专利名称：缺失型人β干扰素及其重组制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及DNA重组技术和药物领域，涉及重组缺失型人β干扰素， 含编码该缺失蛋白的DNA序列，含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞，用于基因工程制备该蛋白的方法，以及该蛋白在治疗疾病领域的应用。
背景技术：
人β干扰素是成纤维细胞和上皮细胞产生的一类具有广泛生物学活性，包括抗病毒、抗肿瘤以及免疫调节作用的重要细胞因子(KozovsKa ME, et al. Neurology〔J〕，1999，53 :1692-1697)，具有 5 个 α 螺旋和 22KDa 的分子量，其中 β 干扰素-Ib 无糖基化，其分子量为 18KDa(Arduini，et al. Protein Science (J), 1999,8 1867-1877)。目前人β干扰素分为β干扰素-Ia和β干扰素_lb，其中β干扰素-Ia是天然结构，包含有糖基化结构，而β干扰素-Ib是将17位的Cys突变成Ser而成，且N端不含甲硫氨酸，由 165 个氨基酸组成(Goodkin DE, et al. Lancet〔J〕，1994，344 :1057-1060)。 大量研究表明，人β干扰素可在大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞中实现稳定高效的表达 (Jacobs L，et al. Curr Opin Neuro〔J〕，1994，7 :250-254)。1993 年以来国外已批准多种重组β干扰素上市用于治疗多发性硬化症(multiplesCler0SiS，MS)。国外用于临床的IFN-β有IFN-β-Ia和IFN-β-Ib两种类型，均系基因重组产品。β干扰素作为治疗多发性硬化症的药物已经在国外上市的有先灵公司的Betaferon、 诺华欧化公司的Extavia以及雪兰诺公司的Rebif和Biogen公司的Aronex。其中先灵公司的Betaferon和诺华欧化公司的Extavia属于IFN-β _lb，通过在E. coli中以包涵体形式表达的重组人β干扰素_lb，工艺中需经SDS变性后再复性。而雪兰诺公司的Rebif和 Biogen &司的 Aronex ^lil CHO (Chinese hamster ovary) ^iiWMSA IFN—β —la。 i 组IFN-β -Ib和IFN-β -la在结构与生物活性方面存在明显的差异，主要表现为CHO表达的IFN-β -Ia的体外抗病毒比活性高于大肠杆菌包涵体表达制备的IFN-β -lb。本发明提供了一种缺失型人β干扰素突变体Δ Il-IFN-β及其表达制备的方法， 制备的蛋白不仅溶解性更好、稳定性更高，同时具有更高的抗病毒活性。发明目的目前人β干扰素-lb(IFN-β-lb)在大肠杆菌中以包涵体的形式表达，工艺中需用SDS先变性后再复性，制备工艺相对复杂，且含有SDS的残留，其抗病毒比活性仅为2X 107IU/mg ；人β干扰素-la(IFN-β-la)是以CHO细胞为宿主细胞表达的有糖基化的糖蛋白，抗病毒比活性为 2X108IU/mg(Laura Runkel，et al. Pharmaceutical Research 〔J〕，1998，15 :641-649)。本发明重组制备的缺失型人β干扰素突变体与天然结构比具有溶解性更高、 稳定性更好的优势。制备的重组缺失型人β干扰素突变体包括All-IFN-^-Ia和 Δ Il-IFN- β -lb。其中，Δ Il-IFN- β -Ib采用大肠杆菌以融合表达的方式表达制备，其N端第1位氨基酸可替换为甘氨酸(Gly)或精氨酸(Arg)或甲硫氨酸(Met)，第6位氨基酸为丝氨酸Ger)；而All-FN_i3-la可采用酵母细胞或CHO细胞表达制备，其N端第1位氨基酸可替换为甘氨酸(Gly)或精氨酸(Arg)或甲硫氨酸(Met)，第6位氨基酸为半胱氨酸(Cys)。 其次，该重组缺失型人β干扰素突变体蛋白的第1位氨基酸前可带有甘氨酸(Gly)或精氨酸(Arg)或甲硫氨酸(Met)。
