专利名称：β-干扰素的无HSA制剂的制作方法
技术领域：
本发明通常涉及药物组合物，更具体涉及不含人血清白蛋白作为添加的药物赋形剂的β-干扰素的稳定制剂。
背景技术：
干扰素是糖蛋白的一个家族，通过包括病毒、双链RNA、其他多核苷酸、抗原及促分裂原在内的许多信号的诱导可从细胞中分泌干扰素。干扰素具有多种生物活性，包括抗病毒、抗增殖和免疫调节作用。根据许多因素，包括抗病毒活性和抗增殖活性，已经鉴定至少三种不同类型的人源干扰素，α、β和γ。
β-干扰素(IFN-β)第一个被确认对于治疗多发性硬化症(MS)有效，并证实能减少复发和缓解型MS病人的发作次数。IFN-β组合物在乙型和丙型肝炎感染的治疗中也是有用的。
对所有以蛋白质为基础的药物而言，在将IFN-β用作治疗剂必需克服的一个主要障碍是药效的损失，这是由于药物制剂的不稳定性造成的。影响药物制剂中多肽的活性和效能的物理不稳定因素包括变性和可溶和不溶聚集体的形成，而化学不稳定因素包括水解、亚胺形成、氧化、外消旋化和脱酰胺作用。已知这些变化中的一些会导致有兴趣的蛋白质的药物活性的丧失或降低。其它情况下，这些变化的准确作用还不知道，但由于潜在的不良副作用，所得的降解产物仍被认为是药物上所无法接受的。
药物组合物中多肽的稳定仍是实验和误差扮演主要角色的区域(Wang(1999)Int.J.Pharm.185129-188的综述；Wang和Hanson(1988)J.Parenteral Sci.Tech.42S3-S26)。加到多肽药物制剂中以增加其稳定性的赋形剂包括缓冲液、糖类、表面活性剂、氨基酸、聚乙二醇和聚合物，但这些化学添加剂的稳定效果取决于蛋白质。
制备稳定的IFN-β药物制剂的一个主要障碍是IFN-β分子的稳定性差。目前的制剂使用HSA作为IFN-β的溶解增强剂。然而，使用HSA有缺点。HSA是人血液产品，因此必需从人受试者获得。由于采用了降低风险的步骤，人血液产品如HSA的应用有可能引入人病毒如HIV和HCV。在制剂中引入HSA还会影响正确确定IFN-β在制剂中的稳定性的能力。这是因为HSA和IFN-β都是蛋白质，且HSA还会影响一些指示IFN-β稳定性的测定。
此外，IFN-β是一种当在药物组合物中制备时会有聚集体形成的蛋白质，因此在这些组合物的贮存期间使处于单体生物活性状态的这种蛋白质的量受到损害。药物组合物贮存期间由IFN-β等多肽形成的聚集体对那种多肽的生物学活性有不利影响，导致药物组合物的治疗功效的丧失。此外，聚集体形成会造成其它问题，如当使用输注系统施用IFN-β的药物组合物时会堵塞输液管、膜或泵。此外，注射含有蛋白质的聚集形式的药物组合物可能会对聚集的蛋白质产生免疫原性反应。
因此，需要其它的IFN-β药物组合物，它含有生理上相容的稳定剂，这种稳定剂可提高这种蛋白质的溶解度并稳定蛋白质以避免聚集体形成，由此增加其药效。
发明概述提供了以β-干扰素(IFN-β)作为治疗活性成分的组合物及其制备方法。这种组合物是稳定的药物组合物，它不含作为药物赋形剂的人血清白蛋白(HSA)且基本上含有溶于低离子强度制剂中的单体IFN-β。所述低离子强度制剂是一种含有缓冲液的溶液，缓冲液的量足以使所述组合物保持在特定的pH±0.5个单位内，其中特定的pH约为3.0-5.0，且离子强度不超过约60mM。非离子的渗透剂(tonicifyingagent)被加入此药物组合物以使时组合物等渗，这里的渗透剂是碳水化合物。还提供了增加IFN-β在药物组合物中的溶解度，以及不使用人血清白蛋白来增加这些组合物中单体IFN-β的量的方法。
附图简述
图1显示了氯化钠溶液中IFN-β-1b的溶解度。
图2显示了低离子强度制剂中IFN-β-1b的溶解度。
图3显示了pH3.0对IFN-β-1b聚集状态的影响。
图4显示了pH4.0对IFN-β-1b聚集状态的影响。
图5显示了pH5.0对IFN-β-1b聚集状态的影响。
图6显山了离子强度(0mM NaCl)对IFN-β-1b聚集状态的影响。
图7显山了离子强度(50mM NaCl)对IFN-β-1b聚集状态的影响。
图8显山了离子强度(150mM NaCl)对IFN-β-1b聚集状态的影响。
图9显示了仅含5mM甘氨酸缓冲剂的pH 3.0制剂中IFN-β-1b的聚集状态。
图10显示了非离子渗透剂(9％蔗糖)在图9所示的制剂中对IFN-β-1b聚集状态的影响。
图11显示了非离子渗透剂(9％海藻糖)在图9所示的制剂中对IFN-β-1b聚集状态的影响。
图12显示了在40℃贮存8周后，在含有9％海藻糖或9％蔗糖的冻干制剂中IFN-β-1b最初浓度的百分比。浓度是用UV吸收测定的。
图13显示了在40℃贮存8周后，在含有9％海藻糖或9％蔗糖的冻干制剂中IFN-β-1b主峰的百分比。主峰百分比是通过RP-HPLC测定的。
图14显示了在5℃或30℃贮存9个月后，在含有9％海藻糖的冻干制剂中IFN-β-1b最初浓度的百分比。浓度是用UV光谱测定的。
图15显示了在5℃或30℃贮存9个月后，在含有9％海藻糖的冻干制剂中IFN-β-1b主峰的百分比。主峰百分比是通过RP-HPLC测定的。
图16显示了在30℃贮存9周后，在含有9％海藻糖或9％蔗糖的液体制剂中IFN-β-1b最初浓度的百分比。浓度是用UV吸收测定的。
图17显示了在30℃贮存8周后，在含有9％海藻糖或9％蔗糖的液体制剂中IFN-β-1b主峰的百分比。主峰百分比是通过RP-HPLC测定的。
图18显示了在5℃在小瓶中贮存9个月后，在含有9％海藻糖或9％蔗糖的液体制剂中IFN-β-1b最初浓度的百分比。浓度是用UV光谱测定的。
图19显示了在5℃在小瓶中贮存9个月后，在含有9％海藻糖或9％蔗糖的液体制剂中IFN-β-1b主峰的百分比。主峰百分比是通过RP-HPLC测定的。
图20显示了在30℃贮存9周后，在含有9％海藻糖或9％蔗糖的液体制剂中IFN-β-1b最初浓度的百分比。浓度是用UV光谱测定的。
图21显示了在40℃贮存8周后，在含有9％海藻糖或9％蔗糖的液体制剂中IFN-β-1b最初浓度的百分比。浓度是用UV光谱测定的。
图22显示了在5℃贮存6个月后，在含有5％甘露醇的液体制剂中IFN-β-1b最初浓度的百分比。浓度是用UV光谱测定的。
图23显示了在5℃贮存9个月后，在含有5％甘露醇的液体制剂中IFN-β-1b主峰的百分比。主峰百分比是通过RP-HPLC测定的。
发明详述本发明涉及含有β-干扰素(IFN-β)的稳定的药物组合物及其制法。这些组合物是在没有人血清白蛋白(HSA)时制备的，因此不含这种药物赋形剂。这种组合物在这里被称为“无HSA”的IFN-β药物组合物。该组合物含有基本上呈单体状态的溶于低离子强度制剂的IFN-β。“低离子强度”制剂是指一种含有缓冲液的溶液，缓冲液的量足以使所述药物组合物保持在特定的pH±0.5个单位内，且离子强度不超过约60mM。“离子强度”是指用于溶液的标准化学定义，溶液的离子强度等于1/2∑cizi2，其中c是浓度，z是电荷。所述缓冲液以约1mM-约30mM的浓度存在于该低离子强度制剂中，优选为约2mM-约25mM，较优选为约2mM-约20mM，更优选为约2mM-约10mM，最优选为约2mM-5mM。因此，在一些实施方案中，所述低离子强度制剂含有浓度为约2mM-约10mM、约2mM-约7mM、约2mM-约5mM、约2mM、约3mM、约4mM或约5mM的缓冲液。可用来制备低离子强度制剂的IFN-β可溶于其中的合适的缓冲液包括但不限于甘氨酸、天冬氨酸、琥珀酸钠、柠檬酸盐、甲酸盐、乙酸盐、谷氨酸、组氨酸、咪唑和磷酸盐，优选甘氨酸、天冬氨酸和琥珀酸钠，更加优选甘氨酸和天冬氨酸。
优选所述低离子强度制剂的离子强度不超过约60mM，较优选不超过约40mM、更优选不超过约20mM。一些实施方案中，所述制剂的离子强度仅仅是由缓冲液的浓度决定的，因此所述制剂不含其它对离子强度有影响的离子种类，如氯化钠、氯化钾、氯化镁、铵盐等。
