突变体这四种蛋白的至少一种；m为l-5的整数，n为l-12的整数；优选m为l-4的整数，n为l-8的整数；进一歩优选m为1-3的整数，n为1-6的整数。上述偶联物中，所述载体蛋白具体可为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白，所述脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白的氨基酸序列如序列表中序列4所示。上述偶联物的结构式具体可为(P64k)2(rhEGF)5;其中，P64K为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白，rhEGF为所述重组人表皮生长因子突变体的混合物；所述重组人表皮生长因子突变体的混合物由如下两种蛋白组成1)序列表中序列2的第53位精氨酸缺失得到的蛋白；2)序列表中序列2的第53位精氨酸和第52位亮氨酸缺失得到的蛋白。所述重组人表皮生长因子突变体的混合物是将重组人表皮生长因子编码基因转入酵母中表达得到的；所述重组人表皮生长因子编码基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示；所述酵母具体可为毕赤酵母X33。本发明的另一个目的是提供上述偶联物的制备方法。本发明所提供的偶联物的制备方法，是将所述重组人表皮生长因子和所述三种重组人表皮生长因子突变体这四种蛋白中的至少一种与载体蛋白混合，在混合物中加入偶6联剂，反应得到偶联物。上述方法中，所述重组人表皮生长因子和所述三种重组人表皮生长因子突变体与所述载体蛋白的摩尔比为(l-20):1，优选为(5-15):1，更优选为(8-12):1;所述偶联剂可为同功能偶联剂或双功能偶联剂，优选为同功能偶联剂，具体可为戊二醛。所述戊二醛在混合物中的最终浓度为0.01-0.1%,优选为0.02-0.08%，更优选为0.03-0.06%;所述偶联的反应时间为20-90分钟，优选为30-60分钟。上述偶联过程可以在液相中完成，也可以在固相表面完成。固相偶联时，可先将所述重组人表皮生长因子突变体的混合物或P64k结合至介质表面，经戊二醛活化后，再将另一蛋白结合至介质表面，使两种蛋白完成偶联过程。上述方法还包括将得到的偶联物进行纯化，以去除戊二醛和所述重组人表皮生长因子突变体的混合物的步骤。纯化后的偶联物中，偶联物的质量百分含量可以达到50%，优选为70%，更优选为75%;其中，游离的重组人表皮生长因子突变体的混合物的质量百分含量不大于5%，优选为不大于1%。纯化方法可以釆用现有的纯化方法，优选为超滤纯化，超滤膜包的截留分子量为50kDa。本发明的第三个目的是提供一种治疗和/或预防上皮源性肿瘤的疫苗。本发明所提供的治疗和/或预防上皮源性肿瘤的疫苗，它的活性成分为上述任一种偶联物。本发明通过将重组人表皮生长因子突变体的混合物(rhEGF)与脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白(P64k)偶联，制备成偶联物。该偶联物与免疫佐剂混合后作为疫苗用于上皮源性肿瘤的主动治疗，使患者产生针对EGF的特异性抗体，以达到中和患者血清中EGF含量、下调EGF/EGFR信号通道活性、抑制上皮源性肿瘤细胞增殖、分化，最终达到上皮源性肿瘤主动免疫治疗的目的。上述疫苗中，所述佐剂为铝佐剂或MomtanideISA51佐剂，优选为MomtanideISA51佐剂。MomtanideISA51是一种新型的人用免疫佐剂，由溶于矿物质油溶液(Drakeol6VR)的高度精炼的甘油醇酐油酸酯(Montanide80)组成，可以与抗原乳化形成油包水的乳化液，起到缓释作用，并增强抗原呈递细胞对抗原的摄取，增强抗原的免疫原性。所述上皮源性肿瘤包括非小细胞肺癌、胃癌、肝癌、食管癌、结直肠癌或鼻咽癌。本发明的疫苗利用特异性主动免疫的方法以细胞信号通道为作用靶点，产生抗EGF抗体，对相应的免疫系统进行刺激，恢复患者自身的免疫系统，从而有效地抑制、阻断和调节了EGF/EGFR系统，对EGFR过度表达的上皮源性肿瘤有很好的治疗效果。与传统的单纯放化疗方法相比，本发明疫苗的毒副作用很小、安全性高、耐受性好，而且可以充分调动癌症患者自身的抗肿瘤潜能，达到肿瘤治疗的目的。用本发明的疫苗免疫小鼠，能诱导小鼠体内高水平的抗体，最高抗体滴度达到l:20000，且小鼠的存活期延长比率达到69.4%。图1为重组人表皮生长因子PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果图2为重组人表皮生长因子双酶切产物的琼脂糖凝胶电泳结果图3为重组人表皮生长因子突变体混合物的反相色谱图谱图4为重组人表皮生长因子突变体混合物的肽谱(胰蛋白酶)图5为重组人表皮生长因子突变体混合物的电泳图谱图6为重组人表皮生长因子突变体混合物的质谱分析图谱图7为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白P64kPCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果图8为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白P64k的反相色谱图谱图9为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