专利名称：表没食子儿茶素没食子酸酯在抗肿瘤药物中应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及表没食子儿茶素没食子酸酯的用途。
MDR的逆转剂与抗癌药物合用，将会大幅度地提高化疗药物对MDR肿瘤的疗效。尽管许多化合物或药物具有体外逆转MDR的作用，但由于毒副作用很大，无临床应用价值。作为临床应用的MDR逆转剂的药物，至今尚未开发成功。因此，寻找低毒、不易产生MDR的物质或有效的MDR逆转物质是肿瘤化疗治疗领域急需解决的难题，也具有重要的经济效益和社会效益。
技术方案1，确立EGCG对MDR靶细胞的细胞毒性作用的参数。
用DMEM培养液稀释EGCG成10-100μg/ml。采用噻唑蓝(MTT)快速比色法测定EGCG对MDR靶细胞的细胞毒性作用。将对数生长期MDR靶细胞104cell·ml-1接种于96孔培养板，每孔0.2ml，分别加入10-100μg/ml浓度的EGCG处理，每浓度平行4孔，对照组加等量体积的培养液，置37℃，5％CO2及饱和湿度的培养箱培养1-4天，实验终止前4小时每孔加入5mg·ml-1MTT 10μl，培养结束后每孔加入0.04N DMSO(二甲基亚砜)，每孔150μl，振荡10min，是MTT还原产物完全溶解，用BioRad 550型酶标仪，以550nm为实验波长，655nm为参照波长测定其吸收度，计算MDR靶细胞的存活率和药物对MDR靶细胞的抑制率，并以药物的不同浓度和细胞的存活率作图，确定细胞的半数抑制浓度(IC50)参数。
2，用EGCG提高MDR靶细胞对治疗药物的敏感性和增加治疗药物效用，参照上述细胞的半数抑制浓度(IC50)，将对数生长期MDR靶细胞104cell·ml-1接种于96孔培养板，每孔0.2ml，先分别加入半数抑制浓度以内的EGCG处理MDR靶细胞，然后加入作为代表的抗癌药阿霉素，浓度范围为0-32μg/ml，每组平行4孔，可以提高多药抗药性癌细胞株对化疗药物的敏感性，增强化疗药物的作用效果，本发明的显著的优点和技术上的进步本发明提供的肿瘤化疗药物增敏剂和增效剂，克服了EGCG的传统用途，将其作为新型的肿瘤化疗药物增敏剂和增效剂，可以提高多药抗药性癌细胞株对化疗药物的敏感性，增强化疗药物的作用效果，具有良好的应用前景。
EGCG购自Sigma公司，用DMEM培养液稀释成所需浓度。采用噻唑蓝(MTT)快速比色法测定EGCG对MDR细胞(KB-A-1)和药物敏感性细胞(KB-3-1)的细胞毒性作用。将对数生长期细胞104cell·ml-1接种于96孔培养板，每孔0.2ml，分别加入一定浓度的TP和EGCG处理，每浓度平行4孔，对照组加等量体积的培养液，置37℃，5％CO2及饱和湿度的培养箱培养1-4天，实验终止前4小时每孔加入5mg·ml-1MTT 10μl，培养结束后每孔加入0.04N DMSO(二甲基亚砜)，每孔150μl，振荡10min，是MTT还原产物完全溶解，用BioRad550型酶标仪，以550nm为实验波长，655nm为参照波长测定其吸收度，计算肿瘤细胞的存活率和药物对细胞的抑制率，并以药物的不同浓度和细胞的存活率作图，确定细胞的半数抑制浓度(ICS0)。实验结果如下表1.不同浓度EGCG不同作用时间下对KB-3-1的抑制率药物浓度 抑制率(％)(μg/ml) 24h 48h 72h 96h00±0.082 0±0.094 0±0.097 0±0.12810 7.40±0.095 10.19±0.093 21.54±0.184 32.45±0.11920 30.86±0.106 34.50±0.147 42.02±0.136 44.12±0.15130 43.70±0.127 46.18±0.136 50.06±0.105 69.15±0.13740 49.49±0.108 52.53±0.153 61.32±0.139 74.81±0.15850 52.32±0.117 56.36±0.129 68.38±0.144 82.79±0.15460 54.05±0.135 63.64±0.191 68.91±0.154 83.33±0.08870 55.86±0.118 64.07±0.138 70.25±0.182 86.40±0.173IC50(μ 41.43 36.50 27.49 26.80g/ml)