低离子强度制剂以含有缓冲液的溶液使用，所述缓冲液的浓度约为1mM-30mM，优选约为2mM-5mM，以制备稳定的IFN-β药物组合物，根据所用特定的缓冲液，该组合物的pH约为3.0-5.0，优选约为3.0-4.5，较优选约为3.0-4.0，更优选约为3.5-4.0，最优选约为4.0。因此，当缓冲液是甘氨酸时，所述组合物的pH约为3.0-3.5，优选约3.0。当缓冲液是天冬氨酸时，所述组合物的pH约为3.5-4.5，优选约4.0。当缓冲液是琥珀酸钠时，所述组合物的pH约为4.5-5.0，优选约5.0。
将本发明的IFN-β药物组合物的pH保持在约pH3.0-pH5.0可使IFN-β在这些组合物中的溶解度超过在没有人血清白蛋白时正常的可能值。此外，将IFN-β掺入这里所定义的低离子强度制剂中可能制备含有基本上为单体IFN-β的药物组合物。“基本上为单体”是指出现在该组合物中的大多数IFN-β(以重量计)为单体形式而不是聚集体形式。“聚集”是指多肽分子之间的物理相互作用，这种作用会导致仍溶于溶液或从溶液中沉淀出的多聚体(二聚体、三聚体等)的形成。IFN-β多肽的单体形式仍是可溶的，这里称为“溶解”在低离子强度制剂或本发明的药物组合物中。本发明的无HSA的组合物中单体形式的IFN-β的百分比(以重量计)为80％或更高。因此，本发明提供了无HSA的IFN-β药物组合物，它含有至少约80％的单体形式而不是聚集体形式的IFN-β，优选单体形式的IFN-β至少约85％，较优选至少约90％，更优选至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。
在本发明的一些实施方案中，这种无HSA的IFN-β药物组合物还含有非离子的渗透剂，其量足以使该组合物与体液等渗。可用此领域中一般知道的一些非离子渗透调节剂使该组合物等渗。它们通常是各种类型的碳水化合物(例如可参见Voet和Voet(1990)Biochemistry(John Wiley & Sons，纽约)。醛糖类的单糖如葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖和核糖，以及酮糖类的单糖如果糖、山梨糖和木酮糖可被用作本发明的非离子渗透剂。也可使用二糖，如蔗糖、麦芽糖、海藻糖和乳糖。此外，糖醇(脂肪族的多羟基醇)如甘油、甘露醇、木糖醇和山梨醇也是本发明中有用的非离子渗透剂。最优选的非离子渗透剂是海藻糖、蔗糖和甘露醇，或它们的组合。所加入的非离子渗透剂的量足以使所述制剂与体液等渗。当加入无HSA的IFN-β药物组合物时，根据所用试剂，所述非离子渗透剂的浓度约为1％-10％。因此，在一个实施方案中，所述非离子渗透剂是浓度约为8％-10％，优选约9％(以每体积的重量计)的海藻糖或蔗糖，优选是此浓度的海藻糖。在另一个实施方案中，所述非离子渗透剂是浓度约为4％-6％，优选约5％(以每体积的重量计)的甘露醇。在其它实施方案中，所述非离子渗透剂是海藻糖和甘露醇，或蔗糖和甘露醇的组合物，其中海藻糖和蔗糖的浓度约为1％(以每体积的重量计)，甘露醇的浓度约为3％-5％(以每体积的重量计)，优选约4.6％(以每体积的重量计)。
本发明的无HSA的IFN-β药物组合物包括液态组合物及其干燥形式。出于本发明的目的，关于药物组合物或制剂的术语“液态”是指包含术语“含水的”，并包括被冷冻的液体制剂。“干燥形式”是指液态药物组合物或制剂通过冷冻干燥(即冻干，例如参见Williams和Polli(1984)J.Parenteral Sci.Technol.3848-59)、喷雾干燥(参见Masters(1991)，《喷雾干燥手册》Spray-dryingHandbook(第5版；Longman Scientific and Technical，Essez，英国)第491-676页；Broadhead等(1992)Drug Devel.Ind.Pharm.181169-1206；以及Mumenthaler等(1994)Pharm.Res.1112-20)或空气干燥(Carpenter和Crowe(1988)Cryobiology25459-479；以及Roser(1991)Biopharm.447-53)而干燥。关于IFN-β的药物组合物的术语“冻干”是指在减压下迅速冷冻干燥许多小瓶，其中每个小瓶中都含有单位剂量的本发明的干扰素制剂。进行上述冻干处理的冻干机是商业上可获得的且是精通此领域的技术人员可操作的。在本发明的一个实施方案中，所述液态组合物被制成冻干组合物。
在本发明其它的实施方案中，本发明的无HSA的IFN-β药物组合物可被制成适合肺部输送并通过肺吸入将该制品用于受试者的形式。“肺吸入”是指当受试者通过口腔吸气时将气溶胶或其它合适剂制的组合物从输送装置送到受试者的口腔中，从而将所述药物组合物直接用于肺部。“气溶胶”是指固体或液体颗粒在流动的空气或其它生理上可接受的气流中形成的悬液。其它合适的制剂包括但不限于雾、蒸气或喷雾制剂，只要含有蛋白质组合物的颗粒以与下述药物组合物的干粉形式相一致的大小范围输送即可。肺吸入也可通过精通此领域的技术人员熟知的其它合适方法实现。这些方法包括采用合适装置的液体滴注法或其它此类方法。肺吸入导致吸入的蛋白质组合物沉积在受试者的肺泡上。一旦沉积，蛋白质就可被被动或主动吸收，穿过肺泡上皮和毛细管上皮层进入血流，随后进行全身分布。
IFN-β等多肽或蛋白质的肺部施用要求在吸入时生物活性物质由输送装置分配到受试者的口腔中。出于本发明的目的，含有IFN-β或其变体的无HSA的IFN-β药物组合物是通过吸入气溶胶或其它合适制剂施用的，根据所用输送装置，其它制剂是由药物组合物的含水或不含水的溶液或悬液形式，或固体或干粉形式获得的。这种输送装置是此领域熟知的，它包括但不限于喷雾器、定量吸入器和干粉吸入器，或任何其它合适的可用于分配含水或不含水的溶液或悬液或固体或干粉形式的药物组合物的输送装置。当用于本文时，适合肺部输送的药物组合物有以下含义。“含水的”是指用水制备、含有水或溶于水的组合物，其中水是混合物中的主要物质。主要物质以大于混合物的另一组分的量存在。“非水的”是指用除水或混合物以外的物质、含有水或溶于水的物质制备的组合物，其中水不是混合物中的主要物质。“溶液”是指两种或多种物质的均一制剂，它可以是固体、液体、气体或它们的组合。“悬液”是指一种或多种不溶性物质均匀分散在另一主要物质中形成的混合物。
出于本发明的目的，对于适合肺部输送的无HSA的药物组合物，当术语“固体”和“干粉”可互换使用。药物组合物的“固体”或“干粉”形式是指被干燥成水分含量低于约10％(重量计)，通常低于约5％(重量计)，优选低于约3％(重量计)的细散的粉末的组合物。组合物的这种干粉形式由含有IFN-β或其变体的颗粒构成。优选的粒度是平均直径小于约10.0μm，较优选小于约7.0μm，更优选小于约6.0μm，再优选在0.1-5.0μm之间，最优选在约1.0-5.0μm之间。
因此，供肺部输送的含有IFN-β或其变体的无HSA的液态药物组合物可被用作输送装置内的液体溶液或悬液，或者首先用此领域中熟知的冻干或喷雾干燥技术将其加工成干粉。如果以单剂量或多剂量，在输送装置、喷雾器、定量吸入器或其它合适的输送装置中使用液体溶液或悬液，通过肺吸入药物有效量的组合物就以液滴形式达到受试者的肺部，该液滴与上述干粉形式有同样的粒度范围。“药物有效量”是指用于治疗、预防或诊断与IFN-β有关的疾病或症状的量。所述组合物的液体溶液或悬液可与精通此领域的技术人员熟知的生理上适合的稳定剂、赋形剂、粘度修饰剂、膨胀剂、表面活性剂或它们的组合一起使用，只要它们不妨碍鉴别本发明的无HSA的IFN-β组合物的特性。
在用于肺部输送之前将所述液态药物组合物冻干，将冻干的组合物研磨以得到细散的干粉，所述干粉是由在上述所需大小范围内的颗粒构成的。如果采用喷雾干燥以得到液态药物组合物的干粉形式，该过程是在得到基本上为无定形细散的干粉的条件下进行的，所述干粉是由在上述所需大小范围内的颗粒构成的。类似地，如果起始的药物组合物已经是冻干形式，可将所述组合物研磨以得到干粉形式，随后将其制为气溶胶或其它适合肺吸入的制剂。如果起始的药物组合物是喷雾干燥的形式，优选将该组合物制成干粉形式，具有作为含水或不含水的溶液或悬液或干粉形式分配的粒度的干粉形式与肺输送一致。对于制备药物组合物的干粉形式的方法，例如可参见WO 96/32149、WO 97/41833、WO 98/29096以及美国专利5,976,574、5,985,248和6,001,336号，本文将其引入以供参考。