构建的表达Δ Il-IFN-β-Ib的工程菌经发酵罐扩大培养后，加入IPTG诱导后收集菌体。在特定的破菌缓冲液中破菌后离心收集上清，通过M柱纯化回收融合蛋白， 经特定的蛋白酶酶切后通过离子交换和反相C18柱精纯化，制备的重组All-IFN-i3-lb 抗病毒生物学比活性达到7.3X107IU/mg以上。构建的表达Δ Il-IFN-β-Ia酵母细胞或CHO细胞株经扩大培养后分泌表达的Δ Il-IFN-β-la,经进一步的分离纯化制备的 Δ Il-IFN-β -Ia抗病毒生物学比活性分别达到3. 1 X 108IU/mg和4. 3X108IU/mg以上。本发明的目的在于提供一种缺失型人β干扰素突变体(包括Δ Il-IFN-β -Ib和 Δ Il-IFN-β-la)并进行有效的重组制备。还提供了编码所述缺失型人β干扰素突变体蛋白的DNA分子、含该DNA序列的载体以及含该载体的宿主细胞。本发明的另一目的提供一种缺失型人β干扰素突变体的制备工艺，获得抗病毒比活性更高的缺失型人β干扰素突变体蛋白的方法。本发明的另一目的是提供一种可用于治疗病毒性疾病如病毒性丙型肝炎或乙型肝炎，或者免疫性疾病如多发性硬化症的重组缺失型人β干扰素突变体蛋白。发明概述在本发明的第一方面，提供了一种缺失型人β干扰素突变体蛋白为N 端缺失 11 个氨基酸的 Δ Il-IFN-β (包括 Δ Il-IFN-β-Ia 和 Δ Il-IFN-β-lb)。在本发明的第二方面，提供了一种在大肠杆菌中通过与TRX融合表达的融合蛋白，更具体的，该融合蛋白中包含不同的Linker，在Linker中设计不同的蛋白酶酶切位点， 包括EK、TEV、thrombin、凝血因子)(a等。所述Δ Il-IFN-β-Ib蛋白具有以下结构首先， 第1位氨基酸可替换为甲硫氨酸(Met)或甘氨酸(Gly)或精氨酸(Arg)，第6位氨基酸为丝氨酸(Ser)；其次，第1位氨基酸前可带有(Met)或甘氨酸(Gly)或精氨酸(Arg)。在本发明的第三方面，提供了一种在酵母细胞或CHO细胞中表达的重组 Δ Il-IFN-β-Ia蛋白，所述重组Δ Il-IFN-β-Ia蛋白具有以下结构首先，第1位氨基酸可替换为甲硫氨酸(Met)或甘氨酸(Gly)或精氨酸(Arg)，第6位氨基酸为半胱氨酸(Cys)， 第69位氨基酸的天(门)冬酰胺被糖基化修饰；其次，第1位氨基酸前可带有(Met)或甘氨酸(Gly)或精氨酸(Arg)。在本发明的第四方面，提供了编码本发明上述的重组缺失型人β干扰素-Ia和Ib 突变体蛋白的DNA分子。在本发明的第五方面，提供了含有上述DNA分子的载体，以及构建该表达载体的方法。在本发明的第六方面，提供了一种适合特异性载体的宿主细胞(包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等；常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、CHO细胞、COS细胞、C-127细胞、BHK细胞、大鼠H印I细胞、大鼠H印II细胞、 TCMK细胞、人肺细胞、HEK293细胞等；常用的昆虫细胞如蚕培养细胞等)。以及可以通过公知的方法将含有目的基因的DNA序列的载体转移到宿主细胞内。在本发明的第七方面，提供了包含上述表达载体的宿主细胞以及可能的转化或转染的方法。在本发明的第八方面，提供了一种重组产生本发明重组缺失型人β干扰素突变体蛋白的方法，它包括以下步骤在适合表达所述重组缺失型人β干扰素突变体的条件下，培养上述的宿主细胞，表达出所述的重组缺失型人β干扰素突变体蛋白，经分离纯化制备重组缺失型人β干扰素突变体蛋白的方法。在本发明的第九方面，提供了一种重组产生本发明中大肠杆菌表达的融合蛋白， 通过不同蛋白酶酶切的方法，以及分离纯化制备重组缺失型人β干扰素-Ib突变体蛋白的方法。在本发明的第十方面，提供了一种重组产生本发明中酵母表达的缺失型人β干扰素-Ia突变体蛋白，通过分离纯化制备缺失型人β干扰素-Ia突变体蛋白的方法。在本发明的第十一方面，提供了一种重组产生本发明中CHO细胞表达的缺失型人 β干扰素-Ia突变体蛋白，通过分离纯化制备缺失型人β干扰素-Ia突变体蛋白的方法。在本发明的第十二方面，提供了一种该重组缺失型人β干扰素-Ia和-Ib突变体蛋白的药物组合物，它包括药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂。至此已对本发明进行了详细描述，参照以下实例能够对之有更清楚的理解，所述实例仅为说明目的而并不旨在对本发明进行限制。
