新型同多肽及其制备方法

专利名称：新型同多肽及其制备方法
技术领域：
本发明涉及二氨基单羧酸的新型同多肽、其盐类、旋光异构体及其外消旋体。此外，本发明还涉及制备这些化合物的方法。
更具体地讲，本发明涉及二氨基一元羧酸的同多肽，其结构如通式(Ⅰ)所示
式中R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10各自代表氢或C1-4烷基(进一步地讲代表低级烷基)，r为10-400的平均值。
m为0-10的整数，n为0-10的整数。
上式中各取代基可以相同或不同。
人们都知道，二氨基一元羧酸的同多肽在自然界中很少见它存在于某些肽抗菌素内、细菌细胞壁内、若干蛋白质的交联键内和Clavicepamines之中。其中某些表现出生物效应并且也可采用微生物方法制备。
按照日本的研究结果，由25-30个通过异肽键彼此连接在一起的单体单元组成的L-赖氨酸聚合物可通过链霉菌产生〔Shima和Sakai《农业生物化学》45，2503(1981)〕。这种聚-ε-L-赖氨酸能够使各种噬菌体钝化《Shima等人《农业生物化学》46，1917(1982)〕，并且可应用生物合成方法制备该物质〔Sima等人NipponNogeKagaKuKaishi57，221-226(1983)〕。
Clavicepamines为由麦角的腐物寄生培养物(麦角菌)分离出的富含有赖氨酸的碱性蛋白质，对人体用药很重要。这些蛋白质可被化学分离为分子量为2，000-17，000并且赖氨酸含量为30-95%(摩尔)的化合物。其生物检测结果表明具有细胞增生延迟效果，所以它们能够抑制动物肿瘤的生长，而实际应用中又不会产生有毒的副作用(TycKaK学术论文，1978)。
结构测定的结果表明，ε-赖氨酸(多)肽为Clavicepamines的基本结构单元〔SzoKan，Kelemen和ToroKJ.Chromatogr283(1986)〕。在所期望的Clavicepamines生物效果中聚异赖氨酸结构单元所起的作用至今仍是未知的。
合成聚-L-异赖氨酸、其与氨基酸形成的酰化衍生物以及聚-β-L-α，β-二氨基丙酸的抗病毒活性已被印度研究人员测定。结果发现，这些多肽不仅具有抗病毒活性，同时具备诱发CAM培养物中类似于干扰素的抗病毒因子的能力〔印度《实验生物学杂志》20，227(1982);“印度化学杂志”21B，483(1982)〕。
为了研究化学结构与生物效果间的关系，本发明的目的是以工业规模生产具有给定分子量和低多分散性，由10-400个单元组成的、L-二氨基-元羧酸的异肽。对所需化合物的基本要求是纯度高、多分散性低和立体化学纯度高。
众所周知，生物聚合物所产生的效果受其分子量分布的影响很大。由于不同的旋光异构体具有对立的及不同的生物效果，例如动物肿瘤的生长会受到D-精氨酸的抑制，但是L-精氨酸会对其起到促进作用，因此，氨基酸的构型非常重要〔Szende和TyihaKLancet2546，824(1968)Szende学术论文，1974〕。外消旋混合物或外消旋聚合物不能表现出原有的、适宜的生物效果。
所需多肽应具备高纯度和低多分散性。可选用合成法解决这一问题。采用α-Z-保护赖氨酸活性酯〔Hull法，《生物聚合物》17，2427(1978)〕和α-BOC-保护赖氨酸-五氯苯基-酯〔Gangopadhyay和Mathur法，“印度化学杂志”21B483(1982)〕进行缩聚。按照Nishi法〔Int.J.Biol.Macromd.2，53(1980)〕，通过二苯基磷酰基叠氮化物(DPPA)使α-Z-赖氨酸-OH聚合。上述文章的作者未公开任何涉及这些产物的分子量，分子量分布和旋光纯度的数据。我们的经验表明所获得的低分子量(最大值为2500)和高多分散性的产物的产率较低，且不具备任何生物效果。Kushawa和其合作者〔生物聚合物19，219(1980)〕及Mathur等人〔Int.J.PeptideProt.Res.17，189(1981)〕的合成方法是最为适用的低分散性产物的制备法。通过这些方法可制备ε-聚赖氨酸和δ-聚乌氨酸。方法的原理对两种化合物均相同以得到保护的氨基酸甲酯与得到保护的活性酯或叠氮化物为原料，首先制备三肽一甲基酯。经碱解后，将三肽-酸活化为活性酯的形式(转变为它的五氯苯基酯)。于ω-氨基终端解除保护后，得到三肽，它具有缩聚反应活性。最后，脱除α-氨基保护基，分离出同多肽。在这些步骤中，在α-位使用了BOC保护基，在ω-位使用了Z-氨基保护基。可分别通过强酸处理和催化加氢脱除这些保护基。在上述内容中，未提及特征的作为聚合物旋光纯度数据及分子量、分子量分布。
本文所用简称及其含义如下所示Z.苄氧羰基BOC叔丁氧羰基-ONp对硝基苯基-OSnN-羟基-琥珀酰亚氨基-OPcp五氯苯基-OPfp五氟苯基-OBtN-羟基-苯并三唑基BuOCO异丁氧羰基EtOCO乙氧羰基N3叠氮基EEDQN-乙氧羰基-2-乙氧基-1，2-二氢异喹啉EtOAc乙酸乙酯
IIDQN-异丁氧羰基-2-异丁氧基-1，2-二氢异喹啉THF四氢呋喃DMF二甲基甲酰胺HPLC高性能液相色谱OPTLC超压薄层色谱IEF等电点聚焦MS质谱NMR核磁共振谱Zco2由释出CO2测得的Z-基MW分子量TLC薄层色谱BuOH 丁醇AcOH乙酸在重复进行这些方法时，发现存在下列缺点在齐聚物制备过程中，其羧基一直受到甲基酯的保护，所以得到的齐聚物无法直接用于缩聚反应。为了得到活性中间体，可由相应的甲基酯经碱解释出羧基。这一步骤导致了外消旋化及其它副反应发生，从而降低了产率。不利的结果是生成的聚合物具有高多分散性。此外，由于苄氧羰基ω-氨基保护基可被催化加氢脱除，因此，它的应用同样存在不足之处。如此制得的聚合物在我们的生物试验中失效。
本发明的目的是通过研究出一种从未用于生产二氨基二元羧酸的异肽的新方法以便克服上述缺点。
