专利名称：与A-beta寡聚体特异性结合的基因工程单克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明属基因工程抗体技术领域，具体涉及与A-beta寡聚体特异性结合的基因工程单克隆抗体，本发明还涉及该单克隆抗体的制备方法以及含有该单克隆抗体的药物组合物。
背景技术：
研究表明阿兹海默病(Alzheimer's Disease,简称AD),俗称老年性痴呆是由无毒性的P-淀粉样蛋白单体分子((3-Amyloid, A-beta40/42以下简称A-beta,也可写成A(3)聚集形成具毒性作用的寡聚体引起的老年人主要以记忆力下降和脑部形成老年斑为特征的神经退行性疾病(Selkoe等，Science 1997, 275，630-631; Koo等，PNAS 1996,9989-9990)。医学统计表明，我国和欧美国家中60岁以上老年人有5~6%患有阿兹海默病。该病已被列为导致死亡的第四大疾病，仅次于心脏病、癌症和中风。我国现有60岁以上人口约一亿，按照60岁以上人口中老年性痴呆患病率为5%估算，全国可能有老年性痴呆患者约500万。该病已给家庭和社会带来巨大的负担。
近几年的实验研究越来越多地证明，由A-beta单体凝聚形成丝状物的中间产物一A-beta寡聚体是引起AD的主要致病因子，而不是先前认定的丝状聚集体(Haass，C.等，2007， Nature reviews 8, 101-112; Lesne， S， 2006, Nature 440，352-357; Shankar， G.M, 2008, Nature medicine 14， 837-842)。然而，目前国际上现有的检测及治疗AD用抗体，大多是针对A-beta —级序列，即A-beta单体的抗体，这类抗体能够和A-beta单体、寡聚体及丝状体同时结合，在实验研究、病理检测及临床诊断中不能够特异地检测出真正起致病作用的寡聚体水平的高低。同时，这类抗体在对AD的治疗中易引起大脑出血和脑膜脑炎等严重
3的副作用。
Glabe实验室在2003年的Science杂志上报道了可以与寡聚体特异结合的抗体All (Kayed等，2003, Science 300， 486-489 )。但这种抗体是一种多克隆抗体，在每一生产批次中含有的针对每一种抗原决定簇的各抗体成分的量无法控制，影响检测结果的可比性。并且该抗体不仅与A-beta寡聚体结合，它还与alpha-synuclein、 Prion蛋白、胰岛素、溶菌酶等多种寡聚体结合，无一级序列的特异性。
单链抗体(single chain FV， ScFv)是一个重要的基因工程抗体，是在DNA水平上利用基因工程方法使抗体重链可变区(VH)基因和轻链可变区(VL)基因通过一段约5 25个氨基酸(linker)的连接肽连接形成的重组蛋白。单链抗体的C末端可以引入半胱氨酸尾、酪蛋白激酶底物尾、E尾等结构，有助于标记和偶联其它分子，也可以引入钙调蛋白尾、c-myc尾、葡萄球菌A蛋白尾、脂类标签、组氨酸尾等，使表达产物易于检测和纯化。
单链抗体具有自身的 一 系列特点
(1 )只含有抗体的V区，能保持较完整的抗原结合位点；
(2) 缺乏Fc段，不与非靶细胞结合，有利于作为药物导向载体用于临床；
(3) 免疫原性低，用于人体不易产生抗异种蛋白反应；
(4) 分子量小，容易穿透血管壁、组织及实体瘤；
(5) 体内血循环半衰期短，易从血循环中排除；
(6) 在其基因的3，端连接适当的目的分子，如酶、毒素、药物等可构建双功能抗体；
(7) 只与抗原结合，不激活补体介导细胞免疫；
(8) 易于基因操作和基因工程大量生产。
近年，单链抗体已逐渐成为基因工程抗体研究领域中的热点之一，在疾病的临床诊断和治疗方面显示出了巨大的潜力。
目前，国际上仅见有一个关于特异结合A-beta寡聚体的单链抗体scFv的报道(ZameerA等，2008, J Mol Biol. 384:917-928 ),该scFv与A-beta寡聚体 的亲和力较低。另有一类抗体NU1、 NU2和NU4虽与A-beta单体结合不明显， 但是它们可以同时与A-beta寡聚体和丝状体结合，从而影响对样品中A-beta寡 聚体的检测(参见Lambert等，2007， Journal of neurochemistry 100, 23-35 )。
到目前为止，国内尚未见特异结合A-beta寡聚体的单克隆抗体或单链抗体的报 道。
发明内容
本发明解决了现有抗体同时与A-beta单体、寡聚体和丝状体结合的技术问 题,应用噬菌体显示技术成功地筛选出特异与A-beta寡聚体结合，而不与A-beta 单体和丝状体结合的单克隆抗体。本发明所述单克隆抗体与A-beta寡聚体特异 性结合的特性与A-beta —级结构无关，其通过与A-beta寡聚体所特有的空间立 体抗原表位结合而发挥作用。
本发明所述的A-beta寡聚体是由二个到几十个不等的A-beta单体聚集形成 的寡聚体，分子间主要以氢键和疏水键相结合，分子量从9kDa至100kDa不等。 其空间立体抗原表位迄今为止尚未有人探讨清楚。