图 1 :pET-32a-EK-Δ Il-IFN-β -Ser6 经 Kpn I 和 Hind III 双酶切验证(1-4 重组质粒 pET-32a-EK- Δ Il-IFN- β -Ser6 经 Kpn I 和 Hind III 双酶切)。图2 :A =SDS-PAGE 分析融合蛋白(TRX-EK-Δ 11-IFN-β -Ser6)表达水平(1 诱导后；2:诱导前)。B:融合蛋白TRX-EK-Δ Il-IFN-β-Ser6的EK酶酶切(1 酶切前；2 酶切 10小时；3 酶切12小时；4 酶切16小时)。图3 :A =SDS-PAGE 分析制备的 Δ Il-IFN-β -Ser6 蛋白。B =RP-HPLC 分析制备的 Δ 11-IFN-β -Ser6 蛋白。图4 体外抗病毒活性比较曲线(1 β干扰素国际活性标准品；2 TRX-EK- Δ 11-IFN- β -Ser6 ；3 Δ Il-IFN-β -Ser6 ；4 Δ Il-IFN-β -Cys6 (酵母表达)；5 Δ 11-IFN- β -Cys6 (CH0 表达))。
具体实施例方式实例1融合蛋白TRX-EK- Δ 11-IFN- β -Ser6在大肠杆菌中的重组融合表达和目的蛋白 Δ Il-IFN-β-Ser6 (SEQ ID NO :4)的制备。在本实施例中，所涉及的融合蛋白具有TRX-EK-All-IFN_i3-Ser6结构。根据 IFN-β的氨基酸序列，并按照大肠杆菌偏爱的密码子，委托宝生物(大连)有限公司进行全基因合成 Δ Il-IFN-β 的 cDNA 序歹Ij (SEQ IDNO 5)。根据设计要求合成2条引物PI、P2 Pl 5' -CGGGTACCGATGACGATGACAAGTCTTCCAATTTTCAGTCT-3' (SEQ ID NO 6)P2 5' -GCAAGCTTTCATTAGTTTCGGAGGTAACCTGT-3' (SEQ ID NO 7)注P1中CG为引物保护碱基，GGTACC为Kpn I酶切位点；P2中GC为引物保护碱基，AAGCTT为Hand III酶切位点。以人工合成Δ Il-IFN-β的cDNA序列(SEQ ID NO 5)为模板，用引物Pl和P2扩增EK-Δ Il-IFNH6 (SEQ ID NO 8)基因(Pl头部含有Kpn I酶切位点和编码肠激酶酶切位点DDDDK的核苷酸序列，Ρ2尾部含有终止密码子和Hand III酶切位点)。扩增的
5ΕΚ-Δ Il-IFN-β-Ser6(SEQ ID NO :8)基因首尾分别加入Kpn I和Hand III酶切位点，插入原核表达载体pET-32a，构建重组表达载体pET-3h-EK- Δ Il-IFN- β -Ser6。延伸PCR方法扩增EK-Δ Il-IFN-β Ier6(SEQ ID NO :8)基因的反应体系均采用PCR反应试剂盒(TAKARA，大连)，按商家的说明书设置。PCR反应条件为94°C lmin, 58°C lmin, 72°C lmin，共30个循环，第一个循环94°C变性lOmin，最后一个循环72°C延伸 lOmin，结果显示获得了 500bp(EK-All-IFN-3-Ser6) (SEQ ID NO 8)的目标条带。PCR产物经低熔点琼脂糖纯化后，用Kpn I和Hind III双酶切后，回收的目的片段与同样经Kpn I和Hind III双酶切回收的质粒pET_32a(购于hvitrogen)用 T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌克隆宿主菌ToplOF'，用双酶切验证的方法筛选重组质粒pET-32a-EK- Δ 11-IFN- β -Ser6 (附图1)，经DNA测序(TAKARA,大连)后表明，扩增的 ΕΚ-Δ Il-IFN-β-Ser6基因与设计完全一致(SEQ ID NO :8)。将上述测序正确的质粒转化大肠杆菌表达宿主菌 Origami DE3 (Novagen)，成功构建 ρΕΤ-3^ι_ΕΚ-Δ Il-IFN-β -Ser6/ Origami DE3重组工程菌。