将所得干粉形式的组合物放在合适的输送装置内，随后将其制成气溶胶或其它通过肺吸入输送给受试者的合适制剂。如果要制备药物组合物的干粉形式并将其作为含水或不含水的溶液或悬液分配，使用了定量吸入器或其它合适的输送设备。以气溶胶或其它适合肺吸入的制剂施用了药物有效量的干粉形式的组合物。置于输送装置内的干粉形式的组合物的量足以通过吸入将药物有效量的组合物输送给受试者。因此，置于输送装置内的干粉形式的量将补偿此装置在贮存或输送组合物的干粉形式中可能的损失。将干粉形式置于输送装置内以后，如上述大小合适的颗粒被悬浮在气溶胶推进剂中。然后在吸入时，加压的不含水的悬液从输送装置释放到受试者的呼吸道中。通过肺吸入，所述输送装置以单剂量或多剂量向受试者的肺部输送了药物有效量的组合物。所述气溶胶推进剂可用是任何常规的用于此目的的物质，如含氯氟烃、氢氯氟烃、氢氟烃或是烃，包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1，1，1，2-四-氟乙烷或它们的组合物。可在该药物组合物中加入表面活性剂以减少含有蛋白质的干粉附着在用来分散气溶胶的输送装置的壁上。用于此目的的合适的表面活性剂包括但不限于山梨聚糖三油酸盐、大豆卵磷脂和油酸。适合将干粉形式的蛋白质组合物作为不含水的悬液进行肺部输送的装置是商业上可获得的。此类装置的例子包括Ventol in定量吸入器(Glaxo公司，Research Triangle Park，北卡罗来纳州和Intal吸入器(Fisons公司，Bedfoed，马萨诸塞州)。还可以参看美国专利第5,522,378号、5,775,320号、5,934,272号和5,960,790号描述的气溶胶输送设备，本文引入以供参考。
如果将固体干粉形式的无HSA的IFN-β药物组合物作为干粉形式输送，优选使用干粉吸入器或其它合适的输送装置。干粉形式的药物组合物优选用常规方法将其分散在流动的空气或其它生理上可接受的气流中从而制成干粉气溶胶。市售的适合本文所述方法的干粉吸入器的例子包括Spinhaler粉末吸入器(Fisons公司，Bedfoed，马萨诸塞州)和Ventolin吸入器(Glaxo公司，Research TrianglePark，北卡罗来纳州。还可以参看WO 93/00951、WO 96/09085、WO 96/32152和美国专利第5,458,135号、5,785,049号和5,993,783号描述的干粉输送设备，本文引入以供参考。
含有IFN-β或其生物活性变体的干粉形式的药物组合物可以重建成水溶液，随后以水溶液气雾剂的形式用喷雾器、定量吸入器或其它合适的设备进行输送。当用喷雾器时，保存在贮液槽内的水溶液被转变成水雾，每次给药时只有一小部分离开喷雾器而输送入受试者体内。多余的水雾又回到喷雾器内的贮液槽中，在那里它重新雾化成水雾。这一过程重复进行直到贮液槽完全排空或直到雾化喷雾的给药结束。商品供应的这类喷雾器包括，例如，Ultravent型喷雾器(Mallinckrodt公司，St.Louis，密苏里州)和Acorn II型喷雾器(MarquestMedical Products，Englewood，科罗拉多州)。其它的喷雾器还可以参看WO93/00951，输送雾化的水相制剂的设备可以参看美国专利第5,544,646号；本文引入以供参考。
本发明的无HSA的IFN-β药物组合物是“稳定的”组合物。“稳定的”是指在贮存期间组合物中的IFN-β多肽基本上为单体状态，因此这种多肽的疗效没有因聚集体形成而受到影响。“贮存期间”是指液态药物组合物或制剂一旦制成不立即用于受试者。或者，在制备后，它被包装以贮存，以液体形式或以冷冻形式或以干燥形式，然后再重建成液体形式或其它适合用于受试者的形式。这种稳定性是在没有HSA作为稳定剂和增溶剂时获得的。较好地，本发明的组合物直接以其液体形式贮存，以充分利用此液体形式的贮存稳定性、无需重建即可使用的简便性以及以预装填、即可使用的注射器或作为多剂量制剂(如果此配方与抑菌剂相容)补充制剂的能力。当存储在2-8℃时，本发明的稳定的无HSA的IFN-β组合物优选至少有约6个月、12个月、18个月，较好是至少有约20个月，更好是至少有约22个月、最好是至少有约24个月的保存期限。
此领域中可获得用来检测本发明的无HSA的IFN-β药物组合物的稳定性的方法，包括以下实施例中所述的方法。因此，通过测量一段时间后溶液中溶解的IFN-β的变化可以容易地确定本发明的液体药物组合物在贮存期间IFN-β聚集体的形成。可用许多适合检测IFN-β的分析方法来量化溶液中可溶性多肽的量。这种测定包括，例如，反相(RP)-HPLC和UV吸收光谱，如以下实施例所述。可测定液体制剂在贮存期出现的可溶和不溶的聚集体，例如，用以下实施例中提到的分析型超速离心法来分辨作为可溶性聚集体出现的部分可溶性多肽和以非聚集体、具有生物学活性分子形式出现的部分物质。
本发明的稳定的药物组合物含有IFN-β及其变体。这里所用的术语“IFN-β”是指IFN-β及其变体，有时是指IFN-β样多肽。人IFN-β变体可以指天然产生的(即IFN-β位点上的等位基因变体)或重组制备的蛋白质，具有与天然成熟的人IFN-β相同、类似或基本上类似的氨基酸序列。也包括保留其活性的IFN-β片段或IFN-β的截短形式。这些具有生物活性的IFN-β片段或截短形式是使用本领域已知的重组DNA技术从全长IFN-β氨基酸序列中除去氨基酸残基而得到的。IFN-β多肽可以是糖基化或非糖基化的，文献报道糖基化和非糖基化的IFN-β具有相似的特异活性，因而与糖基部分无关，且不影响IFN-β的生物活性。
这里所指的IFN-β变体包括天然成熟IFN-β序列的突变蛋白，其中一个或多个对生物活性不是必需的半胱氨酸残基已被故意删除或被其他氨基酸替代以除去分子间交联或形成错误的分子间二硫键的位点。这种类型的IFN-β变体包括那些用甘氨酸、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸或甲硫氨酸替代天然成熟氨基酸序列的17位上半胱氨酸的IFN-β。丝氨酸和苏氨酸是较佳的替代氨基酸，因为它们的化学结构与半胱氨酸相似，丝氨酸取代则是最佳的。在一个实施例中，就是用丝氨酸替代天然成熟氨基酸序列的17位上的半胱氨酸。17位半胱氨酸也可以采用本领域的已知方法删除(参见，例如美国专利4,588,584号，本文引入供参考)，得到一个比天然成熟IFN-β短一个氨基酸的成熟IFN-β突变蛋白。另见美国专利4,530,787、4,572,798和4,588,585号。因此，本发明也包括具有一个或多个提高药物效用的突变的IFN-β变体。
熟练的技术人员将知道通过突变编码IFN-β的核苷酸序列可引入额外的变化，从而导致IFN-β氨基酸序列的改变，不改变干扰素的生物学活性。通过从编码天然IFN-β的相应核酸序列上引入一个或多个核苷酸取代、添加或缺失可以得到与天然成熟IFN-β氨基酸序列不同的编码IFN-β变体的分离的核酸分子，这样一个或多个氨基酸取代、添加或缺失引入编码的IFN-β中。突变可以通过标准技术如定点诱变和PCR介导的诱变来引入。这种IFN-β变体也包括在本发明中。