白P64k的肽谱(胰蛋白酶)图10为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白P64k的电泳图谱图11为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白P64k的质谱分析图谱图12为偶联物rhEGF-P64k的凝胶色谱图谱图13为偶联物rhEGF-P64k中各组分的免疫鉴别图谱图14为偶联物rhEGF-P64k的分子量检测图谱图15为偶联物(P64K)2(rhEGF)5与佐剂MontanidelSA51乳化后的电镜分析结果图16为偶联物(P64K)2(rhEGF)5在非人灵长类动物中的免疫原性分析具体实施例方式下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实施例1、重组人表皮生长因子突变体混合物(rhEGF)的制备1、重组人表皮生长因子编码基因的克隆根据酵母的密码子偏性，人工合成编码成熟重组人表皮生长因子的全长DNA序列，将该基因命名为其核苷酸序列如序列表中序列1所示，其编码的氨基酸序列如序列表中序8列2所示。以上述合成的重组人表皮生长因子的全长DNA序列为模板，用Primer5.0软件设计引物上游引物5陽CCGCTCGAGAACTCAGATAGTGAATGCC-3，下游引物5-CCGGAATTCTCAACGTAATTCCCACCA-3，其中下划线部分分别为Xhol和EcoRI的酶切位点，进行PCR扩增。PCR反应体系为0.5)il模板，10xPCR缓冲液5nl，1Ommol/LdNTPlnl，Pyrobest高保真DNA聚合酶(上海生工产品)lpl，终浓度为0.5pmol/L的上下游引物各0.5^1，加超纯水至50nl。PCR反应条件为先94'C预变性5min;然后94°C变性30s，56。C退火30s，72"C延伸30s;共30个循环，最后72。C延伸10min。将PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果如图l所示。其中，泳道1为重组人表皮生长因子编码基因的PCR扩增产物，泳道2为DL2000DNA分子量标准。结果表明，扩增得到160bp左右的重组人表皮生长因子编码基因。2、载体和工程菌株的构建回收上述目的片段，将回收的PCR产物和pPICZa载体(购自Invitrogen公司)分别用Xhol和EcoRI进行双酶切，上述步骤1的PCR产物经Xhol和EcoRI双酶切后的酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。其中，泳道l为DL2000DNA分子量标准，泳道2为上述步骤1的PCR产物经Xhol和EcoRI双酶切后的酶切产物。切胶回收酶切片段，将酶切产物与载体pPICZa的酶切产物以1:10的摩尔比混合，经T4DNA连接酶室温连接过夜，连接产物用CaCl2法转化TOP10F感受态细胞，涂布于含Zeocin(25吗/ml)的LB平板上，挑取单克隆，Xhol和EcoRI双酶切鉴定阳性克隆。提取上述阳性克隆的DNA，经BglII酶切后线性化，用电转化方法转入毕赤酵母X33(购自Invitrogen公司)的感受态细胞中，涂布于Zeocin的终浓度分别为100吗/mL、500吗/mL和1000吗/mL的YPDS平板上进行筛选，283(TC倒置培养3~10d，直至有单克隆长出，得到表达重组人表皮生长因子的酵母工程菌。3、工程菌株大规模培养、重组人表皮生长因子的纯化和检测将上述步骤2获得的表达重组人表皮生长因子的酵母工程菌经三级培养放大，最后转至1000L的发酵罐中，发酵罐参数设置为搅拌速度350-400rpm，温度29-32'C，溶氧控制在30-40%。培养72-96小时后，终止培养。将培养液经连续高速离心进行固液分离。收集上清液依次进行阴离子交换层析(DEAE-SepharoseFFGE)、疏水层析(PhenylSepharoseCL-4B)和阳离子交换层析(SP-S印haroseFFGE)，得到重组人表皮生长因子原液。按照《中华人民共和国药典》2005版第三部要求和质量标准对上述获得的重组人表皮生长因子原液进行纯度、残留杂质和结构鉴别，具体的检测结果如图3-图6所示。结果表明，上述得到的重组人表皮生长因子原液中含有重组人表皮生长因子C末端缺失精氨酸的突变体和重组人表皮生长因子C末端缺失精氨酸和亮氨酸的突变体，是这两种重组人表皮生长因子突变体的混合物。其中，图3为重组人表皮生长因子原液的反相色谱图谱，检测波长为214nm，峰2为重组人表皮生长因子C末端缺失精氨酸的突变体，其色谱保留时间为26.04分钟，峰1为重组人表皮生长因子C末端缺失精氨酸和亮氨酸的突变体，其色谱保留时间为22.06分钟，峰1和峰2的质量百分含量达到97.9%;图4为重组人表皮生长因子突变体混合物的肽谱(胰蛋白酶)，结果显示，上述获得的重组人表皮生长因子突变体混合物和重组人表皮生长因子标准品(古巴分子免疫学中心)的图谱完全一致；图5为重组人表皮生长因子突变体混合物的电泳图谱，EGF表示上述获得的酵母工程菌表达的重组人表皮生长因子突变体混合物，LMWP表示低分子量蛋白标准品(购自GE公司)，在电泳图谱中，上述获得的重组人表皮生长因子突变体混合物只有一条带，纯度为100%;图6为重组人表皮生长因子突变体混合物的质谱分析图谱，分子量为6060.7Da的组分为C末端缺失精氨酸的重组人表皮生长因子突变体，分子量为5947.4Da的组分为C末端缺失精氨酸和亮氨酸的重组人表皮生长因子突变体。