本发明是基于下述设想来完成的;首先制备能够直接用于缩聚反应的活性齐聚物，其中羧基受到活性酯基的保护，而肽偶合则以较之活性酯保护基的氨解快得多的速率进行。这一偶合方法比活性酯方法能够提供程度更高的活化。业已发现，“反馈”活化方法很适用于异肽及二氨基羧酸盐的制备，进行COOH基的暂时保护并同时进行活化最好选用对硝基苯酯，而进行肽偶合最好采用混合酐法，反应过程中未发生氨基的BOC保护及Z基保护。这样可合成得到任何二氨基羧酸的同或系列异肽。此外，业已发现，采用可重复的方法在宽分子量范围内制取低多分散性同多肽。中间产物及目的产物均为高纯度结晶并易于分离。
另外，本发明还基于下列设想在有二氨基羧酸存在条件下，对硝基苯酯是最为适用的羧基临时保护及同时活化的基团，而对于肽偶合来说，采用混合酐法最为理想，可选用Z和BOC基为其它提供保护。
最后，本发明还基于下列设想任何二氨基一元羧酸的同或系统异肽均可通过上述方法合成，合成过程中未发生外消旋化反应，即它们的构型不变。
综上所述，本发明涉及通式(Ⅰ)所示的同多肽、其盐、旋光异构体和外消旋体，式(Ⅰ)中取代基定义如上所述。
按照本发明方法，通过通式(Ⅱ)所示的单体或齐聚物与通式(Ⅲ)所示的单体偶合制备通式(Ⅳ)所示的化合物，然后脱除R2保护基，若S≤9，化合物(Ⅳ)再与化合物(Ⅲ)反应或以已知方法进行缩聚，便可制得化合物(Ⅰ)
式中q＝1-9，R1为氨基保护基(于齐聚物中，所有R1均相同)，R3为适用于羧基保护及同时活化的活性酯基，R4，R5，R6，R7，R8，R9，R10，m和n如上所述。
R2为不同于R1的氨基保护基，它可由R1基团旁边被有选择地脱除，x为羧基活化基，条件是-COX基比COOR3基更为活泼，R1，R4，R5，R6，R7，R8，R9，R10，m和n如上
式中取代基如上所定义，S为整数2-10，然后脱除产物中的R1保护基。若得到的化合物(Ⅰ)以游离碱的形式存在，可将其转变为药用盐，若为盐，可被转变为游离碱或另一种盐。
可选用异构体为原料制取相应的旋光异构体。若要制备外消旋聚合物，则需选用单体的外消旋体为原料。
用于本发明方法的R1和R2为肽化学中众所周知的、可被选择性脱除的保护基，R1以苄氧羰基(Z)为佳，R2以叔丁氧羰基(BOC)为佳。基团-OR3为适用于羧基保护和活化的活性酯基，例如-ONp，-OSn，-OPcp，-OPfp，-OBt;X代表BiuOCO-，EtOCO-，N3，-OSn，-OPcp，-OPfp，至于X究竟代表哪一种基团，则取决于反应条件和R3的定义，例如，它可以是BiuOCO-，EtOCO-。
在用作本发明方法的原料的式(Ⅱ)所示单体中，R1为Z，R2为BOC，R3为-ONp。BOC基团经酸解被脱除，然后经混合酐法偶合被保护二氨基羧酸，脱除BOC保护基后，缩聚如此获得的二肽，或者是用下一个得到保护的氨基酸如法进行再次偶合，重复该步骤直至产生十肽菌素为止。
最好的方法是重复进行偶合，直至产生三肽为止并将所获得的适用于直接进行缩聚的低聚物用预定量的氨基酸残余物转化为同多肽。Z-保护基的脱除(即消除保护)最好是在乙酸之中用HBr进行。分离目的产物。
进行混合酐法的最佳条件如下a)溶剂乙腈、THF、DMF、二氯甲烷;
b)成酐试剂氯甲酸乙酯、氯甲酸异丁酯、EEDQ、IIDQ，
叔碱三乙胺、二异丙基乙胺、N-甲基吗啉，c)活化时间及温度10-30分钟，-10-20℃，d)用反应混合物中的三乙胺或二异丙基乙胺中和氨基组分盐。
纯目的产物的产率60%-80%。
采用本发明方法可制备同和系列同多肽。
可以采用现有的分离技术如HPLC、OPTLC、IEF和结构测定方法如IR、MS、NMR分析制得的异肽。研究结果及对照物证实了其结构。
为了检测生物活性，使用了按实施例所述方法被提纯的物质。提纯可通过沉析法、柱色谱及凝胶色谱法完成。
在生物研究的基础上，我们发现在由本发明方法制备的聚-L-异赖氨酸〔聚合度(P.d.)10-400〕中，聚合度为40-200、分子量为5500-20300的聚合物在体内和体外均具有细胞增生延迟作用，即抗肿瘤活性和抑制瘤转移。分子量为10200-15400、聚合度为80-120的产物的活性最高。目前制备的其它物质均无效力，这主要是由于在Kushawa或Mathur的方法实施期间有外消旋反应发生以及目的产物的高多分散性所致。
业已发现，Kushawa或Hull方法制备的、聚合度为80-120的聚-L-赖氨酸不具备抗病毒活性。
与已知方法相比，本发明合成方法的优点在于-具备预期生物效果的产物可长期重复制取，-能够制备直接转用于缩聚反应的齐聚物，从而消除了对生物效果有害的上述水解步骤及外消旋化反应，-所制得的产物的分子量分布适宜(即具有低多分散性)，并且其分子量分布范围宽，这样有利于产生需要的生物效果(例如，聚合物SZTP-14的分子量为12700±200，多分散性3.7)。产率及中间体和目的产物的纯度均较高。这两种物质均易于结晶和被分离。重复这些步骤并不困难。
-肽偶合步骤的反应时间较短。
-借助催化加氢进行的去保护反应可通过氨基保护基的合并而被免除，这意味着为工业化生产又提供了一个有利条件。
-本发明方法的最重要优点在于反应步骤中不包括外消旋化反应。
如上所述，迄今获得的产物在我们的生物实验中不能发挥效用。另外，本发明方法合成的聚合物呈现出预期的生物活性。
在本发明制备的化合物(Ⅰ)中，符合下列定义的是新型化合物R4、R5、R6、R7和R10各自代表氢、甲基、乙基、丙基或丁基，R8和R9代表氢，r为整数10-400，m为0、1、2或3，n为0在一组适宜的化合物中R4、R5、R6、R7和R10各自代表氢、甲基、乙基、丙基、或丁基，R8和R9代表氢，r为整数40-200，m为3
n为0;
在另一组适宜的化合物中R4、R5、R6、R7和R10各自代表氢，R8和R9代表氢，r为整数80-120，m为3，n为0;