例如，保守氨基酸取代可以在一个或多个预测的非必需氨基酸残基上进行。这里所说的“非必需氨”基酸残基是指可对野生型IFN-β序列进行改变不会改变其生物活性的残基，而必需氨基酸残基则是生物活性所必需的。“保守氨基酸取代”是指用具有相似侧链的氨基酸残基来替代一个氨基酸残基。具有相似侧链的氨基酸残基的家族已在本领域中定义。这些家族包括具有以下侧链的氨基酸碱性侧链(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)非极性侧链(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分枝侧链(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。这些取代无法在保守氨基酸残基上进行，或者在保守基序内无法存在氨基酸残基。
另外，IFN-β核苷酸序列也可以通过沿着所有或部分IFN-β编码序列随机突变获得，如饱和诱变，所得到的突变体通过IFN-β生物活性筛选以鉴别保留活性的突变体。诱变后，所编码的蛋白质可以通过重组技术进行表达，蛋白活性则通过本发明所描述的标准分析技术测定。
具有生物学活性的IFN-β变体与天然成熟IFN-β相比，一般至少有80％，更优先有约90％到95％或更高，最优选有约96％到99％或更高的氨基酸序列同一性，这里天然成熟IFN-β作为比较的基础。这里所说的“序列同一性”是指当变体的氨基酸序列的指定的邻接区段与参照分子的氨基酸序列对比和比较时，变体多肽和作为参照的多肽分子内发现的相同氨基酸残基。
为了达到两个序列最佳排列以确定序列同一性的目的，变体的氨基酸序列的邻接区段相对于参照分子的氨基酸序列来说可以含有额外的或删除的氨基酸残基。用于与参照氨基酸序列比较的邻接区段至少有20个邻接氨基酸残基。通过分配间隙罚分方法来提高与变体氨基酸序列中间隙相关的序列同一性的校正值。这种序列排列方法在本领域是众所周知的。
因此，可以利用数学算法则来确定任何两个序列之间的百分比同一性。一种用于序列比较的优选的、非限制性的数学算法的例子是Myers/Millers算法(Comput.Appl.Biosci.411-7 1988)。这种算法运用在ALIGN程序(2.0版本)中，它是GCG排列软件包的一部分。在比较氨基酸序列时，PAM120重量残基表、12间隙长度罚分以及4间隙罚分可以和ALIGN程序一起使用。另外一种用于序列比较的优选的非限制性数学算法的例子是Karlin/Altschul算法(Proc.Natl.AcadSci.USA 905873-5877，1990)，后来作者对运算法则作了改进(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877，1993)，这种算法被运用到Altschul等的NBLAST和XBLAST程序中(J.Mol.Biol.215403-410，1990)。BLAST氨基酸序列搜索可以和XBLAST程序(分数＝50，字长＝3)一起进行得到与感兴趣的多肽相似的氨基酸序列。为了获得有间隙的排列以达到比较的目的，可以利用有间隙的BLAST(Altschul等1997，Nucleic Acids Res.253389-3402)。另外，PSI-BLAST可用于进行整体搜索以检测分子之间的远缘关系。见Altschul等(1997)同上述。在运行BLAST、有间隙的BLAST或PSI-BLAST程序时，可以使用默认参数，见网站ncbi.nlm.nih.gov。也可以参见ALIGN程序(Dayhoff(1978)《蛋白质序列与结构图集5增刊3》，国家生物医药研究基金会，华盛顿特区)以及Wisconsin序列分析程序包中的程序，第8版(从Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin得到)，例如GAP程序，其程序的默认参数已被利用。
在考虑氨基酸序列同一性的百分比时，有些氨基酸残基可能因为保守氨基酸取代而位置有差异，但这并不影响蛋白质的功能特性。在这些情况下，序列同一性百分比可能要上调以适应保守的取代氨基酸的相似性。这种调整在本领域是众所周知的。参见，如Myers和Miller(1988)Comput.Appl.Biosci.411-7。
本发明所包括的具有生物学活性的IFN-β变体还包括与(例如)聚乙二醇(PEG)或白蛋白共价结合的IFN-β多肽。这些共价杂交IFN-β分子具有某些所需的药物特性，如在用于患者后有延长的血清半衰期。产生PEG-IFN加合物的方法包括化学修饰单甲氧基聚乙二醇以产生将与IFN-β反应的活性化合物。制备和使用PEG连接的多肽的方法描述在，例如，Delgado等(1992)Crit.Rev.Ther.Drug.CarrierSyst.9249-304中。产生白蛋白融合多肽的方法包括将感兴趣的多肽(如IFN-β)的编码序列与白蛋白融合，如美国专利5,876,969所述，在此引入以供参考。
本发明的具有生物活性的IFN-β的变体应保留IFN-β的活性，尤其是与IFN-β受体结合的能力。一些实施方案中，IFN-β变体至少保持约25％、约50％、约75％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％或更多的多肽的生物活性，该多肽的氨基酸序列列在图1或2中。还包括与图1或2所示多肽的活性相比，IFN-β变体的活性提高了。IFN-β变体的生物活性可以通过已知的任何方法测定。这种测定方法的例子见于以下文献报道Fellous等(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA793082-3086；Czerniecki等(1984)J.Virol.49(2)490-496；Mark等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 815662-5666；Branca等(1981)Nature 277221-223；Williams等(1979)Nature 282582-586；Herberman等(1979)Nature 277221-223；Anderson等(1982)J.Biol.Chem.257(19)11301-11304；以及这里所述的IFN-β效力测定(见实施例2)。
本发明制剂的β-干扰素可以来源于任何动物物种，包括但不局限于鸟、犬、牛、猪、马和人。当制剂要用于治疗哺乳动物的IFN-β失调时，优选使用来源于哺乳动物物种的干β-扰素；更优选是来源于和接受治疗这种失调的相同种类的哺乳动物。因此，当接受治疗的哺乳动物是人时，优选对受试者施用基本上含有单体人IFN-β或其生物活性变体的无HSA的药物组合物。
本发明所包括的IFN-β多肽和IFN-β变体多肽的非限制性例子提出于Nagata等(1980)Nature 284316-320；Goeddel等(1980)Nature 287411-416；Yelverton等(1981)Nucleic Acids Res.9731-741；Streuli等(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.782848-2852；EP028033B1和EP109748B1。也见美国专利第4,518,584号；第4,569,908号；第4,588,585号；第4,738,844号；第4,753,795号；第4,769,233号；第4,793,995号；第4,914,033号；第4,959,314号；第5,545,723号；和第5,814,485号。在此引入以供参考。这些引用也为IFN-β多肽的残基和区域可以被改变而不丧失生物活性提供指导。
在本发明的一个实施方案中，稳定的药物组合物内的IFN-β是天然成熟的IFN-β多肽。在另一个实施方案中，这些组合物中的IFN-β是成熟的IFN-β多肽，其中，用以上讨论的丝氨酸代替天然成熟氨基酸序列17位上的半胱氨酸。然而，本发明包括了另外的实施方案，在这些实施方案中稳定的药物制剂内的IFN-β是任何有生物活性的IFN-β多肽或变体，正如本文其他地方所述。
