专利名称：透脑屏障防治老年性痴呆的融合多肽的制作方法
技术领域：
发明属于生物医药技术领域，具体涉及能穿过血脑屏障、防治老年性痴呆的神经 营养因子多肽类药物。老年性痴呆是最常见的神经退行性病，严重威胁人类健康的疾病，其病理学特征 是大量神经元内形成以过度磷酸化的微管相关蛋白tau为主要成分的神经原纤维缠结 (neurofibrillary tangles, NFTs)及由 β-淀粉样多肽(β-amyloid, A β )沉积与神经元 外形成的大量老年斑(senile plaques，SP)，同时伴有胆碱能神经元数量、神经元突触数量 的大量减少，临床上表现为进行性认知功能表减退。目前尚没有针对老年性痴呆病理特征的治疗药物和方法。美国FDA通过治疗老年 性痴呆的药物主要有乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂和NMDA受体拮抗剂两类，这两类药物仅 对中晚期老年性痴呆患者的痴呆症状有所轻度改善或延缓痴呆进展。因此研发新的针对老 年性痴呆病理学特征的药物，成为全球的期待。大量研究资料已证实神经营养因子具有神经保护、防治老年性痴呆的作用。如神 经生长因子(NGF)是研究得最早、最多的一种神经营养因子。神经元存活、生长、迁移、分 化，神经元与其它神经元建立功能性、结构性联系，神经元损伤后修复与再生，神经元退行 性变性等过程均受到NGF的影响。NGF是典型的靶向性神经营养因子，能促进神经元分化、 维持神经元的生长和功能、促进损伤后修复。给老年性痴呆模型大鼠脑内注射NGF，阻止了 90-100%的胆碱能神经元的丢失，并改善了大鼠的学习记忆能力。目前，神经营养因子已作为外周神经损伤治疗药物在临床使用，作为蛋白类药物， 由于其分子量大不能通过血脑屏障大大限制了其临床应用价值，尽管有报道采用脑室穿刺 给药，但这种方法因操作复杂且容易感染不被广泛应用。因此，突破血脑屏障并定向作用于 神经元将使神经营养因子在脑内发挥其完美的生物学效应。如何让药物进入中枢，是制约中枢药物研发的瓶颈。神经营养因子最有可能通过 特异性载体进入中枢。目前已知的载体存在着明显的局限性和缺点。如TFR缺乏中枢定 向性并可引起免疫反应；0X26/8D3易导致免疫反应；M6P受体只在哺乳动物幼年才有表达； RAP易被体内清除机制清除。2007年科学家发现了一种多肽(29肽)可携带治疗性的小干 扰RNA穿过血脑屏障到达神经细胞；而且多次治疗不会引起免疫反应、产生肽的抗体；29肽 可在血液中稳定存在8小时以上。
发明内容
本发明的任务是提供一种融合多肽，使其具有透脑屏障防治老年性痴呆的功能。实现本发明的技术方案是本发明提供的这种融合多肽，由神经营养因子活性肽段和29肽，以及位于 神经营养因子活性肽段和29肽中间的连接肽构成。所述的29肽的氨基酸序列为 YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG ；所述的连接肽的氨基酸序列为AGT ；所述的神经营养因 子活性肽段可以是以下所述神经营养因子中的一种
(1)脑源性神经营养因子(BDNF) DPAKR或PAAKR ；(2)神经生长因子(NGF)KGKE 或 TDEKQ ；(3)睫状神经营养因子(CNTF) LFEKKL。所述的神经营养因子活性肽段可来源于鼠、人或重组合成。制备本发明融合多肽的制备可以直接化学合成，也可以采用以下方法制备构建 神经营养因子活性肽段-连接肽(AGT)-29肽(YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG)融合基 因的大肠杆菌表达载体以及神经营养因子-29肽(YTIWMPENPRPGTP⑶IFTNSRGKRASNG)融合 基因的大肠杆菌定向多拷贝表达载体，在大肠杆菌中表达后纯化。本发明提供的融合多肽利用29肽穿透血脑屏障的优势，使神经营养因子在中枢 神经元富集并发挥对老年性痴呆的防治作用。所构建的融合多肽保留了神经营养因子的生 物学活性，能穿透血脑屏障直接作用于脑发挥防治作用本发明融合多肽能通过外周静脉注 射的方式给药，多次治疗不会引起免疫反应、不会产生肽的抗体。本发明融合多肽可按以下方法制备1.构建神经营养因子活性肽段-连接肽(AGT)_29肽 (YTIWMPENPRPGTPOTIFTNSRGKRASNG)融合基因的大肠杆菌表达载体以及神经营养因子-连 接肽(AGT)-29肽(YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG)融合基因的大肠杆菌定向多拷贝表 达载体，在大肠杆菌中表达、纯化。2.直接化学合成神经营养因子活性肽段-连接肽(AGT)_29肽 (YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG)融合多肽。由于神经营养因子活性肽段在氧化成环的情况下效能更高，因此，在融合多肽合 成过程中，本发明在神经营养因子活性片段两端设计加入了成环氨基酸C。