实施例2、脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白(P64k)的制备1、脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白编码基因的克隆根据GenBankAccessionNo.X77920.1的脑膜炎奈瑟氏菌的序列，采用Primer5.0软件设计引物上游引物5-CATGCCATGGCTTTAGTTGAATTGAA-3,下游引物5-CCGGAATTCTTATTTTTTCTTTTGCGGAG-3，其中下划线部分分别为Ncol和EcoRI的酶切位点。将脑膜炎奈瑟氏菌CMCC29336(购自中国医学细菌保藏中心，简称CMCC)于IOO'C条件下煮沸10min，吸取3^作为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系为3^1模板，10xPCR缓冲液5pl，10mmol/LdNTPljul，Pyrobest高保真DNA聚合酶(上海生工产品)1^1，终浓度为0.5pmol/L的上下游引物各0.5pl，加超纯水至50^1。PCR反应条件为先94。C预变性5min;然后94。C变性45s，50'C退火45s，72'C延伸2min;共30个循环，最后72'C延伸10min。将PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果如图7所示。其中，泳道l为DL2000DNA分子量标准，泳道2为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白(P64k)编码基因的PCR扩增产物。结果表明，扩增得到1800bp左右的脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白的编码基因。对上述获得的脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白的编码基因进行测序，测序结果表明，其核苷酸序列如序列表中序列3所示，其编码的氨基酸序列如序列表中序列4所示。2、载体和工程菌株的构建回收上述目的片段，将回收的PCR产物和pET28a载体分别用Ncol和EcoRI进行双酶切，上述步骤1的PCR产物经Ncol和EcoRI双酶切后的酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收酶切片段，将酶切产物与载体pET28a的酶切产物以1:3的摩尔比混合，经T4DNA连接酶室温连接过夜，连接产物用CaCl2法转化JM109感受态细胞，12小时后，挑选单克隆，用菌落PCR法筛选阳性克隆，得到表达脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白(P64k)的大肠杆菌工程菌。3、工程菌株大规模培养、脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白P64k的纯化和检测将上述步骤2获得的表达脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白P64k的大肠杆菌工程菌经三级培养放大，最后转至500L的肉汤培养基中，发酵罐参数设置为搅拌速度350-400rpm，温度35-37。C，溶氧控制在30-40%。培养36-48小时后，终止培养。将培养液经连续高速离心进行固液分离以收集菌体，将收集到的菌体经高压匀浆后，离心去除菌体碎片，在上清液中加入固体硫酸铵，依次进行疏水层析、阴离子交换层析(Q-SepharoseFFGE)和凝胶过滤(SupperdexS200GE)，得到脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白原液。按照《中华人民共和国药典》2005版第三部要求和质量标准对上述获得的脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白原液进行纯度、残留杂质和结构鉴别，具体的检测结果如图8-图11所示。其中，图8为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白(P64k)的反相色谱图谱，检测波长为280nm，结果显示，上述获得的脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白只有一个峰，其色谱保留时间为7.71分钟，色谱纯度为100%;图9为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白P64k的肽谱(胰蛋白酶)，结果显示，上述获得的脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋P64k白和P64k标准品(古巴分子免疫学中心)的图谱完全一致；图10为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白P64k的电泳图谱，P64K表示上述获得的大肠杆菌工程菌表达的脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白P64k，LMWP表示低分子量蛋白标准品(购自GE公司)，在电泳图谱中，上述获得的脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白P64k只有一条带，纯度为100%;图11为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白P64k的质谱分析图谱，质谱分子量为61932.7Da，与氨基酸序列推算的理论分子量一致。