在本发明的一些实施方案中，IFN-β是重组产生的。“重组产生的IFN-β”是指和天然成熟的IFN-β相比具有类似的生物活性，并且是用DNA重组技术制备的。可以通过培养包含一个编码IFN-β多肽的核苷酸序列的表达载体转化的宿主细胞来产生IFN-β。宿主细胞能够转录核苷酸序列并产生所需的蛋白质，它可以是原核的(如大肠杆菌)，也可以是真核的(例如酵母菌、昆虫或哺乳动物细胞)。IFN-β的重组生产的例子见于Mantei等(1982)Nature 297128；Ohno等(1982)NucleicAcids Res.10967；Smith等(1983)Mol.Cell.Biol.32156以及美国专利第4,462,940号；第5,702,699号；和第5,814,485号，在此引入以供参考。又见美国专利第5,795,779号，它在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中利用重组技术制得IFN-β-1a；在此并入以供参考。已经利用重组DNA(“rDNA”)技术克隆了人干扰素基因，并在大肠杆菌中表达(Nagola等，(1980)Nature 284316；Goeddel等，(1980)Nature 287411；Yelverton等(1981)Nuc.AcidRes.9731；Streuli等，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.782848)。或者，按照本领域已知的方法，用表达感兴趣的IFN-β蛋白的已基因工程化的转基因动物或植物可以产生IFN-β。
用rDNA技术，通过从病毒诱导的人细胞中提取富含poly-A的12S信使RNA，以此mRNA作为模板合成双链cDNA，并将此cDNA引入合适的克隆载体k，用此载体转化合适的微生物，收获此微生物并从中提取β-干扰素，这样可制得具有天然IFN-β样特性的蛋白质或多肽。例如可参见欧洲专利申请第28033号(公布于1981年5月6日)；32134(公布于1981年7月15日)和34307(公布于1981年8月26日)，它们描述了各种用rDNA技术生产β-干扰素的方法。
或者，IFN-β可以化学合成，可利用那些多肽领域中的技术员熟知的任何技术。例如Li等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.802216-2220，Sterward和Young(1984)Solid Phase Peptide Synthesis(Pierce Chemical公司，Rockford，依利诺斯州)，Baraney和Merrifield(1980)《肽合成的原理》(The PeptidesAnalysis，Synthesis，Biology)，Gross和Meinhofer编；第2卷(学术出版社，纽约，1980)，第3-254页，讨论了固相肽合成技术；Bodansky(1984)《肽合成的原理》(Principles of Peptide Synthesis)(Springer-Verlag，柏林)，Gross和Meinhofer编(1980)《肽分析、合成、生物学》第1卷(学术出版社，纽约)，讨论了经典的溶液合成。IFN-β也可以利用同时多种肽合成方法化学制备。例如，Houghten(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.825131-5135以及美国专利第4,631,211号。
可用精通此领域的技术人员所知的任何方法回收和纯化用于制备本发明的无HSA的稳定的IFN-β药物组合物的重组产生的IFN-β。这些方法包括美国专利4,462,940和5,702,699披露的方法，在此引入以供参考。这些方法可回收在没有用作增溶剂的SDS时趋于形成凝聚体的纯化形式的IFN-β。另外，这些方法是将蛋白质暴露于高pH值条件下，这种条件可对蛋白质的生物学性质产生不利影响，并导致组合物中含有纯化期间用于溶解蛋白质的残留量的SDS。因此，尽管用这些方法可得到IFN-β，但优选用改进的方法将其回收并纯化，该方法描述在题为“改进的蛋白质纯化和回收方法”、提交于2000年10月27日、美国申请序列号第60/243,965号的待批临时申请；题为“改进的蛋白质纯化和回收方法”、提交于2001年4月9日、美国申请序列号第60/282,607号的待批临时申请以及题为“蛋白质纯化和回收的方法”、现在提交的美国申请序列号第＿＿号的临时申请中，在此全文引入以供参考。
在这些待批和现在提交的申请中披露了两种改进的纯化和回收IPN-β的方法。第一种纯化和回收方法包括用醇(如脂肪族醇)基本上沉淀纯化的IFN-β，并将沉淀的IFN-β溶于盐酸胍。然后将所得溶液稀释进合适的缓冲液中以使蛋白质变性。第二种纯化和回收方法省略了沉淀步骤。在这一方法中，将基本上含有纯化的IFN-β的样品与盐酸胍混合以形成含有溶解的变性的IFN-β的溶液；然后将此溶液稀释进合适的缓冲液中以使蛋白质变性。在这两种方法中，然后将含有变性的IFN-β的溶液渗滤或透析到用于药物目的的缓冲液中。当用于制备本发明的无HSA的IFN-β的药物组合物时，纯化的变性IFN-β蛋白质被渗滤或透析到如下面实施例8所述的本发明的低离子强度制剂中。
本发明所包括的组合物少则可含有大约0.01mg/ml的IFN-β，多则可含有大约20.0mg/ml的IFN-β(重量/体积)。在各种实施方案中，IFN-β的浓度是大约0.01mg/ml至20.0mg/ml，大约0.015mg/ml至12.5mg/ml，大约0.025mg/ml至10.0mg/ml，大约0.05mg/ml至8.0mg/ml，大约0.075mg/ml至6.0mg/ml，大约0.1mg/ml至4.0mg/ml，大约0.125mg/ml至2.0mg/ml，大约0.175mg/ml至1.0mg/ml，大约0.2mg/ml至0.5mg/ml，大约0.225mg/ml至0.3mg/ml，和大约0.25mg/ml。
在一些实施方案中，本发明的制剂包含药学上可接受的载体。“药学上可接受的载体”是指本领域中通常使用的，能够方便贮存、给药、和/或发挥治疗成份的治疗效应的载体。载体也会减少IFN-β的任何不良副作用。一种合适的载体应该是稳定的，即不会和制剂中其他的成份起反应。在治疗所用的剂量和浓度时，它不会在接受治疗者中产生出明显的局部或全身性副反应。这样的载体在本领域中普遍为人们所知。本发明合适的载体是那些经常使用的很稳定的大分子，例如明胶、胶原、多糖、单糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、固定油、油酸乙酯、脂质体、葡萄糖、乳糖、甘露糖、右旋糖、右旋糖酐、纤维素、山梨醇、聚乙二醇(PEG)等。缓释载体，例如透明质酸也是合适的。特别见Prisell等(1992)Int.J.Pharmaceu.8551-56和美国专利第5,166,311号。
药物组合物可附加的包含一种增溶剂或溶解度它们有助于蛋白质的溶解度超过使用本文披露的低离子强度配方得到的提高的溶解度。含有胍盐基团的化合物，最优选的是精氨酸，对于IFN-β来说是合适的溶解度增强剂。这样的溶解度增强剂的例子包括精氨酸以及能保持提高IFN-β溶解度能力的精氨酸类似物。这样的类似物，包括但不限于含有精氨酸的二肽和三肽。其他合适的增溶剂见于美国专利第4,816,440号；第4,894,330号；第5,004,605号；第5,183,46号；第5,643,566号；以及Wang等(1980)J.Parenteral Drug Assoc.34452-462，在此引入以供参考。
除以上披露的试剂以外，可加入其它稳定剂如乙二胺四乙酸(EDTA)或其盐之一(如二钠EDTA)以进一步提高液态药物组合物的稳定性。已知EDTA用作金属离子的清除剂以催化许多氧化反应，从而提供额外的稳定剂。其它合适的稳定剂包括非离子表面活性剂，包括聚氧乙烯、山梨醇酯如聚山梨酸酯80(Tween 80)和聚山梨酸酯20(Tween 20)；聚氧丙烯-聚氧乙烯酯如Pluronic F68和Plwonic F127；聚氧乙烯醇如Brij 35；二甲聚硅氧烷(Simethicone)；聚乙二醇如PEG400；溶血磷酯酰胆碱；和聚氧乙烯-p-t-辛基苯酚如Triton x-100。描述了经典的使用表面活性剂使药物具有稳定性的方法，例如见于Levine等(1991)J.Parenteral Sci.Technol.45(3)160-165。在此引入以供参考。