以下为本发明实施例合成的融合多肽的氨基酸序列融合多肽① CDPAKRC-AGT-YTI WMPENPRPGTPCD IFTNSRGKRASNG,命名为 TNPCl ；融合多肽②CPAAKRC-AGT-YTI WMPENPRPGTPCD I FTNSRGKRASNG,命名为 TNPC2 ；融合多肽③CKGKEC-AGT-YTI WMPENPRPGTPCD I FTNSRGKRASNG,命名为 TNPC3 ；融合多肽④CTDEKQC-AGT-YTI WMPENPRPGTPCD IFTNSRGKRASNG,命名为 TNPC4 ；融合多肽⑤CLFEKKLC-AGT-YTI WMPENPRPGTPCD I FTNSRGKRASNG,命名为 TNPC5。本发明在AD细胞模型水平和AD动物模型水平对本发明融合多肽防治老年性痴呆 的功能进行了鉴定。实验用本发明融合多肽由上海科肽生物科技有限公司合成。实验资料TNPCl对老龄鼠的神经保护作用( 一)TNPCl的制备、纯度及结构的鉴定TNPCl直接通过化学合成和纯化，经高效液相色谱法(HPLC)和质谱分析(MS)得到 TNPCl的纯度为91.9% (见图1)，其分子量为4267.8Da(见图2)。(二)TNPCl 功能鉴定1.实验对象C57BL/6J小鼠(华中科技大学同济医学院实验动物中心提供)，体重25_30g， 18-21月龄，雄性，随机分为两组对照组、外周给药组，每组10只。2.实验模型制备本实验均采用自然老龄小鼠
对照组给予实验组等量生理盐水。外周给药组通过腹腔注射给予TNPC1，隔天给药一次持续一周。3.研究方法脑组织中信号转导相关因子含量测定蛋白免疫印迹。大脑皮质神经元凋亡程度尼氏染色。4.实验结果①蛋白免疫印迹免疫印迹的结果显示，外周给药组和对照组相比，MAPK家族的ERK和JNK分子被 明显激活，P13K途径的AKT分子明显激活(见图3)，激活的ERK、JNK和AKT能进一步激活 下游的细胞转录因子促进细胞的生长、增殖与分化。②尼氏染色将对照组和外周给药组的脑片进行尼氏染色，40倍光学显微镜下观察大脑皮质发 现外周给药组的神经元细胞数量明显高于对照组(P < 0. 05)，提示TNPC1能进入中枢抑制 神经元细胞的凋亡(见图4)。TNPC5对AD大鼠模型的神经保护作用1.实验对象Wistar大鼠(华中科技大学同济医学院实验动物中心提供)，体重250g，雄性。 随机分为5组正常(nor)组、模型(con)组、TNPC5大剂量(H-TNPC5)组、TNPC5小剂量 (L-TNPC5)组、NGF 组，每组 10 只。2.实验模型制备WT+GFX侧脑室注射正常组不做处理。模型组手术后不治疗。 TNPC5组从术后开始，腹腔注射TNPC5 (H-TNPC5、L-TNPC5)，连续给药7天。NGF组从术后开始，腹腔注射NGF，连续给药7天。3.研究方法海马STAT3、CTNFR的含量免疫印迹STAT3、CTNFR阳性细胞的显示免疫组化4.实验结果①Stat3免疫组化结果(见图5)齿状回该区显色深浅依次为H-TNPC5组显色强于NGF组，正常(nor)组次之，其 余依次为模型(con)组和L-TNPC5组；海马正常(nor)组海马神经元排列致密，分层清晰，整齐有序。模型(con)组阳 性细胞数显著减少，并且排列紊乱，CA2、CA3、CA4区可见明显的数量较多的未着色的细胞。 NGF组阳性细胞排列较模型(con)组整齐，阳性细胞数增多，但着色比较浅。L-TNPC5组比 NGF组着色稍深，阳性细胞数与排列无显著差异。H-TNPC5组着色最深，在某些区域(CA2、 CA4)比正常(nor)组深，但CA1、CA2、CA3、CA4区细胞排列不如正常(nor)组整齐有序。此外，在TNPC5大剂量(H-TNPC5)组可观察到大量阳性的胶质细胞，数量显著多于 正常(nor)组、模型(con)组、TNPC5小剂量(L-TNPC5)组、NGF组。各组阳性的胶质细胞数 量依次为:TNPC5大剂量(H-TNPC5)组，TNPC5小剂量(L-TNPC5)组与模型(con)组，正常
5(nor)组与NGF组。②Stat3免疫印迹结果(见图6)图6为海马Stat3免疫印迹结果，图*P < 0. 05，与正常组比较##P < 0. 01，与模型组比较 P < 0. 05，与 TNPC5 (小剂量)比较 P < 0. 05，与 NGF 组比较模型(con)组海马stat3水平显著低于正常(Nor)组(p < 0. 05)，NGF组、TNPC5 小剂量(L-TNPC5)组、TNPC5大剂量(H-TNPC5)组海马stat3水平显著高于模型(con)组 (p < 0. 01)，TNPC5 大剂量(H-TNPC5)组显著高于 NGF 组、TNPC5 小剂量(L-TNPC5)组(p < 0. 05)，NGF组、TNPC5小剂量(L-TNPC5)组海马stat3水平无显著差异(p > 0. 05)。③CNTFR免化结果(见图7)左图显示的是海马40X放大结果，右图显示为齿状回100X的放大结果。模型(con)组CA1和CA2区显色强于正常(Nor)组，但CA3区显色较正常(Nor) 组弱； L-TNPC5 (小剂量)组CA1和CA2区显色强于NGF组； H-TNPC5 (大剂量)组CA1和CA2区显色弱于NGF组；但较模型(con)组强。
图1:HPLC 分析 TNPC1 纯度为 91.9%。
图2质谱分析(MS)TNPCl分子量为4267. 8Da。
图3:TNPC1激活脑组织中MAPK和PI3K途径。
图4:TNPC1能抑制神经元细胞的凋亡。