一方面，本发明提供一种特异性结合A-beta寡聚体的单克隆抗体，包含重 链可变区和轻链可变区，重链可变区含有SEQIDNO.l、SEQ IDN0.2和SEOID NO.3所示的氨基酸序列，轻链可变区含有SEQIDN0.4、 SEQ ID NO.5和SEQ IDNO,6所示的氨基酸序列。
本发明所述"抗体"应该解释为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意 特异性结合因子。因而，这个术语涵盖了与之同源的抗体片段、衍生物、人源 化抗体以及抗体的功能等同物和同源物，也包括含有抗原结合结构域的任何多 肽，无论是天然的还是合成产生的。抗体的实例是免疫球蛋白亚型(如IgG， IgE, IgM, IgD和IgA)及其亚型亚类；也可以是包含抗原结合结构域的片段如Fab、 scFv、 Fv、 dAb、 Fd;和双链抗体(diabodies)。融合至另一多肽的、包含抗原结
5包括在其中。嵌合抗体的克隆与表达在
EP. A-0120694和EP. A. 0125023中描述。
抗体可以通过许多方式修饰，可用DNA重组技术来产生保留原来抗体特 异性的其它抗体或嵌合分子。这种技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋白可变 区或互补性决定区(CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框 架区。参见，EP. A. 184187, GB2188638A或.EP. A. 239400。还可以对 杂交瘤细胞或产生抗体的其它细胞进行遗传突变或其它改变，这可以改变或者 不改变所产生抗体的结合特异性。
本发明提供的单克隆抗体可以是人源化的抗体，其还含有人抗体的框架区。
本发明提供的单克隆抗体还可以是单链抗体。
在本发明的具体实施方式
中，本发明提供特异性结合A-beta寡聚体的单链 抗体W20,其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，其重链可变区含有SEQ ID NO.l、 SEQIDN0.2和SEOIDNO.3所示的氨基酸序列，轻链可变区含有SEQ ID NO.4、 SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
本发明所述单克隆抗体包含重链和轻链"可变区"，本文所用的术语"可 变"表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体 对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均勾地分布在整个抗体可变 区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区或高度变区中的三个片段 中。可变区中较保守的部分称为框架区(FR)。每条链中的CDR通过FR区紧密 地靠在一起并与另 一链的CDR —起形成了抗体的抗原结合部位。
本发明所述单克隆抗体除了重链和轻链中的高度可变区CDR1、 CDR2和 CDR3和连接序列外，其它为框架区。框架区可在结合所需的三维结构不受影 响的条件下被其他序列置换，抗体特异性的分子基础主要来自于它的高度可变 区CDR1、 CDR2和CDR3，这些区域是与抗原结合的关键部位。为维持优选的 结合特性，CDR的序列应尽可能保留，然而，可能需要一些氨基酸改变使结合 特性最优化，本领域的技术人员可以用标准做法来达到此目的。在本发明的具体实施方式
中，随机将W20框架区 一个或几个氨基酸分别突
变、缺失或往框架区添加一个或几个氨基酸不影响抗体活性。如将81L突变为 A,将177A突变为G形成的抗体W20-1(其氨基酸序列如SEQ IDNO. 8所示)， 其活性不受影响；或将119G和213Q缺失，或在43P后加入G,或在244A后 加入A均不影响抗体活性。
将W20高度可变区内 一个或几个氨基酸分别突变、缺失或往高变区添加一 个或几个氨基酸有时不影响抗体活性，如将56L突变为A,将102T突变为G 形成的抗体W20-2(其氨基酸序列如SEQ ID NO. 9所示)，其抗体活性不受影 响；将103S和184K缺失，或在62Y后加入Q,或在189Q后加入G不影响抗 体活性。
本发明所述单克隆抗体，是从在噬菌体表面分别表达有上亿种单链抗体的噬 菌体抗体文库中分离获得。即将A-beta寡聚体包被在免疫管上，将噬菌体抗体 库加入试管中，洗去未结合到免疫管上的噬菌体，然后以胰酶洗脱结合的噬菌 体并对其进行增殖，以同样的方式进行4轮的筛选。将最后一轮洗脱下的噬菌 体转染大肠杆菌HB2151,以ELISA方法鉴定表达产生可溶性单链抗体的阳性 克隆。
本发明具体实施方式