本发明的药物有效量的稳定的液态无HSA的IFN-β制剂，或重建的稳定的本发明的无HSA的IFN-β冻干药物制剂被用于受试者。“药物有效量”是指在治疗、预防或诊断疾病或症状中有效的量。典型的给药途径包括但不局限于口服给药、鼻腔给药、肺部给药、肠道外给药，包括经皮肤、静脉内、肌肉内、皮下、动脉内、腹膜内注射或滴注。在一个实施方案中，给药方式是注射，优选皮下注射。本发明的组合物的可注射形态包括但不局限于溶液、悬浮液、乳状液。典型的IFN-β治疗有效量约含0.01μg/kg-5mg/kg，优选约0.05μg/kg-1000μg/kg，更优选约0.1μg/kg-500μg/kg，最优选约0.5μg/kg-30μg/kg组合物。
在一种实施方案中，含有单体IFN-β的稳定无HAS的药物组合物配制成一个单位剂量，是可注射或滴注的形式如溶液、悬浮液或乳状液。而且，它可以冻结贮存或制备成干燥形式，如冻干粉末，它可以在给药前通过任何各种方法重建成液体溶液、悬浮液、或乳剂包括口服或经肠道外给药。稳定的药物组合物可以通过膜过滤灭菌，可以存储在单位剂量或多剂量的容器中，如密封的小瓶或安瓿中。本领域普遍知道的配制药物组合物的另外的方法可以用来进一步提高本文所披露的药物组合物的贮存稳定性，只要它们不负面地影响所披露的稳定剂的有益作用。关于药学上可接受的载体、稳定剂等的配方和选择的详尽的讨论见于Remington’sPharmaceutical Sciences(1990)(第18版，Mack出版公司，Eaton，宾夕法尼亚州)，在此引入以供参考。
包含有效量的β-含有干扰素(IFN-β)或其变体，如称为hIFN-βserl7的人IFN-β(hIFN-β)的突变蛋白的本发明的药物组合物在诊断、预防和治疗(局部或全身)临床适应症中是有用的，这些适应症响应这些多肽的治疗。例如，这些临床适应症包括中枢神经系统(CNS)、脑和/或脊髓的障碍或疾病，包括阿尔茨海默病、帕金森病、卢伊体痴呆、多发性硬化、癫痫、小脑性共济失调、进行性核上性麻痹、肌萎缩侧索硬化、情感障碍、焦虑症、强迫症、人格障碍、注意缺陷障碍、注意缺陷多动障碍、图雷特综合征、泰-萨病、尼曼-皮克病和精神分裂症；脑血管病如脑或脊髓中风造成的神经损伤，包括脑膜炎和HIV在内的CNS感染造成的神经损伤，脑和脊髓肿瘤造成的神经损伤，或由普利朊病造成的神经损伤；自身免疫病，包括获得性免疫缺陷、类风湿性关节炎、牛皮癣、克罗恩氏病、舍格伦综合征、肌萎缩侧索硬化和狼疮；以及癌症，包括乳腺、前列腺、膀胱、肾脏和结肠癌。据医师认为，对人或动物施用IFN-β或其突变蛋白可通过口、腹膜内、肌肉内、皮下、静脉内、鼻内输送，或通过肺输送。
本发明提供了在没有人血清白蛋白时增加β-干扰素(IFN-β)或其生物活性变体在药物组合物中的溶解度的方法。所述方法包括用这里所述的低离子强度制剂制备组合物，以使组合物保持在约pH3.0-5.0，并在所述组合物中掺入IFN-β或其生物活性变体。在一个实施方案中，所述低离子强度的制剂含有甘氨酸、天冬氨酸或柠檬酸钠作为缓冲液，其浓度约为1mM-30mM，优选约2mM-5mM。所述组合物还可以含有非离子渗透剂，渗透剂的量足以使该组合物与这里所述的体液等渗。在一个实施方案中，所述非离子渗透剂选自海藻糖、蔗糖、甘露醇以及它们的任何混合物。此外，通过将该组合物的pH保持在约pH3.0和pH5.0，优选pH4.0，可使大部分IFN-β维持在单体状态。因此，本发明还提供了制备稳定的无HSA的基本上含单体IFN-β的药物组合物。
以下实施例是为了说明而不是为了限制。
实施例本发明是为了更好的理解IFN-β-1b的溶解度和稳定性特性。无HSA的IFN-β-1b制剂的优选特征是，pH范围约在pH3.0-pH5.0以及非常低的离子强度条件。在此pH范围内使用非常低的离子强度条件得到了较高含量的单体IFN-β-1b和较低含量的聚集的IFN-β-1b。若不在制剂中使用HAS以前无法得到这些为IFN-β-1b溶解度和稳定性提供的条件。还提供了单体IFN-β-1b含量最高的制剂。
这些实验中所用的IFN-β-1b是在大肠杆菌中产生的，所用大肠杆菌与美国专利4,462,940和/或4,816,400的前几个纯化步骤所述的大肠杆菌是一样的。这就是说，转化的细菌被用来产生IFN-β；浓缩宿主细胞，并破碎其细胞壁以得到IFN-β-1b粗物质。
这样获得的IFN-β-1b粗物质含有50mM乙酸钠、1mM EDTA、0.1％十二烷基磺酸钠(SDS)，pH为5.5。为得到用于下述溶解度和稳定性测量的起始材料，使所述粗物质通过用1.5mM pH＞11的氢氧化钠平衡的G-25柱(Pharmacia)，以从所述IFN-β-1b粗物质中除去SDS。从G-25柱收集后，迅速搅拌加入pH3的体积等于或约等于1/10收集物体积的1M甘氨酸以将收集物的pH调至约pH3。将材料贮存于4℃或冷冻随后用于溶解度和稳定性的测量。
实施例1—测定IFN-β-1b的溶解度进行最初的实验以了解在不同pH、缓冲液类型和离子强度条件下IFN-β-1b的溶解度。用表1所列的缓冲液透析IFN-β-1b溶液(约0.8mg/ml IFN-β-1b溶于100mM甘氨酸，pH3.0)。结果显示在图1中。这些结果显示，IFN-β-1b的溶解度取决于pH和离子强度。pH3.0时，IFN-β-1b在所有浓度(至200mM)的氯化钠中保持可溶解。对于pH4.0的制剂，IFN-β-1b在浓度为150mM的氯化钠中变得不太溶解。对于pH5.0的制剂，当制剂中仅含有100mM氯化钠时IFN-β-1b就变得不太溶解。总之，这些数据说明，IFN-β-1b在pH3.0的制剂中最可溶解，在pH4.0的制剂中不太溶解，在pH5.0时难溶解。这些数据还说明，增加制剂的离子强度(通过增加氯化钠浓度)也会降低IFN-β-1b的溶解度。
尽管上述实验可确定有利于IFN-β-1b溶解度的条件，但无法确定任何给定条件下溶解度的范围。进行了随后的实验以确定IFN-β-1b的溶解度范围。为使IFN-β-1b的溶解度最大，使用了低离子强度制剂(即5mM没有氯化钠等盐类的缓冲液)。透析后，浓缩IFN-β-1b以确定给定制剂中的溶解度范围。这些实验的结果显示在图2中。pH3.0和4.0的制剂最可溶解，其溶解度至少为16mg/ml。pH5.0时制剂的溶解度约为8mg/ml。pH5.0以上制剂的溶解度仅约0.2mg/ml。这些结果再次说明pH有力地影响IFN-β-1b的溶解度。pH3.0和pH4.0时低离子强度制剂较之pH5.0时更加可溶解。pH5.0以上，IFN-β-1b在低离子强度制剂中基本上不溶解。