图5:Stat3免疫组化结果。
图6海马Stat3免疫印迹结果。
图7:CNTFR免化结果。
具体实施例方式实施例1本发明融合多肽的制备1.神经营养因子活性肽段-连接肽AGT)_29肽 (YTIWMPENPRPGTP⑶IFTNSRGKRASNG)融合基因的大肠杆菌表达载体以及神经营养因子-连 接肽(AGT)-29肽(YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG)融合基因的大肠杆菌定向多拷贝表 达载体。在大肠杆菌中表达、纯化；或直接通过化学合成融合多肽。1. 1在人类基因库中筛选目标神经营养因子及其可能的活性片段；1. 2确定目标神经营养因子及其可能的活性片段的序列；1. 3构建目标神经营养因子及其可能的活性片段与-29肽的融合基因大肠杆菌表 达载体；1. 4构建目标神经营养因活性片段与-连接肽(AGT)_29肽的大肠杆菌定向多拷贝表达载体1. 5在大肠杆菌中表达、纯化。在大肠杆菌中表达目标神经营养因子及其可能的活性片段与-29肽的融合基因；1. 6收获、并纯化上述融合肽；筛选高效定向多拷贝表达载体。2.直接化学合成神经营养因子活性肽段-连接肽AGT)_29肽 (YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG)融合多肽。2. 1合成方法是用经典的SPPS合成方法在合成时选用0. 21mmol/g的 Gly-ffangResin以5的投料比在0. lmmol的合成规模下进行，首先应用Asn的偶联选用 HBTU、H0BT、DIEA反应，在茚检呈透明时用DMF、甲醇和DMF洗涤，再选用20%六氢吡啶溶液 脱除Fmos并继续用DMF、甲醇、二氯甲烷洗涤。重复偶联和洗涤脱除Foms后依次偶联剩余 氨基酸，在最后一个AA偶联完全后脱除Fmoc并用DMF洗涤，最后用甲醇收缩，抽干树脂。再 使用经典裂解液裂解2h后用冰乙醚沉降即可获得粗肽。2. 2纯化方法应用30*250mm的C18色谱柱进行纯化，其中A相选用0. 1 % TFA，B 相用100% ACN, 20ml/min的流速下在230nm下进行纯化。
0093]
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0116] 0117]
序列表
<110>华中科技大学
<120>透脑屏障防治老年性痴呆的融合多肽
<130>/
<160>11
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>39
<212>PRT
<213>人工
<220>
<221>DISULFID <222>(1). . (7) <400>1
Cys Asp Pro Ala Lys 15
Glu Asn Pro Arg Pro 20
Gly Lys Arg Ala Ser 35
<210>2 <211>39 <212>PRT <213>人工 <220>
Arg Cys Ala Gly Thr Pro Asn Gly
Gly Thr Tyr Thr lie Trp 10
Cys Asp lie Phe Thr Asn 25
Met Pro 15
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70118]
0119]
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0156]
<221>DISULFID <222>(1). . (7) <400>2
Cys Pro Ala Ala 1
Glu Asn Pro
Gly Lys
Arg 35
Arg 20 Ala
Lys Arg Cys Ala Gly Thr Tyr Thr lie Trp Met Pro
51015
Pro Gly Thr Pro Cys Asp lie Phe Thr Asn Ser Arg 2530
SerAsn Gly
<210>3 <211>38 <212>PRT <213>人工 <220>
<221>DISULFID <222>(1). . (6) <400>3
Cys Lys Gly Lys 1
Asn Pro Arg Pro 20
Lys Arg Ala Ser 35
<210>4 <211>39 <212>PRT <213>人工 <220>
<221>DISULFID <222>(1). . (7) <400>4
Cys Thr Asp Glu 1
Glu Asn Pro Arg 20
Gly Lys Arg Ala 35
<210>5 <211>40 Glu Cys Ala Gly Thr Tyr Thr lie Trp Met Pro Glu
51015
Gly Thr Pro Cys Asp lie Phe Thr Asn Ser Arg Gly
2530
Asn Gly
Lys Gin Cys Ala Gly Thr Tyr Thr
510
Pro Gly Thr Pro Cys Asp lie Phe 25
Ser Asn Gly
lie Trp Met Pro 15