在另一组优选的化合物中R4、R5、R6、R7和R10各自代表氢、甲基、乙基、丙基或丁基，R8和R9代表氢r为整数10-120，m为2，n为0;
在另一组适宜的化合物中R4、R5、R6、R7和R10各自代表氢、甲基、乙基、丙基或丁基，R8和R9代表氢，r为整数10-400，m为1，n为0;
在更为适宜的化合物中R4、R5和R10各自代表氢、甲基、乙基、丙基或丁基，R6、R7、R8和R9各自代表氢，
r为整数10-400，m和n为0。
我们发现，通式(Ⅰ)所示同多肽及其盐的L立体异构体能够非常有效地防治肿瘤和病毒感染。
于体内和体外研究了本发明方法制备的同多肽的生物活性。下文将阐述它们所具备的活性。抗肿瘤效果是根据动物肿瘤菌株试验测定的。对植物病毒作试验确定了其抗病毒活性。
在本发明实验中，分子量为5500-25600的同-L-赖氨酸的活性惊人，其中又以分子量为10，200-15400的同-L-赖氨酸为最佳。
在这两种测定过程中，以物质SZTP-14最为有效。其特征在于Z-保护聚合物的粘度 (ηsp)/(C) ＝31.92cm3/g，ZCO216.8%(计算值)，16.3%(实测值)。
这种游离聚合物以HBr盐的形式被提供。
Br含量37.7%(计算值)，36.8%(实测值)。
A254＝0(即无紫外线吸收)。
通过借助乙醚由醇中沉淀出来使其被提纯。
〔α)20D＝32.4°(C＝2，水)分子量为12700±200。
抗肿瘤活性的测定测定对细胞增生能够产生影响的化合物的效果一般是采用细胞培养物于玻璃试管内进行，也可以采用可移植的动植肿瘤于体内进行。此，试验是采用我们的化合物作用于人类红白血病细胞线(K-562，KarolinsKa Institut，StocKholm)和四个可移植的小鼠肿瘤(L1210淋巴性白血病，由肿瘤衍生的P380巨噬细胞，欧利希氏癌，路易斯氏肺瘤)。可依据动物患L1210和P380肿瘤及欧利希氏癌残存的多少来说明效果好坏。可在经过处理和未被处理的小鼠肺部和肝部观察到LLT转移的数目及大小。可通过注射由50mg本发明化合物与10ml生理盐水所组成的溶液进行实验。
被测定的化合物包括SZTP本发明方法制备的聚异-L-赖氨酸SZTP-14聚异-L-赖氨酸的HBr盐，以游离碱为基准计的分子量12700±200，多分散性3.7(数均/重均)SZTP-15聚异-L-赖氨酸HBr盐，以游离碱为基准计的分子量11600±200SZTP-16聚异-L-赖氨酸HBr盐，以游离碱为基准计的分子量13400±200SZTP-17聚异-L-赖氨酸HBr盐，以游离碱为基准计的分子量14500±200SZTO本发明方法制备的聚异-L-鸟氨酸SZTO-18聚异-L-鸟氨酸HBr盐，以游离碱为基准计的分子量为8900±200H-17Hull等人方法制备的聚异赖氨酸K-17按照Kushawa等人的方法制备的聚异赖氨酸A-3α-聚赖氨酸。
对肿瘤细胞增生实验的评述与对照物相比，本发明制备的化合物于玻璃试管内的剂量随着肿瘤细胞数目的减少而降低，若剂量少，其效果是细胞数目保持不变，若剂量加大，则细胞被杀死。H-17和K-17无效力，而α-聚赖氨酸(A-3)只能使细胞数目不增加。
按照我们所进行的体内实验，用SZTP处理动物可使残存的数目增加。而用SZTP处理欧利希氏瘤，则在很长一段时间内无肿瘤细胞存在，仅仅于处理停止后方能观察到肿瘤细胞增生。
当肿瘤细胞被接种于脾内时，用SZTP进行处理可完全避免肿瘤细胞向肝部转移，而当肿瘤细胞被接种于肌肉时，向肺部转移的数目及大小均有所减小。
因此，事实证明，本发明制备的聚异赖氨酸和聚异鸟氨酸可用作肿瘤细胞增生抑制剂。其中聚异赖氨酸的抑制效果强得令人吃惊。可以依据动物的残存数目，将这一效果与已知最好的细胞抑制剂的效果相比较，很显然，本发明化合物的抗转移效果出人意料的好。本发明化合物的另一个优点在于其毒性远远低于迄今所用的细胞抑制剂的毒性。
举例来说，本发明的生物检测结果表明治疗指数(最大允许剂量/最小有效剂量)高于10，而对于最好的已知细胞抑制剂来说，这一数值一般低于10。
对于雄性和雌性来说，其各自的生物反应没有差异，这是本发明的又一个优点。
下文中我们将用数据描述抗肿瘤效果。
体外实验表1a-1c所示数据为由各种方法制备的聚异赖氨酸，本发明方法制备的聚异鸟氨酸及α-聚赖氨酸对K-562细胞增生所产生的效果。
实验参数如下细胞K-562人体红白血病细胞线(KarolinsKaInstitule，StocKholm)，细胞数目在含有5-6ml培养基的玻璃试管中，为5×104/ml，探子数目每一剂3个试管，培养基添加有10%胎牛血清(流动实验室，Irvine，苏格兰)的ParKersM-199，温度气体环境37℃，5%CO2和95%空气。
处理用细胞培养物稀释后历时24小时。
剂量1-10-100μg/l，估评于培养物稀释后，于24、48、72和96小时计数细胞，使用BueKer容器，实验次数每种化合物进行2次。
表1a说明采用SZTP-14、SZTP-15、SZTP-16、SZTP-17和SZTP-18，其中尤其是SZTP-14进行处理对细胞增生可产生明显的、其效果依赖于剂量的抑制作用。值得注意的是既使浓度为1μg/ml，也能够产生良好的抗增生效果。
表1b表明，与此相反，H-17和K-17对K-562细胞增生不能构成影响。
表1c说明，与对照物相比，α-聚赖氨酸能够使细胞数目保持不变，但是，既使加大剂量(100μg/ml)也不能使细胞数目增加。
表中给出的数据代表给定时刻的细胞数目。每一剂于某一时刻分3个试管计数细胞，并且有3个试管作为对照物之用。
表1a对本发明制备的化合物(SZTP-14～18)对玻璃试管内K-562细胞线所产生的效果。
处理1-10-100μg/ml，于用培养物稀释后历时24小时。