提供的可制备单链抗体W20的阳性克隆，现已在中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(中科院微生物研究所菌种保藏中 心)进行保藏，地址为北京巿朝阳区大屯路，分类命名为大肠埃希氏菌 Escherichia coli,保藏曰期为2008年12月22曰，保藏编号为CGMCC No.2821。
用于本发明的单克隆抗体也可用杂交瘤方法制得，因为编码本发明人源化 抗体的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段，如根据本发明公开的 氨基酸序列人工合成或用PCR法扩增得到，因而也可用重组DNA方法，可用 本领域熟知的各种方法将该序列连入合适的表达载体中。最后，在适合本发明 抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞，然后本领域技术人员应用熟知 的常规分离纯化手段纯化得到本发明的单克隆抗体。在本发明的具体实施方式
中，本发明提供的特异性结合A-beta寡聚体的抗 体W20,分子量约为29 kDa。 W20与A-beta 42寡聚体之间的结合常数& = 2.91x1。3m-V1，解离常数&= 1.74x10-5 s"，亲和力常数《0= 5.99xl(T9M 。
以W20作为识别抗体，辣根过氧化酶(HRP)标记的能够与W20特异结 合的9E10作为第二抗体，用酶联免疫吸附实验(ELISA)或免疫斑点(Dot-blot) 实验能够分别检测出样品中2.2nM或5nM的A-beta寡聚体。基于本发明所述 抗体能够特异检测出样品中nmol级A-beta寡聚体的含量，本领域的普通技术 人员可以预知，所述抗体可以在科研实验及临床检测中用于检测A-beta寡聚体。
在本发明的具体实施方式
中，A-beta的聚集试验表明W20能够有效抑制 A-beta的纤维化聚集。神经细胞毒性实验表明W20可明显降低A-beta对神经 细胞的毒性作用，基于上述发现，本领域的普通技术人员可以预知该单克隆抗 体或含有该单克隆抗体的药物组合物可以通过特异性结合A-beta寡聚体，抑制 A-beta的纤维化聚集并降低A-beta对神经细胞的毒性作用，从而实现预防和治 疗老年性痴呆的目的。并且可以预知，在应用分子仅为完整抗体l/5且不含Fc 片段的W20预防和治疗老年性痴呆时，可避开完整抗体对AD病人所带来的脑 膜炎、脑出血等严重副作用。
本发明提供的药物组合物，含有药学上有效量的本发明所述单克隆抗体以
及药学上可接受的载体。本文所用的术语"药学上可接受的"是指当载体分子
本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不
良反应。本文所用的"药学上可接受的载体"应当与本发明的单克隆抗体相容， 即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物的效果，可作为药学
上可接受的载体或其组分的一些物质。具体例子可以是糖类、淀粉、纤维素及 其衍生物、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水、等渗盐溶液和磷酸盐缓冲 液等。
本发明的药物组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种 类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。
本发明所述单克隆抗体具有以下优点
1、 特异与A-beta寡聚体结合，而不与A-beta单体和丝状体结合；
2、 单克隆抗体与抗原结合特异性好，
3、 单链抗体缺乏Fc段，不与非靶细胞结合；抗体分子较小，不到完整抗 体分子的1/5,更易于穿过血脑屏障发挥疗效；
4、 A-beta聚集试验及神经细胞毒性试验表明所述抗体能够有效抑制A-beta 的纤维化聚集，并明显降低A-beta对神经细胞的毒性作用；
5、 利用噬菌体表达抗体产量高，活性强，特异性好，易于筛选。 本发明所述单克隆抗体作为临床诊断、实验检测样品中A-beta寡聚体的特
异制剂以及作为AD治疗的免疫制剂具有广阔的应用前景。
图1检测W20与A-beta寡聚体结合的ELISA实验结果图； 图2 Dot-Blot实验比较W20与各种形态A-beta的结合特性，mon表示 A-beta单体，oli表示A-beta寡聚体，fib表示A-beta丝状体； 图3 W20对A-beta42聚集抑制实验的统计结果图； 图4 W20对A-beta42细胞毒性抑制实验的统计结果图。
具体实施例方式
在详细描述本发明的实施方式之前，应当理解本发明的应用不限于下列实 施例，本发明也可以用其它实施方式执行。
实施例1 A -beta寡聚体的制备
A-beta单体(购自美国的American P印tide公司)溶解于HFIP (六氟异丙 醇，购自Sigma公司)，制备成浓度为lmg/ml的溶液。室温水洛超声处理10 分钟，分装到1.5ml离心管内，置通气橱中让HFIP完全挥发，于-20'C保存备用。