表1测定IFN-β-1b溶解度的制剂的pH、缓冲液类型和氯化钠浓度缓冲液pH 氯化钠浓度(mM)5mM甘氨酸 pH3 0mM5mM甘氨酸 pH3 50mM5mM甘氨酸 pH3 100mM5mM甘氨酸 pH3 150mM5mM柠檬酸盐 pH4 0mM5mM柠檬酸盐 pH4 50mM5mM柠檬酸盐 pH4 100mM5mM柠檬酸盐 pH4 150mM5mM乙酸盐 pH4 0mM5mM乙酸盐 pH4 50mM5mM乙酸 pH4 100mM5mM乙酸盐 pH4 150mM5mM甲酸盐 pH4 0mM5mM甲酸盐 pH4 50mM5mM甲酸盐 pH4 100mM5mM甲酸盐 pH4 150mM5mM乙酸盐 pH5 0mM5mM乙酸盐 pH5 50mM5mM乙酸盐 pH5 100mM5mM乙酸盐 pH5 150mM5mM组氨酸 pH5 0mM5mM组氨酸 pH5 50mM5mM组氨酸 pH5 100mM5mM组氨酸 pH5 150mM5mM琥珀酸钠 pH5 0mM5mM琥珀酸钠 pH5 50mM5mM琥珀酸钠 pH5 100mM5mM琥珀酸钠 pH5 150mM实施例2—分析型超速离心实验尽管溶解度实验可确定溶液中有多少IFN-β-1b，但需要其它技术以确定蛋白质的聚集状态。重要的是确定蛋白质在给定的制剂中是是呈单体以及确定有多少蛋白质(如果有的话)以较高次序形式(如二聚体、三聚体等)存在。分析型超速离心是阐明蛋白质聚集状态的最有效的技术之一(参见Liu和Shire(1999)J.Pharm.Sci.881237-1241)。进行了三次实验用分析型超速离心表征几种IFN-β-1b制剂的单体含量。这些分析型超速离心实验分别是用不同的IFN-β-1b制剂进行的。这样，每个实验都有常规配方(5mM甘氨酸，pH3.0)。然而，每个常规配方在单体百分比上都有轻微差别(图3-89.8％；图6-94.2％；图9-86.3％)。用于制备这些IFN-β-1b制剂的回收和纯化过程产生了一些IFN-β-1b分子的聚集体，天然状态中它们主要是共价的。因此，对每个实验而言，5mM甘氨酸、pH3.0的配方在每个实验开始时作为制剂中聚集体量的基线。
第一个实验测定了pH对IFN-β-1b聚集状态的影响。分析了pH3.0(仅含5mM甘氨酸以缓冲此溶液)、pH4.0(仅含5mM天冬氨酸以缓冲此溶液)和pH5.0(仅含5mM琥珀酸钠以缓冲此溶液)的制剂。结果显示在图3，4和5中。这些图中的主峰相应于约20kDa的分子量，这与IFN-β-1b的分子量(19.878kDa)非常接近。因此主峰是IFN-β-1b单体。较大的种类(二聚体、三聚体等)与较高的沉降系数相符合。这些结果显示，尽管pH3.0和pH4.0时IFN-β-1b主要为单体(约90％)，但在pH5.0时分子开始聚集成较高次序的种类且只有约75％为单体。这些结果说明，IFN-β-1b的聚集状态对pH的变化敏感，IFN-β-1b单体偏爱低pH条件，如pH3.0和pH4.0。
第二个实验研究了离子强度对IFN-β-1b聚集状态的影响。在pH3.0(用5mM甘氨酸缓冲)的制剂中，通过加入0.50mM和150mM氯化钠来增加制剂中的离子强度。结果显示在图6、7和8中。对未添加氯化钠的制剂(图6)，单体形式的IFN-β-1b约占总IFN-β-1b的94％(即94％主峰)。当制剂中加入50mM氯化钠时，单体含量降至约76％(图7)，制剂中加入150mM氯化钠时，单体含量降至10％以下(图8)。这些结果说明，IFN-β-1b的聚集状态很容易受离子强度的影响，且IFN-β-1b单体偏爱低离子强度的条件。
可注射的药物制剂的一个所需特征是与体液等渗。可用离子性物质(如氯化钠)和非离子物质(如蔗糖和海藻糖)使所述制剂与体液等渗。上述分析型超速离心实验测定的制剂既不是等渗的(仅含5mM缓冲液)也不含有作为离子渗透剂的氯化钠。第三个实验测定了非离子渗透剂对IFN-β-1b聚集状态的影响。在这个实验中制备了三种pH3.0的制剂(用5mM甘氨酸缓冲)。一种仅含甘氨酸缓冲剂，第二种用9％蔗糖渗透，第三种用9％海藻糖渗透。分析型超速离心结果显示在图9、10和11中。具含有缓冲剂的制剂的单体含量(图9)约为86％。当加入作为渗透剂的蔗糖(图10)或海藻糖(图11)时，单体含量约为89％。这些结果说明，非离子渗透剂如蔗糖和海藻糖不会促进IFN-β-1b分子的聚集。
实施例3—升高的温度条件下无HSA的IFN-β-1b的冻干制剂的稳定性将含有9％海藻糖(pH3.0和pH4.0)或9％蔗糖(pH4.0)的pH3.0(5mM甘氨酸作为缓冲液)和pH4.0(5mM天冬氨酸作为缓冲液)的无HSA的IFN-β-1b制剂冻干。然后将冻干的制剂贮存在40℃并在8周内测定其稳定性。蔗糖和海藻糖是典型的用于冻干制剂的稳定剂。以9％的水平使用这些制剂，这样重建的制剂将与体液等渗。为使制剂的离子强度最小化，从而使聚集的IFN-β-1b量最少，将缓冲液的量保持在最低水平。因此，所有缓冲液的浓度都为5mM。
蛋白质药物制品的典型储藏条件通常为5℃。然而，升高的温度条件通常用于制剂研究以增加特定制剂的降解速度，这样就可在较短时间内收集到相对稳定性数据。这一实验中，采用40℃试图迫使无HSA制剂中的IFN-β-1b降解。浓度测量和反相PHLC(RP-HPLC)分析的结果显示在图12和13中。这些结果显示，即使在升高的温度下，这些IFN-β-1b制剂在8周的研究期间仍未显示出可检测的变化。
实施例4—实时储藏条件下含海藻糖的无HSA的IFN-β-1b的冻干制剂的稳定性尽管蛋白质药物的典型储藏条件是5℃，需要使产品具有室温稳定性(25℃-30℃)。在这一实验中，将含有9％海藻糖的制剂(5mM甘氨酸，pH3，或5mM天冬氨酸，pH4)冻干。使用浓度为9％的海藻糖，这样重建的制剂将与体液等渗。将制剂储藏在5℃和30℃，并在9个月内测定其稳定性。浓度测量和反相HPLC(RP-HPLC)分析的结果显示在图14和15中。这些结果显示，即便在30℃下，这些IFN-β-1b制剂在9个月的研究期间仍未显示出可测检的变化。
实施例5—升高的温度条件下无HSA的IFN-β-1b的液体制剂的稳定性还在液体状态检测了pH3.0和pH4.0时无HSA的IFN-β-1b制剂的稳定性。所述制剂组合物与实施例3中列出的相同(9％海藻糖(pH3.0和pH4.0)或9％蔗糖(pH4.0))。再者，为使制剂的离子强度最小化，从而使聚集的IFN-β-1b量最少，将缓冲液的量保持在最低水平(5mM)。将液体制剂储藏在30℃并在9周内测定其稳定性。液体蛋白质制剂的典型储藏条件是5℃。因此，30℃储藏代表用来加快IFN-β-1b降解速度的升高的温度条件。图16(浓度测量)和图17(反相HPLC分析)中显示的结果表明9周研究期间制剂没有可检测的变化。这些结果说明，这些条件下，这些制剂中IFN-β-1b在研究期间是稳定的。
实施例6—实时储藏条件下无HSA的IFN-β-1b的液体制剂的稳定性在这一实验中，在5℃的实时储藏条件下检测了含9％海藻糖(5mM甘氨酸，pH3，或5mM天冬氨酸，pH4)或9％蔗糖(5mM甘氨酸，pH3，或5mM天冬氨酸，pH4)的液体制剂。将制剂装入小瓶并在9个月内测量其稳定性。浓度测量和反相HPLC(RP-HPLC)分析的结果分别显示在图18和19中。这些结果显示，这些制剂中的IFN-β-1b在9个月的研究中是稳定的。
实施例7—与蔗糖相比，海藻糖是优选的IFN-β-1b制剂的非离子渗透剂在这一实验中，制备了含9％海藻糖(5mM甘氨酸，pH3，或5mM天冬氨酸，pH4)和9％蔗糖(5mM甘氨酸，pH3，或5mM天冬氨酸，pH4)的制剂，并将其作为液体装进小瓶子，并将装有同一制剂的小瓶冻干。在升高的温度条件下测量其稳定性，通常预测所给蛋白质制剂稳定性的排列次序。将液体制剂在30℃储藏9周，冻干制剂在40℃储藏8周。浓度测量的结果显示在图20(液体)和图21(冻干的)中。这些结果说明，pH3时含有蔗糖的制剂在浓度上明显增加。这种浓度的显著提高是由于蔗糖在低pH下水解形成还原糖造成的。导致制剂的非酶促褐变(即美拉德反应)。海藻糖更耐水解，因此与蔗糖相比，在这些制剂中是优选的(参见O’Brien(1996)Science 61679-682)。
实施例8用盐酸胍沉淀除去SDS和IFN-β-1b的制剂将纯化的IFN-β-1b(1L 1.91mg/ml溶于液0.4％SDS、50mM乙酸盐缓冲液，pH5.5)贮存在5℃。在贮存期间，有一些SDS沉淀。将250ml该物质(477.5mg)与229g盐酸胍(6M，总体积400ml)混合，并在室温下用磁力搅拌棒搅拌15分钟。然后用SartobranP Capsule(孔径0.45μm)过滤6M盐酸胍/蛋白质溶液以除去沉淀的SDS。在280nm处用UV测得的蛋白质浓度为1.02mg/ml。蛋白质产量为406mg或85％。
用装有两层PelliconXL Biomax0.1cm210kD聚砜膜(Millipore公司)的MilliporeLabscaleTFF渗滤系统(Millipore公司)浓缩400ml经盐酸胍处理的物质。浓缩后的体积为37ml，蛋白质浓度为10.3mg/ml，产量为381mg或93％。