表1a细胞数×103/ml营养液SZTP-14 48h72h96h100/ug/ml00010/ug/ml90901501108012070801401/ug/ml80170180100180190100120150对照物130220260120230230110220230SZTP-15100/ug/ml40101050201020102010/ug/ml801001606012011050100140
表1a(续)48h72h96h1/ug/ml120150200100140190120120210对照物140210270120190250150190280SZTP-16100/ug/ml10016016012012014010014014010/ug/ml1201602201201602401401802401/ug/ml140180260120210280140240250对照物140220280130200260140200270SZTP-17100/ug/ml110180200120190210110200200
表1a(续)48h72h96h10/ug/ml1202002601202002601201902801/ug/ml150260280130210280130210260对照物140250280150220280130220260SZTP-18100/ug/ml1001601801001301809013016010/ug/ml1201802201201602301201902301/ug/ml140200280140210260130220280对照物140220280150230280140230270
表1bH-17和K-17对玻璃试管内K-562细胞增生所产生的效果。
处理1-10-100ug/ml，干用培养物稀释后历时24小时。
表1b细胞数×103/ml营养液48h72h96hH-17100/ug/ml12523028011031027012021028010/ug/ml1202202901302402801252102201/ug/ml130240290120240290120220270K-17100/ug/ml120220280110210290120220270
表1b(续)48h72h96h10/ug/ml1252402901352402901202102701/ug/ml140240290120220280120230280对照物120210290130200280120220285表1cA-3对玻璃试管内K-562细胞增生的作用效果。
处理1-10-100ug/ml，于用培养物稀释后历时24小时。
表1c细胞数×103/ml营养介质48h72h96h100/ug/ml11011010012011010012012011010/ug/ml1301201201201101101201201101/ug/ml110110100120110110120120110对照物120250300120240290125240290体内检测a)L1210肿瘤，采用SZTP-14进行检测肿瘤来源Chester Bcaty Institute，London，动物种类DBA/2imbred，ownbneed，动物体重及性别20-23g，雌性，每组5只，
肿瘤细胞数目每只动物的腹膜内有105个，处理于腹膜内，剂量为50mg/Kg，于肿瘤接种后历时24小时，一日一次，共进行8天。
对照物组向腹膜内施用0.2ml生理盐水，估评依据残存的动物。
结果如表2所示，经过处理后，残存的动物数目超过对照物。肿瘤接种十天后，对照组未留下一只成活的小鼠，而此时，所有经过处理的动物都活下来了。肿瘤接种后，首先得到处理的动物活了13天，最后得到处理的活了15天。
表2每天以50mg/Kg剂量处理用L1210肿瘤接种的DBA/2小鼠所产生的效果。
接种后的天数成活对照物处理后成活的小鼠93510-511-512-513-414-315--
b)P-388腹水肿瘤，用SZTP-14处理，动物品种BDF/1杂种，ownbreed动物体重及性别20-23g，雄，每组5只，细胞数目2.8×106细胞/每只动物腹膜内，处理腹膜内用量每天为10mg/Kg，肿瘤接种后24小时开始，对照组每天于腹膜内施用0.2ml生理盐水，估评依据动物的残存数目，结果表3表示的是残存动物数目，所有得到处理的小鼠均比对照组活得长。
表3每天以10mg/Kg的剂量用SZTP-14处理用P-388腹水肿瘤接种的BDF/1小鼠所产生的效果。
接种后的天数成活对照物处理后的成活小鼠94510-511-512-513-514-515-416-217-118--
c)欧利希氏腹水肿瘤，用SZTP-14处理动物品种Swiss，nonimbred，ownbreed，动物体重及性别20g，每组有5只雄性和5只雌性动物，肿瘤细胞数目106/每只动物，处理每天向腹膜内施用的剂量为50mg/Kg和75mg/Kg自肿瘤接种后24小时开始，处理20天，对照组向腹膜施用0.2ml生理盐水溶液。
估评每天测量活下来的动物的体重，于肿瘤接种55天后，杀死活下来的动物，解剖后，测量腹水量，记录腹腔内偶然形成的固体肿瘤数目。
结果表4表示的是肿瘤接种第16天后小鼠的体重数据，对照组动物死于第17天至第22天之间。超出的重量表明有肿瘤腹水形成。所有得到处理的动物(每组除了一只外)均活到肿瘤接种后的第55天。然后杀死这些动物。表5表示的是腹腔内固体肿瘤及腹水数量。这说明没有未患肿瘤的动物，不过于最后一只对照组小鼠死后的第33天，在20只经过处理的小鼠中仍有16只成活的小鼠。
表4用剂量为50mg/Kg和75mg/Kg的SZTP-14以腹膜内处理的方式作用于欧利希氏腹水肿瘤接种的雄性或雌性Swiss小鼠。肿瘤接种前的体重20g，0死于肿瘤;十死于其它原因。
表4肿瘤接种对照物♀ 对照物
75mg/kg♀后的天数1. 2. 3. 4. 5. 1. 2. 3.4.5.1.2. 3.4.5.