将上述处理过的A-beta室温平衡10分钟后，加入DMSO ( 二甲基亚砜， 购自Sigma ),使A-beta充分溶解，并使其终浓度为lmg/ml。取一定量的A-beta 加入到pH 7.4的PBS缓冲液中，使A-beta浓度为10|iM。将该A-beta溶液置 37。C孵育12小时后，以14000rpm离心20分钟，弃底部沉淀，即得含A-beta 寡聚体的上清液。以原子力显微镜确认上清中A-beta寡聚体的形成情况。
实施例2阳性克隆的筛选
以包被缓冲液(PBS， pH=7.4)稀释实施例l所得A-beta寡聚体至10 100|ig/mL，取4mL加入到免疫管中，4 。C包被过夜。弃上清，以PBS迅速洗管3 次。用3。/。BSA注满免疫管，室温垂直封闭2h。弃上清，以PBS迅速洗管3次。将 噬菌体抗体库(购自英国的MRC中心)悬浮于4mL3y。BSA中并加入到免疫管， 室温颠倒孵育lh后，垂直孵育lh。用0.1。/。Twenn-20的PBS洗涤10次(第二轮筛 选及其以后洗涤20次)。将PBS吸干后，加入500pL胰酶-PBS溶液洗脱噬菌体， 室温颠倒孵育10min。于1.75mL OD600-0.4的大肠杆菌TG1 (购自英国的MRC 中心)中加入250pL洗脱下来的噬菌体，37'C孵育30min,不摇动。剩余洗脱下 来的噬菌体4。C保存。分别取104、 10、吝稀释液涂于2xTY(购自Sigma公司)平板 上，37。C培养过夜。将剩余的TG1培养液4。C 11600g离心5min,用100pL培养基 重悬沉淀，涂于2xTY平板上，37。C培养过夜。
向长满细菌克隆的平板中加入2mL2xTY培养基，并用玻璃棒刮取细菌，收 集菌体悬液，取50pL加入到50mL 2xTY培养基，培养基中加入终浓度为 100pg/mL的Amp， 1%的葡萄糖(购于上海生工生物工程有限公司)，37。C摇至 OD600 = 0.4 (约需l 2h)。剩余菌液加入15%甘油，-70°(3保存。
在10mL培养物中加入5xl(T辅助噬菌体M13K07 (购自英国的MRC中心) 10(iL。37。C孵育静置30min。将菌液3000g4。C离心10min,重悬沉淀于50mL2xTY 培养基中，加入终浓度为100^ig/mL Amp， 50(ig/mL卡那霉素(购于上海生工
10生物工程有限公司)和0.1%的葡萄糖，3(TC摇床培养过夜。将过夜培养物3300g， 4'C离心15min，收集上清，加入l/4体积的PEG (聚乙二醇)(20% )和NaCl (2.5M)的混合溶液，充分混匀后4。C放置1小时以上。3300g4。C离心30min， 充分弃净上清。重悬沉淀于2mLPBS, 4'C 11600g离心10min。得到上清即为富 集第一轮后的噬菌体抗体展示文库。取lpL噬菌体上清测定滴度。
将以上富集筛选过程重复3次，即进行第二、三、四轮的筛选。
经过上述4轮富集筛选的噬菌体感染大肠杆菌HB2151 (购自英国的MRC 中心)涂到平板上，挑取单克隆到96孔细胞培养板上，每孔中加入2xTY培养 基200pL，培养基中含有100吗/mL Amp和1%的葡萄糖。37。C摇床(300r/min) 培养过夜。每孔吸取2pL菌液，加入到另外一块新的96孔细菌培养板中，每 孔添加2xTY培养基20(HiL，培养基中含有100 fig/mL Amp和1%的葡萄糖，37 。C摇床培养3h， OD600达到0.9。再向第一块板中加入一定体积甘油，甘油终 浓度为15。/。，-70。C保存。向第二块96孔板中每孔加入IPTG至终浓度lmmol/L, 3(TC摇床培养过夜。
在ELISA板中每孔加入与筛选时同浓度同体积的抗原溶液50pL, 4 'C包被 过夜，包被缓冲液为PBS, pH=7.4。以PBS洗板3次，3%BSA 37。C封闭2h， 200pL/孔。以PBS洗板3次，将上述培养物4 °C 800g离心10min,每孔取50pL 加入到ELISA板中，室温孵育lh后，用含有0.1。/。Tween-20的PBS洗涤三次。 每孔加入50pL稀释后的HRP标记的9E10 (购自美国Santa cruz公司)，稀释 比例为1: 5 000，室温孵育lh后，用含有0.1。/。Tween-20的PBS洗涤3次。每 孔加入底物溶液TMB (购自美国Amresco公司)50(iL，放置37°C 20min，然 后每孔加入lmmol/L硫酸5(HiL终止反应，置酶标检测仪测定OD值(波长 490nm) 。 OD值高于不包被A-beta寡聚体阴性对照2倍以上的克隆暂定为阳 性克隆，并测定其DNA序列做进一步的验证。
按上述步骤应用噬菌体显示技术筛选出来的阳性克隆，现已在中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心(中科院微生物研究所菌种保藏中心)进