实施例3、重组人表皮生长因子突变体混合物和脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白偶联物(rhEGF-P64k)的制备用0.1M的硼酸钠溶液(pH8.5)将上述实施例1制备的重组人表皮生长因子突变体的混11合物和上述实施例2制备的P64k的浓度分别调整至1.0mg/mL，取不同体积的浓度为1.0mg/mL的重组人表皮生长因子突变体的混合物和P64k蛋白溶液至10L的无菌无热原的反应釜中，使重组人表皮生长因子突变体的混合物与P64k的摩尔比为(12-8):1。将上述混合液在反应釜中混合并平衡至室温，缓慢滴加体积百分含量为0.5%的戊二醛溶液，使混合液中戊二醛的终浓度分别为0.01%、0.05%和0.1%。室温搅拌30-60分钟后，加入0.2M的甘氨酸，使其在感应体系中的终浓度为5%以终止偶联反应。得到重组人表皮生长因子突变体混合物和脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白的偶联物rhEGF-P64k。偶联物rhEGF-P64k经截留分子量为50kDa的超滤膜包等体积超滤换液10个体积的磷酸盐缓冲液，并调整偶联物浓度至1.0mg/mL，0.2pm滤膜出菌过滤，灌装保存。实施例4、重组人表皮生长因子突变体混合物和脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白的偶联物(rhEGF-P64k)的结构分析1、有效组分的鉴别和含量分析采用凝胶色谱法鉴定上述实施例3制备的偶联物中各组分的含量。色谱条件为色谱柱TSK2000SWXL;流动相PBS和质量百分含量为0.1%的SDS，pH6.7;检测波长214腦。由于脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白(P64k)具有较强的疏水性，在生理缓冲溶液中易形成寡聚物，从而干扰对偶联物各组分的分离和判定。因此，通过在流动相中加入质量百分含量为0.1X的SDS，以消除P64k蛋白之间的疏水作用，从而使偶联物中各组分达到基线分离。偶联物rhEGF-P64k的凝胶色谱图谱如图12所示。结果表明，偶联物rhEGF-P64k的凝胶色谱图谱出现两个峰，主峰的保留时间分别为5.675min(Peakl)和7.044min(Peak2)，其中保留时间为5.675min(Peakl)的组分，表观分子量大于P64k，是偶联物rhEGF-P64k;保留时间为7.044min(Peak2)的组分，表观分子量介于P64k和rhEGF之间，推断是重组人表皮生长因子突变体混合物的聚合物。为了验证以上推断，分别收集偶联物rhEGF-P64k的两个峰(5.675min和7.044min)进行各组分的免疫鉴别试验，结果如图13所示。其中，Peakl表示图12中收集到的峰l的免疫鉴别结果，Peak2表示图12中收集到的峰2的免疫鉴别结果，偶联物表示凝胶色谱法分离之前峰1和峰2混合物的免疫鉴别结果。结果表明，5.675min组分对抗重组人表皮生长因子和抗P64k的抗体都呈阳性反应，表明其为偶联物rhEGF-P64k;而7.044min组分只对抗重组人表皮生长因子的抗体呈阳性反应，根据其色谱相对保留时间，则该组分是重组人表皮生长因子突变体混合物的聚合体。根据偶联物的色谱分离和免疫鉴别结果，纯化后的偶联物中，有效组分rEGF-P64k的含量最高可达75%。2、偶联物结构表征由于偶联物rhEGF-P64K是由重组人表皮生长因子突变体混合物和P64K偶联而成，因此，只要准确测定出偶联物rhEGF-P64K的分子量，就可以根据重组人表皮生长因子突变体和P64K的分子量推算出偶联物中重组人表皮生长因子突变体和P64K所占的质量，从而推断出偶联物中重组人表皮生长因子突变体和P64K的摩尔比，即偶联物rhEGF-P64K由几个重组人表皮生长因子突变体和几个P64K蛋白构成。采用凝胶色谱与多角度激光光散射仪(Multi-AnlgeLaserScattering)串连测定偶联物rhEGF-P64K的分子量。在分析过程中，样品经凝胶色谱分级分离后，依次通过激光光散射仪(DAWNEOS,Wyatt)和示差检测仪(OPTILABDSP,Wyatt)，分析软件(Astra)根据采集的激光信号和示差信号计算出偶联物rhEGF-P64K的分子量，偶联物rhEGF-P64k的分子量检测图谱如图14所示。结果表明，多角度激光散射法测定的P64k和重组人表皮生长因子突变体的分子量分别为62.2kDa和6.3kDa，与质谱测定的分子量相吻合(P64k:61.9kDa;rhEGF:6.0kDa);多角度激光散射法测定的偶联物rhEGF-P64K的平均分子量为156.1kDa。