16. 43 37 41 46 404034403541 17 2224212217. 443942464140 35 035 42 17 2324252218. 454243474942 35 035 43182324212419.043435000360044192324212420.0460420042004616212320 2121.0460430047004718232525 2222.00000000051192526252424.0000000000192426242525.202426242626.2024272425.527.212528252628.212528252629.212528252633.222528252634.222528252642.232627252850.242727252855.262902732
表4(续)
<p>表5采用剂量为50mg/Kg和75mg/Kg的SZTP-14进行处理，于肿瘤接种后的第55天杀死Swiss小鼠。腹腔内腹水及固体肿瘤数量。
处理75mg/Kg75mg/Kg50mg/Kg50mg/Kg♀
♀
腹水--0-416-0--5240-1-40腹腔内的固体肿瘤++0+++++0+++++0++++00动物早夭+腹腔内的固体肿瘤用SZTP-14抑制肿瘤转移a)将路易斯氏肺肿瘤(LLT)接种于脾内动物品种Inbred C57B1，LATI，Godollo，牙利，动物体重及性别20-23g，雌(6只对照物，4只得到处理)肿瘤细胞数目5×106个接种于脾内的LLT细胞，
处理于肿瘤接种后24小时开始以75mg/Kg的剂量处理8天，估评于肿瘤接种后第9天杀死动物并记录肝转移数目，结果表6表示的是转移数目，采用SZTP-14进行处理后，未发现肝转移发生。
表6采用SZTP-14处理(剂量为75mg/Kg，腹膜内施用8天)用LLT于脾内接种的雌性C57小鼠对肝转移数目产生的影响。
肝转移数目对照物312063363856(X＝40.66;S＝16.02;n＝6)SZTP-140000(n＝4)b)将路易斯氏肺肿瘤(LLT)接种于腿肌肉之中动物品种C57B1 inbred LATI，GOdollo，匈牙利动物体重和性别20-22g，雌动物数目每组5只肿瘤细胞以5×105个细胞/每只的剂量以肌内注射的方式施用于右大腿肌肉之中。于肿瘤接种十天后，摘除右下肢。于肿瘤接种后11天至17天之间进行下述处理向腹膜内施用50mg/Kg SZTP-14。每天向对照组动物的腹膜内施用0.2ml生理盐水溶液。
估评于肿瘤接种后第十八天杀死动物，于立体显微镜下确定肺转移的数目及平均体积。
结果表7所示为肺转移数目及平均体积。SZTP-14处理能够明显地降低肺转移数目及平均体积。
表7采用SZTP-14对经过路易斯氏肺肿瘤接种的C57B1小鼠进行处理(每日剂量为50mg/Kg，腹膜内用药，于肿瘤接种后第11天和第17天之间)，对肺转移数目及平均体积所产生的效果。
治疗平均转移数目平均转移体积对照物63.13±27.5349.45±29.07SZTP-1426.29±18.8720.10±35.38抗病毒活性抑制烟草花叶病毒的产生完好的烟草(Nicotianatabacumcv.Samsun)易于受烟草花叶病毒(TMV)感染，可使用机械方式进行接种。金刚沙粉粒经为500目)可用作磨擦剂。接种物中含200ugTM得到提纯的烟草花叶病毒(TMVU1品种)，于0.1MSorensen磷酸盐缓冲液中，pH＝7.2)。接种3小时后，将SZTP-14溶液喷施于完好的烟叶上。连续进行
3天，于接种后二星期检查症状。于接种后第14天从所有接过种的植物的叶子中选取叶子样品，也就是说选取不同高度、各种龄期的各类叶子。
由一克冷冻的样品中测定病毒浓度。叶子样品于4ml磷酸盐缓冲液(pH＝7.2)中被均化，然后被置于Eppendorf离心机中被离心分离(转速约为10000转/分，进行5分钟)。采用15ul上清液进行定量测定。采用特殊的抗TMV(U1)血清(1μl免疫球蛋白/1cm)通过火箭免疫电泳估算病毒含量。可使用巴比妥酸钠缓冲剂(0.2M，pH＝8.6)作为电泳缓冲剂。采用标准校准曲线，由沉淀峰值的高度计算病毒含量。
表8抗病毒效果的估评实例处理SZTP-14病毒含量200mg/l11mg/ml20mg/l24.6mg/ml2mg/l29.3mg/ml对照物51.3mg/ml以游离碱和无毒盐形式存在的本发明同多肽可作为有效组分用于药物制剂之中。为此，它们可与常用于制药业的载体及助剂混合从而转变为药用产物。此外，通过将它们与用于植物保护的助剂混合可使本发明化合物以游离碱和盐的形式被使用，使植物的抗病毒感染能力增强。
可用作药物的盐有如酸加成盐如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、草酸盐、富马草盐、葡糖酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、抗坏血酸盐、乳酸盐、藻酸盐等。
其中活性剂为本发明化合物的药物可以是注射用溶液、片剂、糖衣药丸、栓剂、悬浮液、口服液、粉剂等。
本发明化合物的药用有效量取决于施药方式及患者状况。一般地，用药剂量为0.02-20mg/体重Kg/天，每天2-4次。口服用药的剂量可以大些。
适宜的药剂形式为注射溶液，可以采用静脉、皮下或肌内注射的方式给药。为了制备注射液，可以使用等渗压NaCl溶液，必要的话，还可同时使用磷酸盐缓冲液，抗坏血酸稳定剂等。