ii行保藏，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏曰期为2008年12月 22曰，保藏编号为CGMCCNo.2821。
实施例3抗体的鉴定
将Abeta单体、寡聚体及纤维状体(Abeta单体37。C孵育4天以上，并经 原子力显微镜验证)分别点到NC(硝酸纤维素)膜3pL。将膜用5。/。BSA封闭 后，加入scFv W20孵育1小时，用PBS洗膜3次，每次5分钟。再加入1:5000 稀释的Protein A (购自美囯Santa cruz公司)孵育1小时，用PBST ( Tween-20 浓度为0.1%)洗膜3次，每次5分钟，用DAB显色。只有在A-beta寡聚体处显 示出斑点，在A-beta单体和纤维状体中不显示斑点的克隆才为所需要的克隆。
将上述阳性克隆进行测序鉴定，符合抗体库中抗体基本结构的克隆则为完 整的单链基因工程抗体。测序引物为
LMB3: 5' —CAG GAA ACA GCT ATG AC—3'(其核苷酸序列如 SEQIDNO. 10所示)
pHEN seq: 5 ' — CTA TGC GGC CCC ATT CA—3'(其核苷酸序列如 SEQIDNO. 11所示)
实施例4抗体W20的制备和纯化
(1) 菌种培养
培养基组成为2xYT培养基，100pg/mLAmp(氨节青霉素)(购自上海生 工生物工程有限公司)，1%的葡萄糖。将筛选鉴定的菌种接入5mL培养基培 养过夜，再转入500 mL培养基，37。C培养3h,加入IPTG (异丙基硫代半乳 糖苷)(购自上海生工生物工程有限公司)至终浓度为lmM， 30。C培养过夜。
(2) 抗体的纯化
将培养物4 。C,12 000 g离心45min,将上清用0.45 [xm和0.22 的过
12滤膜真空过滤，充分除去细菌碎片和其他杂质，用VivaFlow50膜包浓縮上清至 150 mL。以PH7.4、 0.15 M PBS平衡GE公司的rProtein A亲和层析柱，样品 上柱后以0.3 M pH 3.0醋酸钠作为洗脱液进行洗脱，每只收集管收集0.5-1 ml。 洗脱产物在pH 7.4的PBS中4°C透析过夜。然后以常用的SDS凝胶电泳进行 纯度检测(抗体分子量约29KD)，以BCA试剂盒或其它常用方法测定纯化后 抗体的蛋白浓度。该抗体目前的产率为40mg/L。将抗体以小体积分装，并于 -20°C保存。
实施例5抗体亲和常数&和结合常数&的测定
利用表面等离子共振法(SPR)对抗体^进行测定。在检测芯片(CM5)(购自 瑞典Biacore公司)上固定A-beta寡聚物，并用HEPES缓冲液平衡过夜，将W20 用HEPES缓冲液稀释成不同浓度梯度。检测时上样量为35pL，流速为5pL/min， 上样后数据滞后时间为120秒，并检测蛋白结合信号，最后用BIAcore公司分 析软件读取数据并计算各抗体的i^值。测得W20与A-beta42寡聚体之间的结 合常数2.91xl。3]Vr1 s",解离常数1.74x10-5 s",亲和力常数《D = 5.99xlO-9M 。
实施例6 ELISA检测W20与A-beta寡聚体的结合。
将不同浓度的A-beta寡聚体包被酶联免疫微孔板，置37°C 2h，以3% BSA 37。C封闭2h, 200mL/孔。以pbs洗板3次，加入W20 ( 5|iig/ml)室温孵育lh 后，用含有0.1。/。Tween-20的PBS洗涤三次。每孔加入lOO^iL稀释后的酶标二 抗(HRP-9E10)，稀释比例为1: 5 000,室温孵育lh后，用含有0.1%Tween-20 的PBS洗涤3次。每孔加入底物溶液TMB 100pL，放置37 20min。C，然后每 孔加入lmmol/L硫酸终止反应，于酶联免疫检测仪上测定OD值(波长490nm) (*P<0.01)。结果如图l所示，显示W20能够检测出样品中2.2nM(相当于 每孔6.25ng)的A-beta寡聚体。实施例7 Dot-blot检测W20特异结合A-beta寡聚体
1) 将含有浓度为5nM的A-beta寡聚体的样品2 pl点到硝酸纤维膜上，置空气中晾干。
2) 以5%脱脂奶粉封闭膜，置室温2小时。
3) 将膜放入到含有scFv W20 ( 1 ng/ml)的PBS溶液或对照抗体4G8 (购自美国Signet公司)中孵浴，置37 °C 1小时。
4) 以含0.05。/。Tween-20的PBS洗涤膜3次，每次5分钟。
5) 将膜加入到1: 1000稀释的HRP标记的9E10 (购自美国Santacruz公司)，或HRP标记的Protein A(l:5000)置37 。C 1小时
6) 洗涤同4。
7) 将膜加入到DAB溶液中显色数分钟。
结果如图2所示，对照抗体4G8具有能够结合A-beta单体的特性，在A-beta42聚集成寡聚体和丝状体后，4G8仍然与它们结合，而W20只能与A-beta
寡聚体结合。
实施例8 W20对A-beta42聚集的抑制作用。