将表达最佳工程菌株划线接种于LA琼脂平板，37°C培养过夜。从过夜培养的LA 平板上挑取菌苔接种于含LB液体培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加水定容至1000mL，12rC，高压灭菌30min即可)试管中，30°C培养12小时，然后按的比例转接到含200mL LB培养液的IOOOmL三角瓶中，30°C培养过夜即成为上罐种子液。将上罐种子液按5%的比例接种于含YT培养液的30L发酵罐中，37°C培养，整过发酵过程中，通过调节转速、通空气量、通纯氧量来保持溶氧在30%以上，用的氨水调节pH并保持在7. 0。 至菌液0D600 = 10 14时，加入终浓度为0. 3mmol/L IPTG，同时下调温度为32°C，继续培养4小时后停止发酵(附图2 :A)，收集菌液，SOOOrpm离心10分钟，弃上清，收集菌体放入-20°C冰箱保存备用。从-20 V冰箱中取出菌体，放入细菌裂解液(50mmol/LTriS-HCl、l % Zwittergent3-14、pH9. 0)中溶解菌体，37°C下搅拌1小时后加入终浓度为10 μ g/ml的DNA 酶作用3小时至镜检完全破菌，12000rpm离心10分钟，弃沉淀。收集上清。粗纯化将收集的上清通过M离子螯和纯化回收融合蛋白 TRX-EK-Δ Il-IFN-β-Ser6，在透析液(50mmol/L Tris_HCl、0. 15M Nacl、pH8.0)中透析过夜。融合蛋白(TRX-EK-Δ Il-IFN-β -Ser6) EK酶酶切取透析过夜的融合蛋白，按质量比1 200加入EK酶，于4°C下酶切16小时即可，酶切效率不低于90% (附图2: 。精纯化酶切后的样品经RP-HPLC(Waters公司C18柱)纯化(流动相A液0. 1% 三氟乙酸、5%乙腈，流动相B液0. 三氟乙酸、95%乙腈)，0-100% B线性洗脱进行纯化，离子交换(SP Sepharose FF)以及 Superdex-75 (Amersham Biosciences)(缓冲为 PBS， ρΗ7· 4)凝胶柱层析获得重组Δ 11-IFN-β-Ser6 (SEQIDN0 :4)蛋白，纯度大于98. 0% (附图 3 :A、B)。实例2缺失型重组Δ Il-IFN-β-Cys6 (SEQ IDNO :1)蛋白在酵母中的重组表达和制备。在本实施例中，所涉及的缺失型重组蛋白具有All-IFN-^-Cys6的结构。根据 Δ Il-IFN-β 的 cDNA 序列(SEQ ID NO 5)设计合成 2 条引物 P3、P4
P3 5' -CGCTCGAGAAAAGATCTTCCAATTTTCAGTGTCAGAAG-3' (SEQ ID NO 9)P4 5' -CGGCGGCCGCTCATTAGTTTCGGAGGTAACC-3' (SEQ ID NO 10)注P3中CG为引物保护碱基，CTCGAG为Bio I酶切位点；P2中CG为引物保护碱基，GCGGCCGC为Not I酶切位点。以人工合成Δ Il-IFN-β的cDNA序列(SEQ ID NO 5)为模板，用引物P3和 P4扩增Δ Il-IFN-β-Cys6(SEQ ID NO :11)基因(P3头部含有Xho I酶切位点，P4尾部含有终止密码子和Not I酶切位点)，用)(ho I和Not I双酶切后与pGAPZaA连接，构建重组质粒pGAPZ a A- Δ 11-IFN- β -Cys6,经DNA测序(TAKARA，大连)后表明，扩增的 Δ Il-IFN-^-Cys6 基因与设计完全一致(SEQ ID NO: 11)。将重组质粒用Avr II线性化，用电转仪将线性化的重组质粒 pGAPZ a A-Δ Il-IFN-β-Cys6 导入 GSl 15 毕赤酵母 Qnvitrogen)中，经 His+和 kocin 筛选，获得抗kocinlOOOmg/ml的高拷贝克隆菌。挑取表达菌，接种于5ml YPD培养基中，30°C过夜培养，转接入250ml YPD培养基中表达96小时。收集上清，经超滤后，用 SP Sepharose FF、反相 C18、SP Sepharose FF 和 Superdex-75 纯化制备重组融合蛋白 Δ Il-IFN-β -Cys6(SEQ ID NO :1)，纯度大于 97. 