可以固体和液体医用制剂的形式施用活性物质。若以液体形式施用，可使用增甜剂和/或增香剂。
适宜的固体口服单位有如片、糖衣药丸和胶囊。在制药时，是将活性剂与常用药物载体混合，并将该混合物压制成片剂，转变成糖衣药丸和填充至胶囊之中。常用的填充和添加剂可用作载体，例如乳糖、硬脂酸镁、滑石、硬脂酸、蔗糖、明胶、琼脂、果胶、黄蓍胶、硅胶、玉米淀粉、藻酸等。为了制造栓剂，适宜选用可可脂。
最好是通过将本发明化合物与常用的助剂如润湿材料和固体载体(以高岭土为佳)转变为固体或液体制剂(以与其它活性物质组合使用为佳)对植物进行处理。由如此制得的制剂可得到本发明化合物浓度为1-50ppm的溶液或悬浮液，并以已知方式被施用于植物，
用量以0.5-5g/公顷为佳。
下列实施例将对本发明进行进一步描述，但并不构成任何限制。
实施例1聚-L-赖氨酸HBr盐a)Nα-苄氧羰基-L-赖氨酸-对硝基苯酯HCl将10g Nα-苄氧羰基-(Nε-叔丁氧羰基)-L-赖氨酸-对硝基苯酯溶于40ml三氟乙酸并加入等量的2NHCl/EtOAc。于室温下放置1小时之后，使溶液于真空下蒸发掉一半体积，然后加入醚使溶液产生结晶。
产率8.3g(96.06%);熔点83-86℃;TLCRf＝0.68(正丁醇∶乙酸∶水＝4∶1∶1)。
b)Nα-苄氧羰基-N-(N′α-苄氧羰基-N′ε-叔丁氧羰基-L-赖氨酰)-L-赖氨酸-对硝基苯酯将7.69g(20mmol)Nα-苄氧羰基-(Nε-叔丁氧羰基)-L-赖氨酸溶于无水乙腈之中。然后先后滴加2.8ml(20mmol)三乙胺和2.8ml氯甲酸异丁酯，同时进行剧烈搅拌。活化(20分钟)后加入9g步骤a)的盐，然后滴加由2.8ml三乙胺与5ml乙腈所组成的冷溶液。于-10℃下继续搅拌2小时，用300ml 0.5M HCl稀释该混合物。收集固体产物，干燥并用乙酸乙酯与石油醚的1∶1混合物进行重结晶处理。产率12.9g(89.02%)，熔点128-131℃，分析结果-ONP含量99.8%。TLCRf＝0.64(EtOAc∶环己烷＝3∶1)，Rf＝0.91(正丁醇∶乙酸∶水＝4∶1∶1)，HPLCtr＝8.8分钟(K′＝2.2);
柱子ODS-Hypersil-6(125×4mm);洗提剂MeOH-CH3CN0.02M NaOAc缓冲液(pH＝4)＝40∶30∶30(V/V);流速1ml/分钟;检测UV254nm。
c)Nα-苄氧羰基-Nε-(N′α-苄氧羰基-L-赖氨酸)-L-赖氨酸-对硝基苯酯·氢氯酸盐按照步骤a)，由10.5g Nα-苄氧羰基-N-(Nα-苄氧羰基-N′ε-叔丁氧羰基-L-赖氨酰)-L-赖氨酸-对硝基苯酯制备10.25g盐，熔点109-113℃，TLCRf＝0.70(正丁醇∶乙酸∶水＝4∶1∶1)。
d)Nε-叔丁氧羰基-三(Nα-苄氧羰基-L-赖氨酸)-对硝基苯酯将5.71g(15mmol)Nα-苄氧羰基-(Nε-叔丁氧羰基)-L-赖氨酸按照步骤b)用三乙胺、氯甲酸异丁酯/乙腈转化为混合酐。在三乙胺存在下，加入10.5g Nα-苄氧羰基-Nε(N′α-苄氧羰基-L-赖氨酰)-L-赖氨酸-对硝基苯酯氢氯酸盐。这样可获得13.9g产物(85.4%)。用乙腈及乙醚进行重结晶处理，熔点为145-150℃。分析结果ONP含量99.6%;TLCRf＝0.98(正丁醇∶乙酸∶水＝4∶1∶1);HPLCtr＝18.2分钟(K′＝8.1);柱子ODS-Hypersil-6(125×4mm);洗提剂MeOH-CH2CN-0.02M NaOAc缓冲液(pH＝4)＝40∶30∶30;流速1ml/分钟;检测UV254nm。
e)三-(Nα-苄氧羰基-L-赖氨酸)-对硝基苯酯盐酸盐按照步骤a)处理12.2g步骤d)制备的酯。这样可获得12.1g(95.4%)盐;熔点108-125℃，TLCRf＝0.71(正丁醇∶乙酸∶水＝4∶1∶1)。
f)聚-ε-Nα-苄氧羰基-L-赖氨酸在4.5ml三乙胺存在下，于60ml二甲基亚砜中，23g(24mmol)三-(Nα-苄氧羰基-L-赖氨酸)-对硝基苯酯。盐酸盐经缩合形成凝胶。通过将其倾入5%Na2CO3水溶液分离出聚合物。
产率16.8g(89.6%)。分析结果ZCO216.8%(计算值)，16.3%(实测值)〔ηsp〕/C＝31.96cm3/g(C＝4.95g/l，二氯乙酸)。
g)聚-ε-L-赖氨酸氢溴酸盐将16g得到保护的步骤f)得到的聚合物溶于100ml三氟乙酸并加入100ml4NHBr/AcOH。加入乙醚使目的产物沉析。
产率14.7g(91.6%)。分析结果Br37.7%(计算值)，36.8%(实测值);A254nm＝0。纸色谱法Wl 23×62，洗提剂∶正丁醇∶乙酸∶吡啶∶水＝30∶6∶24∶20。总产率36.82%(以得到保护的胺为起始物);18.85%(以游离赖氨酸为起始物)MW＝5500-20300D。
h)目的产物粗品的提纯将250g步骤g)获得的聚合物溶于水中，然后用SephadexG-50(细)柱进行色谱法提纯。洗提剂蒸馏水，0.9%NaCl溶液或0.1NHCl溶液。于UV220nm下检测馏分(1ml)。
i)目的产物粗品的提纯将2g步骤g)中制备的聚-ε-L-赖氨酸氢溴酸盐溶于2ml水中，然后加入20ml乙醇。通过添加80ml乙醚使聚合物沉析。于5℃下静置24小时后，经过滤、洗涤和干燥。产率1.26g(83%)(以得到保护的三肽为起始物计为57.7%)如此得到的就是SZTP-14，MW-12700D〔α〕20D＝32.4°(C＝2，H2O)，多分散性＝3.7。