加入或不加入W20抗体的10pM A-beta42于37°C孵育28h。将180^iL ThT(硫磺素)溶液(以pH6.5 PB缓冲液配制)加到96孔黑色微孔板，并加入20pL上述样品，混合均勻，再于多功能酶标仪上以450nm为激发波长，480nm为发射波长测定样品荧光强度。荧光强度表示样品的聚集程度，即荧光强度越高其聚集程度越大。结果图3所示，与不加抗体的A-beta42相比较，加入0.25和l|iM W20后的A-beta42荧光强度明显降低(* PO.01 ),表明W20对A-beta42的聚集有明显的抑制作用。
实施例9 W20对A-beta42细胞毒性的抑制作用。
用含10%胎牛血清的培养基(MEM)将神经母细胞瘤(SH-SY5Y)配成单个细胞悬液，以每孔7000个细胞接种到96孔细胞培养板，每孔体积10(^L。细胞于37。C培养24小时，培养箱C02浓度为5。/。。每孔加入样品，分为三组，分别为A-beta42与scFvW20的混合物、A-beta42组以及不加样品的细胞做为对照组，A-beta42蛋白的终浓度是lumol/L, scFv W20的终浓度也是lnmol/L。细胞继续培养48小时后，每孔加MTT溶液(5mg/mL) IO^lL, 37。C孵育3小时，终止培养，每孔加100mol/LMTT溶解液(含10 % SDS and 5 °/。异丁醇的0.01NHC1), 37。C孵育过夜，使结晶物充分溶解。选择450nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值。以加入样品后的各光吸收值除以不加样品的光吸收值为纵坐标，统计结果如图4所示，A-beta42的加入对细胞产生明显的毒性，而W20可以抑制这种细胞毒性(*P<0.05)。
实施例10抗体W20突变形成的抗体W20-l、 W20-2活性实验
按照前述实验方法，将抗体W20替换为其个别氨基酸突变而形成的抗体W20-l (其氨基酸序列如SEQ ID NO. 8所示)、W20-2 (其氨基酸序列如SEQ IDNO. 9所示)，进行AP的聚集试验及神经细胞毒性试验，结果表明W20-l、 W20-2同样能够有效抑制Ap的纤维化聚集并明显降低Ap对神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的毒性作用。以W20-l、 W20-2作为识别抗体，以酶联免疫吸附实验(ELISA)或免疫斑点(Dot-blot)作为实验方法，以辣根过氧化酶(HRP)标记的能够与W20特异结合的9E10作为第二抗体，同样能够分别检测出样品中nM级的Ap寡聚体。
15SEQUENCE LISTING
<110>清华大学
<120>与A-beta寡聚体特异性结合的基因工程单克隆抗体
<130> 090111
<160> 11
<170> Patentln version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> VH-CDRl
<400> 1
Ser Tyr Ala Met Ser1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> VH-CDR2
<400> 2
Gly lie Ser Asn Leu Gly Leu Thr Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys15 10 15
Gly
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> VH-CDR3
<400> 3
Thr Thr Ser Arg Phe Asp Tyr1 5
<210> 4<211> 11<212> PRT<213> VL-CDR1
<400> 4
Arg Ala Ser Gin Ser lie Ser Ser Tyr Leu Asn1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> VL-CDR2
<400> 5
Lys Ala Ser Tyr Leu Gin Ser1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> VLCDR3
<400> 6
Gin Gin Thr His Arg Pro Pro Val Thr1 5
<210> 7
<211> 244
<212> PRT
<213> antibody W20
<400> 7
His Gly Arg Gly Ala Ala Val Gly Val Trp Gly Arg Leu Gly Thr Ala15 10 15
Trp Gly Val Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser20 25 30
Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu35 40 45