0%。实例3缺失型重组Δ Il-IFN-β-Cys6 (SEQ ID NO :1)蛋白在CHO细胞中的重组表达和制备。在本实施例中，所涉及的缺失型重组蛋白具有Δ Il-IFN-^-Cys6的结构。根据设计要求，委托宝生物(大连)有限公司进行全基因合成All-IFN-^-Cys6的cDNA序列(SEQ IDNO 12)ο将全人工合成All-IFN-^-Cys6的基因序列(SEQ ID NO :1 ，经 Hind III和EcoR I双酶切后与同样双酶切的质粒的ecTag2A连接构建重组质粒 pSecTag2A- Δ 11-IFN- β -Cys60 重组质粒转化大肠杆菌 jToplOF ‘，经 Hind III 和 EcoR I双酶切验证正确，DNA测序(TAKARA，大连)结果显示，扩增的Δ Il-IFN-β-Cys6基因与设计完全一致(SEQ ID而1幻。将上述测序正确的重组质粒转染CH0-k细胞，通过加压筛选获得能稳定、高效分泌表达All-IFN-i3-Cys6的细胞株。经扩大培养后通过SP Sepharose FF、Blue、反相 C18 柱、SP Sepharose FF 和 Superdex-75 等纯化方法，制备的重组 Δ Il-IFN-β-Cys6 (SEQ ID NO :1)蛋白，纯度大于 98. 0%。实例4制备的缺失型重组人β干扰素的体外抗病毒生物学活性试验采用VSV (水泡口炎病毒)病毒攻击Wish细胞病变法。按药典2005版第三部中干扰素生物活性测定方法(附录VIII)，每孔按2 X IO4个细胞铺入96孔平底培养板中培养过夜，然后将待检样品与不同稀释度的标准品分别加入已接种Wish细胞的培养板中作用 16-24小时。吸出所有培养液，将VSV用攻击培养稀释液稀释至IOOTCID5ci，加入攻击M小时。结晶紫染色冲洗后70%乙醇溶解，OD57tl测定OD值。通过与β干扰素国际活性标准品作对照，所测数据用Softmax pro5. 3软件分析。通过软件SoftmaXpro53分别计算的A值， B值，C值，D值及相关系数R~2 (表1)。同时用Softmax pro5. 3软件计算的缺失型重组人 β干扰素抗病毒比活性，结果见表2。其中干扰素国际活性标准品(NIBSC)的半效稀释倍数(Er)为90. 9，Es为测定样品的半效稀释倍数。表 权利要求
1.一种在氨基末端缺失11位氨基酸的人β干扰素突变体蛋白(SEQ ID NO :1)。
2.权利1中所述缺失型人β干扰素突变体，其氨基酸序列第6位的半胱氨酸(Cys)可替换为丝氨酸(kr)。
3.权利要求1、2中所述的缺失型人β干扰素突变体蛋白的第1位氨基酸可替换为甲硫氨酸(Met)或甘氨酸(Gly)或精氨酸(Arg)。
4.权利要求1、2中所述的缺失型人β干扰素突变体蛋白的第1位氨基酸前可带有甲硫氨酸(Met)或甘氨酸(Gly)或精氨酸(Arg)。
5.权利要求1、2、3中所述缺失型人β干扰素突变体适用于基因工程重组表达并制备， 其重组表达宿主包含大肠杆菌、哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞或植物、动物的任何一种。
6.权利要求5中所述缺失型人β干扰素突变体的重组表达和制备，指通过含有其编码的相应cDNA序列的表达载体转化相应宿主细胞，经表达筛选、培养、提取和纯化目的蛋白的过程。
7.权利要求5所述的哺乳动物细胞优选CH0，构建的含缺失型人β干扰素突变体基因序列的重组真核表达载体含有信号肽的氨基酸序列(SEQ ID NO 2)及其DNA序列(SEQ IDNO 3)。
8.权利要求1、2、3所述缺失型人β干扰素突变体可作为一种用于治疗多发性硬化症或病毒性感染疾病的药物。
全文摘要
本发明公开了一种人β干扰素的氨基末端缺失11个氨基酸的突变体(Δ11-IFN-β)以及其制备方法。Δ11-IFN-β经重组制备后具有比未缺失型更高的体外抗病毒比活性和稳定性，更适合用于治疗多发性硬化症和病毒性感染等疾病。
文档编号A61P31/12GK102260344SQ201010182659
公开日2011年11月30日 申请日期2010年5月26日 优先权日2010年5月26日
发明者刘日勇, 张淳, 罗岚, 范开, 陈清 申请人:重庆富进生物医药有限公司