在偶联物rhEGF-P64K中，如果P64k的摩尔数为l(m=l)，则重组人表皮生长因子突变体的质量为93.9kDa(rhEGF质量H禺联物质量-P64k质量)，其摩尔数为14.9，即一个P64k蛋白分子表面结合14.9分子重组人表皮生长因子突变体，而在偶联反应时重组人表皮生长因子突变体与P64k的摩尔比为(12-8):1，因此这种可能性不存在；如果P64k的摩尔数为3(m-3)，则在偶联物中P64k所占质量达到186.6kDa，而偶联物分子量只有156.1kDa，所以这种可能也不存在；如果P64k的摩尔数为2(n^2)，重组人表皮生长因子突变体混合物的质量为31.7kDa，其摩尔数为5.03，即一个P64k蛋白分子表面结合2.5分子重组人表皮生长因子突变体。该结果与经过I125r-EGF标记的偶联物分析结果相符合。多角度激光散射分析结果表明，偶联物rhEGF-P64K的平均分子量为156.1kDa，是由两个P64k蛋白分子与5个重组人表皮生长因子突变体分子组成的聚合物，平均一个P64k蛋白分子表面结合2.5个重组人表皮生长因子突变体分子。偶联物的结构式可以表达为(P64k)2(rhEGF)5。实施例5、偶联物(P64K)2(rhEGF)5在小鼠中的免疫原性分析1、偶联物(P64K)2(rhEGF)5与佐剂混合13(1)偶联物(P64K)2(rhEGF)5与MontanideISA51混合、乳化用一次性无菌无热原注射器取1.0mL油性佐剂MontanideISA51，分别与等体积的1.0mg/mL的上述实施例3制备的偶联物(P64K)2(rhEGF)5或等体积的上述实施例1制备的重组人表皮生长因子突变体混合物混合于样品瓶中，反复吹打20次，使之形成油包水的混合物，将反复吹打后的混合物滴加到双蒸水中，乳化物呈白色液滴，且不分散。偶联物(P64K)2(rhEGF)5与佐剂MontanideISA51乳化后的电镜分析结果如图15所示。结果表明，偶联物(P64K)2(rhEGF)5与佐剂MontanideISA51充分乳化后，呈均一的小球。(2)偶联物(P64K)2(rhEGF)5与氢氧化铝佐剂的混合、吸附分别取l.Omg/mL的上述实施例3制备的偶联物(P64K)2(rhEGF)5或等体积的上述实施例1制备的重组人表皮生长因子突变体混合物(稀释至1.0mg/mL)于无菌无热原容器中，加入等体积的铝离子质量百分含量为2.0mg/mL的氢氧化铝佐剂，室温搅拌1小时。2、免疫程序取70只10周龄BALB/C小鼠随机分为七组，分别为佐剂MontanideISA51乳化的偶联物组、佐剂MontanideISA51乳化的重组人表皮生长因子突变体混合物组、氢氧化铝佐剂吸附的偶联物组、氢氧化铝佐剂吸附的重组人表皮生长因子突变体混合物组、偶联物组、重组人表皮生长因子突变体混合物组和阴性对照组(PBS)。分别取0.2mL上述步骤1制备的佐剂MontanideISA51与偶联物(P64K)2(rhEGF)5的混合物、佐剂MontanideISA51与重组人表皮生长因子突变体混合物的混合物、氢氧化铝佐剂与偶联物(P64K)2(rhEGF)5的混合物、氢氧化铝佐剂与重组人表皮生长因子突变体混合物的混合物、偶联物(P64K)2(rhEGF)5、rhEGF和PBS皮下注射免疫BALB/C小鼠，每7天免疫一次，共免疫3次。最后一次免疫7天后采集血液样本，分离血清用于抗体滴度检测。3、抗体滴度检测采用ELISA方法测定上述步骤2获得的血清中特异性抗EGF抗体的滴度。多孔板先用EGF包被，加入10倍系列稀释(1:100,1:1000和1:10000)的上述步骤2获得的血清共孵育，然后再加入碱性磷酸酶标记的抗鼠免疫球蛋白，最后加入酶底物，测定OD值。OD值高于阴性对照组OD值加5倍标准差的结果认为是阳性。实验设三次重复，结果如表1所示，每个点代表3次重复实验的平均值。表l抗体滴度测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>rhEGF1001:1000MontanideISA51偶联物1001:10000rhEGF1001:1000无偶联物1001:100rhEGF20阴性对照(PBS)00结果表明，所有佐剂组中，偶联物(P64K)2(rhEGF)5都能诱导小鼠体内高水平的抗体，铝佐剂和MontanideISA51在小鼠体内没有明显的佐剂效应差异，而单独的偶联物(P64K)2(rhEGF)5或重组人表皮生长因子突变体混合物在小鼠体内仅有较低的免疫原性。实施例6、偶联物(P64K)2(AEGF)5在非人灵长类动物中的免疫原性分析1、偶联物(P64K)2(rhEGF)5与MontanideISA51乳化用一次性无菌无热原注射器取l.OmL油性佐剂MontanideISA51与等体积的1.0mg/mL的上述实施例3制备的偶联物(P64K)2(rhEGF)5或等体积的上述实施例1制备的重组人表皮生长因子突变体混合物混合于样品瓶中，反复吹打20次，使之形成油包水的混合物，将反复吹打后的混合物滴加到双蒸水中，乳化物呈白色液滴，且不分散。2、免疫程序取Cercophithecusaethiop猴随机分为2组，每组2只，皮下注射50ug上述步骤1制备的佐剂MontanideISA51与偶联物(P64K)2(rhEGF)5的混合物或佐剂MontanideISA51与重组人表皮生长因子突变体混合物的混合物，每周免疫一次，共免疫2次。