Thr Asn Ser Arg 300157]<212>PRT0158]<213>人工0159]<220>0160]<221>DISULFID0161]<222>(1). . (8)0162]<400>50163]Cys Leu PheGlu0164]10165]Pro Glu AsnPro0166]200167]Arg Gly LysArg0168]350169]<210>60170]<211>290171]<212>PRT0172]<213>人工0173]<400>60174]Tyr Thr lieTrp0175]10176]lie Phe ThrAsn0177]200178]<210>70179]<211>50180]<212>PRT0181]<213>鼠、人0182]<400>70183]Asp Pro AlaLys0184]10185]<210>80186]<211>50187]<212>PRT0188]<213>鼠、人0189]<400>80190]Pro Ala AlaLys0191]10192]<210>90193]<211>40194]<212>PRT0195]<213>鼠、人
Ala Gly Thr Tyr Thr 10
Pro Cys Asp lie Phe 25
lie Trp Met 15
Thr Asn Ser 30
40
Pro Arg Pro Gly Thr 10
Arg Ala Ser Asn Gly 25
Pro Cys Asp 15
5
<400>9
Lys Gly LysGlu
1
<210>10
<211>5
<212>PRT
<213>鼠、人
<400>10
Thr Asp GluLys Gin
15
<210>11
<211>6
<212>PRT
<213>鼠、人
<400>11
Leu Phe GluLysLys
1权利要求
一种融合多肽，由神经营养因子活性肽段和29肽，以及位于神经营养因子活性肽段和29肽中间的连接肽构成，所述的29肽的氨基酸序列为YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG，所述的连接肽的氨基酸序列为AGT，所述的神经营养因子活性肽段是脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)或睫状神经营养因子(CNTF)。
2.根据权利要求1所述的融合多肽，其特征在于，所述的脑源性神经营养因子(BDNF) 是DPAKR或PAAKR ；所述的神经生长因子(NGF)是KGKE或TDEKQ ；所述的睫状神经营养因子 (CNTF)是 LFEKKL。
3.根据权利要求1或2所述的融合多肽，其特征在于，在所述的神经营养因子活性肽段 的两端加入了成环氨基酸C。
4.一种融合多肽，具有以下序列①至⑤中任一项所示的氨基酸序列①CDPAKRC-AGT-YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG ；②CPAAKRC-AGT-YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG ；③CKGKEC-AGT-YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG ；④CTDEKQC-AGT-YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG ； CLFEKKLC-AGT-YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG。
5.根据权利要求1所述的融合多肽，其特征在于，所述的神经营养因子活性肽段来源 于鼠、人或重组合成。
6.一种防治老年性痴呆的神经营养因子多肽类药物，其特征在于，含有权利要求1至4 中任一项所述的融合多肽。
7.权利要求1至4中任一项所述的融合多肽的制备方法，其特征在于直接化学合成。
8.权利要求1至4中任一项所述的融合多肽的制备方法是构建神经营养因子活性肽 段-连接肽(AGT)-29肽(YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG)融合基因的大肠杆菌表达载 体以及神经营养因子-29肽(YTIWMPENPRPGTP⑶IFTNSRGKRASNG)融合基因的大肠杆菌定向 多拷贝表达载体，在大肠杆菌中表达后纯化。
全文摘要
本发明提供了一组防治老年性痴呆的神经营养因子融合多肽，该融合多肽由神经营养因子活性肽段和29肽，以及位于神经营养因子活性肽段和29肽中间的连接肽构成，29肽的氨基酸序列为YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG，连接肽的氨基酸序列为AGT，神经营养因子活性肽段是脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)或睫状神经营养因子(CNTF)。该融合多肽能透过血脑屏障，用于老年性痴呆的预防和治疗。
文档编号A61K38/08GK101891822SQ201010182630
公开日2010年11月24日 申请日期2010年5月28日 优先权日2010年5月28日
发明者王建枝, 田青 申请人:华中科技大学