可采用相似方法制备下列物质SZTP-15 MW＝116000±200 〔α〕20D＝31.9°SZTP-16 MW＝13400±200 〔α〕20D＝32.6°SZSP-17 MW＝14500±200 〔α〕20D＝32.1°实施例2聚-ε-L-赖氨酸·盐酸盐将1g实施例1制得的聚合物溶于40ml2MNaCl溶液中，所得到的溶液透析出2MNaCl溶液，随后透析出水。采用冻干法可得到0.85g聚合物。
实施例3
聚-ε-L-赖氨酸(游离碱)用Dowex 1-OH阴离子交换树脂制备离子交换柱(40ml)。以1cm3/分钟的流速采用色谱法提纯由1g实施例1制备的聚合物与20ml水所组成的溶液。分析馏分，收集后冷冻干燥。分离得到0.65g聚合物。
实施例4聚-ε-D-赖氨酸氢溴酸盐以10g Nα-苄氧羰基-Nε-叔丁氧羰基-D-赖氨酸-对硝基苯酯为起始物完成实施例1所述步骤。这样可制得1.3g聚合物。MW＝8900〔α〕20D＝-48.08°(C＝0.92，水)。
实施例5聚-δ-L-鸟氨酸按照实施例1所述方法，以10g Nα-苄氧羰基-(Nδ-叔丁氧羰基)-L-鸟氨酸-对硝基苯酯为起始物，可获得7.9g Nα-苄氧羰基-L-鸟氨酸-对硝基苯酯-盐酸盐，其熔点为87-90℃。该盐与Nα-苄氧羰基-(Nδ-叔丁氧羰基)-L-鸟氨酸按照步骤b)的方式偶合，形成Nα-Z-Nδ(N′α-Z-N′δ-叔丁氧羰基-L-鸟氨酰)-L-鸟氨酸-对硝基苯酯二肽(12.1g);熔点为133-136℃。重复步骤1a)，由二肽(11.99g;熔点115-119℃)制备Nα-Z-Nδ-(N′α-Z-L-鸟氨酰)-L-乌氨酸-对硝基苯酯盐酸盐，按照步骤1b)经偶合获取Nδ-BOC-三(Nδ-Z-L-鸟氨酸)-对硝基苯酯(14.8g，熔点150-153℃)，依照步骤(e)制备三(Nα-Z-L-鸟氨酸)-对硝基苯酯盐，熔点115-130℃。按照步骤if)使上述产物缩聚，得到15.4gδ-聚-Nα-苄氧羰基-L-鸟氨酸(87.6%)。采用步骤1g)方法，分离该产物，得到13.1g(93%)聚-δ-1-鸟氨酸-氢溴酸盐。
实施例6聚-δ-D-鸟氨酸氢溴酸盐采用实施例5所述的方法，以1g Nα-苄氧羰基-Nδ-叔丁氧羰基)-D-鸟氨酸-对硝基苯酯为起始物，可制得1.2g(89%)聚-δ-D-鸟氨酸氢溴酸盐。
实施例7聚-γ-L-(α，γ-二氨基丁酸)按照实施例1所示方法，由9.8g Nα-苄氧羰基-Nε-叔丁氧羰基-L-α、γ-二氨基丁酸对硝基苯酯制备6.9g Nα-苄氧羰基-L-α，γ-二氨基丁酸对硝基苯酯氢氯酸盐，熔点为67-70℃。采用步骤1b)的方法使该盐与Nα-苄氧羰基-Nγ-叔丁氧羰基-L-α，γ-二氨基丁酸偶合，转化为Nα-Z，Nγ-(N′α-Z-N′γ-叔丁氧羰基-α，γ-二氨基)-丁酸-对硝基苯酯二肽(10.8g，熔点125-127℃)。重复步骤1a)，由二肽(熔点为108-112℃)合成10.35g Nα-Z-Nγ-(N′α-Z-L-α，γ-二氨基丁酰基)-L-α，γ-二氨基丁酸-硝基苯酯盐酸盐。采用步骤1b)的方法，可由该盐经偶合获得13.7g Nγ-BOC-三(Nα-Z-L-α，γ-二氨基丁酸)-对硝基苯酯，其熔点为
143-145℃。采用步骤1e)的方法，可由该产物制备10.5g三(Nα-Z-L-α，γ-二氨基丁酸)-对硝基苯酯盐，其熔点为105-110℃。按照步骤1f)的方法，该产物于二甲基亚砜中进行缩聚可产生7.8g(86.5%)聚-γ-Nα-苄氧羰基-L-α，γ-二氨基丙酸。采用步骤(g)所述方法处理得到保护的聚合物，得到6.2g(90.5%)聚-γ-L-α，γ-二氨基丁酸氢溴酸盐。
实施例8聚-β-L-(α，β-二氨基丙酸)采用实施例1所述方法，由9.6g Nα-苄氧羰基-Nβ-叔丁氧羰基-L-α，β-二氨基丙酸对硝基苯酯(熔点为65-67℃)制备7.1g Nα-苄氧羰基-L-α，β-二氨基丙酸对硝基苯酯盐酸盐，采用步骤1b的方法，可使该盐与Nα-苄氧羰基-Nβ-叔丁氧羰基-L-α，β-二氨基丙酸偶合产生11.0gNα-Z-Nγ-(N′α-叔丁氧羰基)-α，β-二氨基丙酰基)-α，β-二氨基丙酸对硝基苯酯二肽，其熔点为119-122℃。重复步骤1a)，由二肽制备10.85g Nα-Z-Nβ-(N′α-Z-L-α，β-二氨基丁酸)-L-α，β-二氨基丙酸-对硝基苯酯盐酸盐。产率10.85g，熔点102-105℃。按照步骤1b)的方法，由该盐经偶合可得到12.6gNβ-BOC-三-(Nα-Z-L-α，β-二氨基丙酸)-对硝基苯酯，其熔点为138-140℃。采用步骤1e)的方法，可用此产物制取12.4g三(Nα-Z-L-α，β-二氨基-丙酸)-对硝基苯酯盐，其熔点为102-106℃。采用步骤1f)的方法使该化合物于二甲基亚砜中进行缩聚，可获得8.7g(90.2%)聚-β-Nα-苄氧羰基-L-α，β-二氨基丙酸。如步骤1g)所述处理得到保护的聚合物，得到5.6g(88.7%)聚-β-L-α，β-二氨基丙酸氢溴酸盐。
实施例9注射溶液将500mg聚-L-赖氨酸·HBr溶于10ml生理盐(NaCl)水。过滤消毒后，根据患者的状况，以1-100mg/Kg/天的剂量使用。