分别于免疫前、最后一次免疫l个月、2个月和3个月后采集血液样本，分离血清用于抗体滴度检测。同时以注射相同剂量PBS的Cercophithecusaethiop猴作为对照。3、抗体滴度检测采用ELISA方法测定上述步骤2获得的血清中特异性抗EGF抗体的滴度。多孔板先用EGF包被，加入10倍系列稀释(1:10，1:100,1:1000和1:10000)的上述步骤2获得的血清共孵育，然后再加入碱性磷酸酶标记的抗鼠免疫球蛋白，最后加入酶底物，测定OD值。OD值高于阴性对照组OD值加5倍标准差的结果认为是阳性。实验设三次重复，偶联物(P64K)2(rhEGF)5在非人灵长类动物中的免疫原性分析结果如图16所示，每个点代表3次重复实验的平均值。结果表明，偶联物(P64K)2(rhEGF)5免疫组最高抗体滴度达到1:20000，而重组人表皮生长因子突变体混合物免疫组抗体滴度仅为h100。因此，rhEGF在非人灵长类动物中不具有免疫原性，重组人表皮生长因子突变体混合物与P64k偶联后，能使非人灵长类动物产生高水平的免疫应答。表明偶联物(P64K)2(rhEGF)5在人体中具有诱导产生抗EGF抗体反应的潜力。实施例7、偶联物(P64K)2(rhEGF)s在小鼠体内的抗肿瘤活性分析取60只10周龄BALB/C小鼠，皮下注射O.lmL上述实施例5步骤1制备的佐剂MontanidelSA51与偶联物(P64K)2(rhEGF)5的混合物，每7天免疫一次，共免疫3次。最后一次免疫7天后采集血液样本，分离血清用于抗体滴度检测。同时每只小鼠在第28天移植200,000个爱氏腹水瘤细胞(古巴分子免疫学中心提供)。以注射相同剂量生理盐水的BALB/C小鼠作为对照。在随后的71天里，观察小鼠的肿瘤生长情况，检测动物血清中抗重组人表皮生长因子抗体的水平，评估抗体滴度、肿瘤生长和存活率之间的关系，结果见表2。表2各组小鼠在观察期存活状况及其与抗体滴度的对应关系分组小鼠数目存活期延长比率*肿瘤生长肿瘤移植后第71天存活小鼠数量对照组100全部0免疫组无抗体滴度290全部01:100抗体滴度40全部0l:l，OOO抗体滴度1101只出现肿瘤排斥11:10,000抗体滴度1569.41只出现肿瘤排斥3只出现肿瘤完全消退4表2中，*表示不包括出现肿瘤排斥的小鼠，**表示有一只小鼠逃逸。存活期延长比率=(X免顿一X对照组)/X对照组X100X;其中，X兔顿表示免疫组小鼠平均存活期，X对照组表示对照组小鼠平均存活期。结果表明，偶联物(P64K)2(rhEGF)5免疫后诱导小鼠产生抗EGF抗体，且抗体滴度与小鼠的存活相关，即高效价的抗EGF抗体能显著延长荷瘤小鼠的存活率。16序列表〈110〉百泰生物药业有限公司<120〉一种偶联物及其制备方法与应用〈130〉CGGNARZ92049〈160〉4〈210〉1〈211〉162<212〉DNA〈213>人工序列<220〉〈221〉〈400>1aactcagatagtgaatgccctttgagccacgatggatattgcctacatgacggtgtttgt60atgtatatcgaggctttagacaaatacgcatgcaactgcgttgttggttacatcggagaa120agatgtcaataccgtgacttaaaatggtgggaattacgttag162〈210〉2<211>53〈212>PRT<213〉人工序列〈220〉〈221><400〉2AsnSerAspSerGluCysProLeuSerHisAspGlyTyrCysLeuHis151015AspGlyValCysMetTyrlieGluAlaLeuAspLysTyrAlaCysAsn202530<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>朋agacggcgtagtttcccgcctcacgggcggtttggcaggtatggcgaaaeigccgtaaa660gtggacgttatcc犯ggcgacgggcaattcttagatccgcaccacttggaagtgtcgctg720actgccggcgacgcgtacgaacaggcagcccctaccggcgagaaaaaaatcgttgcct,tc780aaaaactgtatcattgcagcaggcagccgcgtaaccaaactgcctttcattcctgaagat840ccgcgcatcatcgattccagcggcgcattggctctgaaagaagtaccgggcaaactgctg900attatcggcggcggcattatcggcctcgagatgggtacggtttacagcacgctgggttcg960cgtttggatgtggttggaatgatggacggcctgatgc犯ggcgcagaccgcgatttggta1020aaagtatggc犯aaacaaaacgaataccgttttgacaacattatggtcaacaccaaaacc1080gttgcagttgagccgaaagaagacggcgtttacgttacctttgaaggcgcgaacgcgcct1140aaagagccgcaacgctacgatgccgtattggttgccgccggccgcgcgcccaacggcaaa1200ctcatcagcgcggaaa犯gcaggcgttgccgtaaccgatcgcggcttcatcg犯gtggac1260犯acaaatgcgtac.caatgtgccgcacatctacgccatcggcgacatcgtcggtxagccg1320atgttggcgcacaaagccgttcacgaaggccacgtcgccgccga犯actgcgtcggccac1380aaagcctacttcgacgcgcgcgtga.ttccgggcgttgcctacacttcccccgaagtggcg1440tgggtgggcgaaaccgaactgtccgccaaagcctccggccgcaaaatcaccaaagccaac1500ttcccgtgggcggcttccggccgtgcgattgccaacggttgcgacaacggcttta.ccaag1560ctgatttttgatgccgaaaccggccgcatcatcggcggcggcattgtcggtccgaacggt1620ggcgatatgatcggcgaagtctgccttgccatcgaaatgggctgcgacgcggcagacatc1680ggcaaaaccatccacccgcacccgaccttgggcgaatccatcggtatggcggcggaagtg1740gcattgggtacttgtaccgacctgcctccgcaaaagaaaaaataa1785〈210〉4〈211>594<212>PRT〈213〉人工序列<220><221〉〈400>4MetAlaLeuValGluLeuLysValProAsplieGlyGlyHisGluAsn151015ValAsplielieAlaValGluValAsnValGlyAspThrlieAlaVal202530AspAspThrLeulieThrLeuGluThrAspLysAlaThrMetAspVal354045ProAlaGluValAlaGlyValValLysGluValLysValLysValGly505560AspLyslieSerGluGlyGlyLeulieValValValGluAlaGluGly65707580ThrAlaAlaAlaProLysAlaGluAlaAlaAlaAlaProAlaGinGlu859095AlaProLysAlaAlaAlaProAlaProGinAlaAlaGinPheGlyGly10010511020SerAlaAspAlaGluTyrAspValValValLeuGlyGlyGlyProGly115120125GlyTyrSerAlaAlaPheAlaAlaAlaAspGluGlyLeuLysValAla130135140lieValGluArgTyrLysThrLeuGlyGlyValCysLeuAsnValGly145150155160CyslieProSerLysAlaLeuLeuHisAsnAlaAlaVallieAspGlu165170175ValArgHisLeuAlaAlaAsnGlylieLysTyrProGluProGluLeu180185190AsplieAspMetLeuArgAlaTyrLysAspGlyValValSerArgLeu195200205ThrGlyGlyLeuAlaGlyMetAlaLysSerArgLysValAspVallie210215220GinGlyAspGlyGinPheLeuAspProHisHisLeuGluValSerLeu225230235240ThrAlaGlyAspAlaTyrGluGinAlaAlaProThrGlyGluLysLys245250255lieValAlaPheLysAsnCyslielieAlaAlaGlySerArgValThr260265270LysLeuProPhelieProGluAspProArglielieAspSerSerGly275280285AlaLeuAlaUuLysGluValProGlyLysLeuLeulielieGlyGly290295300GlylielieGlyUuGluMetGlyThrValTyrSerThrUuGlySer305310315320ArgLeuAspValValGlyMetMetAspGlyLeuMetGinGlyAlaAsp325330335ArgAspLeuValLysValTrpGinLysGinAsnGluTyrArgPheAsp340345350AsnlieMetValAsnThrLysThrValAlaValGluProLysGluAsp355360365GlyValTyrValThrPheGluGlyAlaAsnAlaProLysGluProGin370375380ArgTyrAspAlaValLeuValAlaAlaGlyArgAlaProAsnGlyLys385390395■LeulieSerAlaGluLysAlaGlyValAlaValThrAspArgGlyPhe405410415lieGluValAspLysGinMetArgThrAsnValProHislieTyrAla420425430lieGlyAsplieValGlyGinProMetLeuAlaHisLysAlaValHis435440445GluGlyHisValAlaAlaGluAsnCysValGlyHisLysAlaTyrPhe450455460AspAlaArgVallieProGlyValAlaTyrThrSerProGluValAla465470475480TrpValGlyGluThrGluLeuSerAlaLysAlaSerGlyArgLyslie485490495ThrLysAlaAsnPheProTrpAlaAlaSerGlyArgAlalieAlaAsn500505510GlyCysAspAsnGlyPheThrLysLeuliePheAspAlaGluThrGly515520525ArglielieGlyGlyGlylieValGlyProAsnGlyGlyAspMetlie530535540GlyGluValCysLeuAlalieGluMetGlyCysAspAlaAlaAsplie23<formula>formulaseeoriginaldocumentpage24</formula>权利要求1、一种偶联物，是将重组人表皮生长因子和下述三种重组人表皮生长因子突变体这四种蛋白中的至少一种与载体蛋白偶联得到的；所述重组人表皮生长因子的氨基酸序列如序列表中序列2所示；所述重组人表皮生长因子突变体为下述任一种蛋白1)序列表中序列2的第53位精氨酸缺失得到的蛋白；2)序列表中序列2的第53位精氨酸和第52位亮氨酸缺失得到的蛋白；3)序列表中序列2的第1位天冬酰胺前添加甲硫氨酸得到的蛋白。2、根据权利要求1所述的偶联物，其特征在于所述载体蛋白为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白、白喉类毒素、破伤风类毒素或热休克蛋白；所述偶联物的结构式为Xm(rhEGF)n;其中，X为载体蛋白，rhEGF为重组人表皮生长因子和所述三种重组人表皮生长因子突变体这四种蛋白的至少一种；m为l-5的整数，n为l-12的整数；优选m为l-4的整数，n为1-8的整数；进一步优选m为1-3的整数，n为1-6的整数。3、根据权利要求2所述的偶联物，其特征在于所述载体蛋白为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白，所述脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白的氨基酸序列如序列表中序列4所示。4、根据权利要求3所述的偶联物，其特征在于所述偶联物的结构式为(P64k)2(rhEGF)s;其中，P64K为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白，rhEGF为所述重组人表皮生长因子突变体的混合物；所述重组人表皮生长因子突变体的混合物由如下两种蛋白组成1)序列表中序列2的第53位精氨酸缺失得到的蛋白；2)序列表中序列2的第53位精氨酸和第52位亮氨酸缺失得到的蛋白。5、根据权利要求4所述的偶联物，其特征在于所述重组人表皮生长因子突变体的混合物是将重组人表皮生长因子编码基因转入酵母中表达得到的；所述重组人表皮生长因子编码基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示；所述酵母优选为毕赤酵母X33。6、权利要求1-5中任一所述偶联物的制备方法，是将所述重组人表皮生长因子和所述三种重组人表皮生长因子突变体这四种蛋白中的至少一种与载体蛋白混合，在混合物中加入偶联剂，反应得到偶联物。7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述重组人表皮生长因子和所述三种重组人表皮生长因子突变体与所述载体蛋白的摩尔比为(l-20):1，优选为(5-15):1，更优选为(8-12):1;所述偶联剂为同功能偶联剂或双功能偶联剂，优选为为戊二醛。8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述戊二醛的终浓度为0.01-0.1%，优选为0.02-0.08%，更优选为0.03-0.06%;所述偶联的反应时间为20-90分钟，优选为30-60分钟。9、一种治疗和/或预防上皮源性肿瘤的疫苗，它的活性成分为权利要求1-5中任一所述的偶联物。10、根据权利要求9所述的疫苗，其特征在于所述疫苗中包括佐剂，所述佐剂为MomtanideISA51或铝佐剂，优选为MomtanideISA51;所述上皮源性肿瘤包括非小细胞肺癌、胃癌、肝癌、食管癌、结直肠癌或鼻咽癌°全文摘要本发明公开了一种偶联物。该偶联物是将重组人表皮生长因子和重组人表皮生长因子突变体这四种蛋白中的至少一种与载体蛋白偶联得到的；所述重组人表皮生长因子的氨基酸序列如序列表中序列2所示；所述重组人表皮生长因子突变体为下述任一种蛋白1)序列表中序列2的第53位精氨酸缺失得到的蛋白；2)序列表中序列2的第53位精氨酸和第52位亮氨酸缺失得到的蛋白；3)序列表中序列2的第1位天冬酰胺前添加甲硫氨酸得到的蛋白。将上述偶联物与佐剂混合后作为疫苗用于上皮源性肿瘤的主动治疗。结果表明，该疫苗能诱导小鼠体内高水平的抗体，最高抗体滴度达到1∶20000，且小鼠的存活期延长比率达到69.4％。文档编号C07K17/02GK101475640SQ200910077058公开日2009年7月8日申请日期2009年1月19日优先权日2009年1月19日发明者伟何,何丽华,木冷,喻志爱,李先钟,峰林,王艳萍,白先宏,胡品良,艾军文申请人:百泰生物药业有限公司