Trp Val Ser Gly He Ser Asn Leu Gly Leu Thr Thr Gly Tyr Ala Asp50 55 60
17Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr85 90 95
Tyr Cys Ala Lys Thr Thr Ser Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Thr Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser130 135 140
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser
145 150 155 160
Gin Ser lie Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys
165 170 175
Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Lys Ala Ser Tyr Leu Gin Ser Gly Val180 185 190
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr195 200 205
lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin210 215 220
Thr His Arg Pro Pro Val Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie
225 230 235 240
Lys Arg Ala Ala
<210> 8<211> 244<212> PRT
<213> antibody W20-l
<400> 8
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Trp Gly Val Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30
Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45
Trp Val Ser Gly He Ser Asn Leu Gly Leu Thr Thr Gly Tyr Ala Asp 50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 卯 95
Tyr Cys Ala Lys Thr Thr Ser Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Thr Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser 130 135 140
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser
145 150 155 160
Gin Ser He Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys
165 170 175
Gly Pro Lys Leu Leu lie Tyr Lys Ala Ser Tyr Leu Gin Ser Gly Val 180 185 190Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 195 200 205
He Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 210 215 220
Thr His Arg Pro Pro Val Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie
225 230 235 240
Lys Arg Ala Ala
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<211> 244
<212> PRT
<213> antibody W20-2
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His Gly Arg Gly Ala Ala Val Gly Val Trp Gly Arg Leu Gly Thr Ala 15 10 15
Trp Gly Val Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30
Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45