实施例10片剂的制备片剂由下列组分制备10g聚异-L-赖氨酸·HCl60乳糖16g蔗糖20g玉米淀粉2g硬酯酸镁2g藻酸将这些材料均匀混合后压制成100片。
实施例11增强植物抗病毒感染能力的方法配制由5g聚异-L-赖氨酸与100ml水所组成的溶液。借助于NaOH溶液将该溶液的pH值调至7.0-7.2，此后加入1mlTween20。该溶液被施用于面积为1公顷、生长着有待保护的芽后植物的土地之中。
权利要求
1.通式(Ⅰ)所示的化合物及其盐、外消旋体和旋光异构体
式中R4、R5、R6、R7和R10各自代表氢原子或C1-4烷基，R8和R9各自代表氢原子，γ为10-100的整数，m为0，1，2或3，n为0。
2.通式(Ⅰ)所示的化合物及其盐、外消旋体和旋光异构体，其中R4、R5、R6、R7和R10各自为氢原子，γ为10-400，m为0，1，2或3，n为0。
3.平均分子量为5500-25600的聚异赖氨酸。
4.平均分子量为4400-13500的聚异乌氨酸。
5.具备抗肿瘤和抗病毒效果的药物制剂，其中含有用作活性剂的通式(Ⅰ)化合物(式中R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10代表氢，γ为整数400-200，m为0，1，2或3，n为0和具备L-构型的氨基)和与之混合的，常用于制药业的载体和/或添加剂。
6.按照权利要求5所述的药物制剂，其中活性试剂为其平均分子量为5500-22500的聚异赖氨酸。
7.一种通过单体偶合及如此制得的齐聚物经缩聚反应制备通式(Ⅰ)所示聚异二氨基羧酸及其盐、外消旋体和旋光异构体的方法。式中R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10可以相同或不同，代表氢原子或C1-4烷基，γ为整数10-400，m为整数0-10，n为整数0-10其特征在于通式(Ⅱ)所示的单体或齐聚物与通式(Ⅲ)所示的单体偶合，脱除所形成的通式(Ⅳ)所示化合物中的R2保护基，若S≤9，该化合物与单体(Ⅲ)反应或以已知方式进行缩聚反应，必要的话，当所获得的化合物(Ⅰ)以游离碱的形式存在时，它会转变化盐，或者当其为盐时，会转变为碱或另一种盐
式中q为整数1-9，R1为氨基保护基，在齐聚物中所有R1均相同，R3为适用于进行保护和同时进行活化的羧基的活性酯保护基，R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、m和n如上所定义，对于齐聚物来说，这些取代基可以相同或不同，
式中R2为不同于R1的氨基保护基，它可于R1基团旁边有选择地被脱除，x为羧基活化基团，条件是基团-COX比COOR3基团的活性更强，R1、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、m和n如上所述，
式中取代基与上述相同，S为整数2-10
8.按照权利要求7所述制备式Ⅰ所示聚异二氨基羧酸(其中R4、R5、R6、R7、R10和γ如权利要求1所定义，m＝3n＝0的方法，其中式(Ⅱ)所示的单体或齐聚物(R1、R3、R4、R5、R6、R7、R10和q如权利要求1所定义，m和n如上所定义)与通式Ⅲ所示的单体(R1、R2、R4、R5、R6R7、R10和x如权利要求1所定义，m和n如上所定义)反应，脱除所形成的通式(Ⅳ)所示化合物(其中取代基与上述相同，s取值如权利要求1所述)中的R2保护基，必要的话，当s≤9时，使所获得的产物与单体(Ⅲ)反应或以已知方式进行缩聚反应。
9.按照权利要求7所述制备通式(Ⅰ)所示聚异二氨基羧酸(其中R4、R1、R3、R5、R6、R7、R10和q如权利要求1所定义，m和n如上所定义)及其盐的方法，其中式(Ⅱ)所示的单体或齐聚物(其中R1、R3、R4、R5、R6、R7、R10和q如权利要求1所述，m和n如上所定义)与式(Ⅲ)所示单体(其中R1、R2R4、R5、R6、R7、R10和x如权利要求所定义，m和n如上所述)反应，脱除所形成的通式(Ⅳ)所示化合物(其中取代基与上述相同，s取值如权利要求1所述)中的R2保护基，必要的话，当s≤9时，所获得的产物与单体Ⅲ反应或以已知方式进行缩聚反应。
10.按照权利要求7所述制备聚异-L-赖氨酸及其盐的方法，其中Nα-Z-L-赖氨酸-对硝基苯酯·氢氯酸盐和Nα-Z-Nε-BOC-L-赖氨酸被用作原料，它们可与异丁基氯甲酸酯反应转变为混合酐。
11.按照权利要求7所述制备聚异-L-乌氨酸及其盐的方法，其中Nα-Z-L-多氨酸-对硝基苯酯氢氯酸盐和Nα-Z-Nβ-BOC-L-乌氨酸为原料，它们可与异丁基氯甲酸盐反应被转化为混合酐。
12.按照权利要求7所述制备聚异-D-乌氨酸及其盐的方法，其中Nα-Z-D-乌氨酸-对硝基苯酯·氢氯酸盐和Nα-Z-Nβ-BOC-D-乌氨酸被用作原料，通过与异丁基氯甲酸酯反应而被转化为混合醉。
13.治疗哺乳动物体内癌症的方法，其中药物所含活性组分为权利要求1所述的化合物，该药物以有效剂量被使用。
全文摘要
本发明涉及通式(I)所示的新型同多肽及其盐、对映体和旋光异构体。此外还涉及这些化合物的制备方法。
文档编号A61P35/00GK1033633SQ8810725
公开日1989年7月5日 申请日期1988年10月20日 优先权日1987年10月21日
发明者吉拉·索克恩, 厄恩·泰伊克, 贝拉·索恩德, 卡罗利·莱平斯, 里查德·加布詹泽 申请人:匈牙利科学院组织分析研究所, 匈牙利科学院植物保护研究所