表2.不同浓度EGCG不同作用时间下对KB-A-1的抑制率EGCG浓度抑制率(％)(μg/ml) 24h 48h 72h 96h0 0±0.099 0±0.166 0±0.091 0±0.16410 2.77±0.184 4.85±0.125 5.33±0.155 5.78±0.14520 3.46±0.192 11.19±0.085 32.03±0.109 33.07±0.13730 15.67±0.135 24.62±0.166 41.35±0.116 52.89±0.11140 16.23±0.146 37.90±0.122 52.84±0.147 65.92±0.15850 18.1±0.132 42.74±0.172 55.21±0.144 67.97±0.12660 26.68±0.055 51.45±0.178 63.03±0.059 80.32±0.142IC50(μ 158.42 59.97 32.66 27.89g/ml)以上实施例说明，EGCG均具有良好的杀灭肿瘤细胞的作用，不论是对多药抗药性细胞还是药物敏感细胞都可产生相同的抑制效果，而且这利抑制效果还具有剂量依赖性，并随着作用时间的延长而程度加深效果加强。
实施例2EGCG与传统的肿瘤化疗药物耐药倍数比较。
采用MTT法(具体实验操作参照实施例1)考察三种临床上较为常用的抗癌药物阿霉素、秋水仙素和长春花碱不同浓度一定作用时间下(三天)对KB-3-1和KB-A-1的细胞毒性，以药物的不同浓度和细胞的存活率作图，确定细胞的半数抑制浓度，计算耐药倍数(resistance factor，RF＝IC50(KB-A-1)/IC50(KB-3-1))，并将EGCG相同作用时间下与这三种传统的肿瘤化疗药物耐药倍数进行比较。实验结果见图3、图4、图5及下表
表3 EGCG与传统的肿瘤化疗药物耐药倍数比较IC50(ng/ml) Dox Col Vin EGCGKB-3-169.48 6.89 37.8927490KB-A-18320 770 2610 32660Resistance factor 119.75111.76 68.881.19以上实施例说明，KB-A-1细胞具有非常明显的抗药性而KB-3-1对药物的反应却非常敏感。Ng数量级浓度的药物即可起到杀灭KB-3-1的作用，但要达对KB-A-1到同样的抑制效果药物浓度却要至少提高70倍。与之相比较的EGCG，不同浓度的EGCG相同作用时间下对敏感型细胞株和抗药型细胞株的影响趋势基本一致。将EGCG不同作用时间下对敏感型细胞株和抗药型细胞株的半数抑制浓度对比，发现它们对两细胞株的抑制效果无太大区别，说明EGCG对癌细胞的抑制效果在敏感型菌株和抗药型菌株都能收到良好的效果，说明在不产生耐药性方面优于传统药物。
实施例3EGCG对阿霉素抗癌效果的影响将对数生长期细胞104cell·ml-1接种于96孔培养板，每孔0.2ml，先分别加入40μg/ml 10μg/ml EGCG处理，然后加入阿霉素，浓度范围为0-32μg/ml，每组平行4孔，对照组加等量体积的培养液，置37℃，5％CO2及饱和湿度的培养箱培养培养3天，实验终止前4小时每孔加入5mg·ml-1MTT 10μl，培养结束后每孔加入0.04N DMSO(二甲基亚砜)，每孔150μl，振荡10min，是MTT还原产物完全溶解，用BioRad 550型酶标仪，以550nm为实验波长，655nm为参照波长测定其吸收度，求出半数抑制浓度(IC50)，计算逆转倍数(reversal index.RI)。实验结果见图6。
从图6可以看出经过10μg/ml的EGCG处理后，耐药细胞株KB-A-1对阿霉素的IC50从10.35μg/ml降到了5.45μg/ml逆转倍数分别达到了1.90。经过无细胞毒性的EGCG与阿霉素共同作用后，细胞的存活率由单独使用阿霉素的55.77％分别下降到40.31％，而且这种增敏作用非常明显而且不是经过累加作用得到的。由此可以得出茶类提取物质具有提高多药抗药性细胞株对抗癌药物敏感性的作用，即可以逆转多药抗药性。
权利要求
1.表没食子儿茶素没食子酸酯在抗肿瘤药物中应用，其特征在于，表没食子儿茶素没食子酸酯作为抗肿瘤药物的增敏剂和增效剂。
全文摘要
本发明将茶中提取主要成分为表没食子儿茶素没食子酸酯((－)－epigallocatechin gallate，EGCG)应用于治疗肿瘤药物中。该提取物不仅能抑制肿瘤细胞增殖、同时具有使肿瘤细胞不易产生耐药性和提高肿瘤细胞对治疗药物的敏感性作用。本发明提出该天然提取物可作为抗肿瘤药物的增敏剂和增效剂。
文档编号A61P35/00GK1444935SQ0211162
公开日2003年10月1日 申请日期2002年5月9日 优先权日2002年5月9日
发明者魏东芝, 刘建文, 梅郁盈 申请人:华东理工大学