Trp Val Ser Gly lie Ser Asn Ala Gly Leu Thr Thr Gly iy r Ala Asp 50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
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Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95
Tyr Cys Ala Lys Thr Gly Ser Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Thr Asp Ik Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser 130 135 140
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser
145 150 155 160
Gin Ser He Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys
165 170 175
Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Lys Ala Ser Tyr Leu Gin Ser Gly Val 180 185 l卯
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 195 200 205
lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 210 215 220
Thr His Arg Pro Pro Val Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie
225 230 235 240
Lys Arg Ala Ala
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<211> 17
<212> DNA
<213> 引物LMB3
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<210> 11
<211> 17
<212> DNA
<213> 引物pHENseq
<400> 11 ctatgcggcc ccattca
17
1权利要求
1. 一种单克隆抗体，其特征在于，其重链可变区含有SEQ ID NO.1、SEQ IDN0.2和SEO ID NO.3所示的氨基酸序列，轻链可变区含有SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
2. 根据权利要求l所述的单克隆抗体，其特征在于，是人源化抗体。
3. 根据权利要求l所述的单克隆抗体，其特征在于，是单链抗体。
4. 根据权利要求3所述的单克隆抗体，是由SEQIDN0.7所示的其氨基酸序 列组成的蛋白质，或由SEQIDN0.7所示的氨基酸序列经过取代、缺失、 或添加一个或几个氨基酸衍生的且具有特异性结合A-beta寡聚体活性的蛋 白质。
5. 根据权利要求4所述的单克隆抗体，其氨基酸序列如SEQIDN0.8所示。
6. 根据权利要求4所述的单克隆抗体，其氨基酸序列如SEQIDN0.9所示。
7. 根据权利要求4所述的单克隆抗体，其特征在于，由保藏编号为CGMCC No.2821的大肠杆菌菌株产生。
8. 权利要求1至7任一项所述的单克隆抗体在检测A-beta寡聚体中的应用。
9. 权利要求1至7任一项所述的单克隆抗体在制备抗老年性痴呆药物中的用 途。
10. —种药物组合物，其特征在于，含有有效量的权利要求1-7任一项所述的 单克隆抗体及药学上可接受的载体。
全文摘要
本发明涉及基因工程抗体技术领域，提供一种单克隆抗体，其重链可变区含有SEQ ID NO.1、SEQ ID N0.2和SEO ID NO.3所示的氨基酸序列，轻链可变区含有SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。本发明还具体提供一种人源化单链抗体，由保藏编号为CGMCC No.2821的大肠杆菌基因工程菌株产生，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。本发明所述抗体可与A-beta寡聚体特异性结合，有效抑制A-beta的纤维化聚集，并明显降低A-beta对细胞的毒性作用。本发明还涉及含有该抗体的药物组合物。本发明所述抗体活性强，特异性好，易于制备，具有广阔的实验应用和临床应用前景。
文档编号C07K16/18GK101463082SQ200910076990
公开日2009年6月24日 申请日期2009年1月16日 优先权日2009年1月16日
发明者刘瑞田, 王小平 申请人:清华大学