用移液管，在10ml(103mg)浓缩的盐酸胍/蛋白质溶液中逐滴加入590ml的5mM甘氨酸溶液(pH3.2)。用磁力搅拌棒迅速搅拌此溶液；将蛋白质溶液直接加到旋涡中。这种稀释60倍的6M盐酸胍/蛋白质溶液产生了0.1M盐酸胍/蛋白质溶液，其浓度为0.17mg/ml。将此600ml转移到装有两层PelliconII 10kD，0.1cm2聚砜膜的500ml刻度渗滤装置。将此溶液先浓缩成约400mL，蛋白质浓度为0.23mg/ml，然后用9倍体积(3.6L)的5mM甘氨酸(pH3.2)渗滤。在280nm处用UV测得的最终渗滤液(402ml)的最终蛋白质浓度为0.23mg/ml，即渗滤步骤的产量为92.46mg或90％，纯化步骤可溶蛋白质的总产量为72％。
实施例9—含有甘露醇作为渗透剂的无HSA的IFN-β-1b液体制剂的稳定性在这一实验中，在5℃的实时储藏条件下检测含有5mM天冬氨酸、5％甘露醇的液体制剂。用单批的无HAS的IFN-β-1b制备了三种单独的制品(称为制品A、制品B和制品C)，将其装入小瓶中。将小瓶贮存在5℃，并在6个月内测量制剂的稳定性。浓度测量和反相HPLC(RP-HPLC)分析的结果分别显示在图22和23中。这些结果显示，这些IFN-β-1b制剂在6个月的研究期间仍未显示出可检测的变化。
说明书中提到的所有出版物和专利申请是表示适合此发明的本领域熟练技术人员的水平。本文纳入的所有出版物和专利申请在相同程度上作为参考，似乎各出版物或专利申请都是具体地和单独地纳入作为参考。说明书中列出副标题只是为了更容易地评述文件，并不打算以任何方式对文献的内容进行限定。
尽管上述发明已经以说明和实施例方式在某些细节上作了描述以便达到清楚理解本发明的目的，但显然在实际操作过程中可以在本发明的范围内作某些改变和调整。
权利要求
1.一种稳定的无HSA的药物组合物，所述组合物基本上含有溶于低离子强度制剂的单体β-干扰素(IFN-β)或其生物活性变体，其特征在于，所述低离子强度制剂是含有缓冲液的溶液，所述缓冲液的量足以使所述组合物保持在特定pH±0.5个单位内，其中特定pH约为3.0-5.0，所述制剂的离子强度不超过约60mM。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述缓冲液以约的1mM-30mM的浓度存在。
3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述缓冲液以约1mM-10mM的浓度存在。
4.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述缓冲液以约2mM-7mM的浓度存在。
5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述缓冲液以约2mM-5mM的浓度存在。
6.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述缓冲液以约5mM的浓度存在。
7.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述特定pH约为3.0，且其中所述缓冲液是甘氨酸。
8.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述特定pH为约4.0，且其中所述缓冲液是天冬氨酸。
9.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述特定pH约为5.0，且其中所述缓冲液是琥珀酸钠。
10.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述特定pH约为3.0，且其中所述缓冲液是甘氨酸。
11.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述特定pH约为4.0，且其中所述缓冲液是天冬氨酸。
12.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述特定pH约为5.0，且其中所述缓冲液是琥珀酸钠。
13.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物为液体或干燥形式，其中所述干燥形式选自冻干形式、空气干燥形式和喷雾干燥形式。
14.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物为含水或不含水的溶液、含水或不含水的悬液、或适合通过肺吸入输送到受试者的干粉形式。
15.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，它还含有足以使所述组合物等渗的非离子渗透剂的量，其中所述非离子渗透剂是海藻糖。
16.如权利要求15所述的组合物，其特征在于，所述海藻糖的浓度以每体积的重量计为9％。
17.如权利要求15所述的组合物，其特征在于，所述组合物为液体或干燥形式，其中所述干燥形式选自冻干形式、空气干燥形式和喷雾干燥形式。
18.如权利要求15所述的组合物，其特征在于，所述组合物为含水或不含水的溶液、含水或不含水的悬液、或适合通过肺吸入输送到受试者的干粉形式。
19.如权利要求10所述的组合物，其特征在于，它还含有足以使所述组合物等渗的非离子渗透剂的量，其中所述非离子渗透剂是海藻糖。
20.如权利要求19所述的组合物，其特征在于，所述海藻糖的浓度以每体积的重量计为9％。
21.如权利要求19所述的组合物，其特征在于，所述组合物为液体或干燥形式，其中所述干燥形式选自冻干形式、空气干燥形式和喷雾干燥形式。
22.如权利要求19所述的组合物，其特征在于，所述组合物为含水或不含水的溶液、含水或不含水的悬液、或适合通过肺吸入输送到受试者的干粉形式。
23.如权利要求11所述的组合物，其特征在于，它还含有足以使所述组合物等渗的非离子渗透剂的量，其中所述非离子渗透剂是海藻糖。
24.如权利要求23所述的组合物，其特征在于，所述海藻糖的浓度以每体积的重量计约为9％。
25.如权利要求23所述的组合物，其特征在于，所述组合物为液体或干燥形式，其中所述干燥形式选自冻干形式、空气干燥形式和喷雾干燥形式。
26.如权利要求23所述的组合物，其特征在于，所述组合物为含水或不含水的溶液、含水或不含水的悬液、或适合通过肺吸入输送到受试者的干粉形式。
27.如权利要求12所述的组合物，其特征在于，它还含有足以使所述组合物等渗的非离子渗透剂的量，其中所述非离子渗透剂是海藻糖。
28.如权利要求27所述的组合物，其特征在于，所述海藻糖的浓度以每体积的重量计约为9％。
29.如权利要求27所述的组合物，其特征在于，所述组合物为液体或干燥形式，其中所述干燥形式选自冻干形式、空气干燥形式和喷雾干燥形式。
30.如权利要求27所述的组合物，其特征在于，所述组合物为含水或不含水的溶液、含水或不含水的悬液、或适合通过肺吸入输送到受试者的干粉形式。
31.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述IFN-β是具有天然成熟的IFN-β的氨基酸序列的多肽或其生物活性变体。
32.如权利要求31所述的组合物，其特征在于，所述IFN-β是重组产生的。
33.如权利要求32所述的组合物，其特征在于，所述IFN-β是糖基化或非糖基化的。
34.如权利要求33所述的组合物，其特征在于，所述IFN-β是非糖基化的人IFN-β(hIFN-β)或其生物活性变体。
35.如权利要求34所述的组合物，其特征在于，所述突变蛋白是hIFN-βserl7。
36.一种稳定的无HSA的药物组合物，所述组合物基本上含有溶于低离子强度制剂的单体β-干扰素(IFN-β)或其生物活性变体，其特征在于，所述低离子强度制剂是含有选自甘氨酸、天冬氨酸或琥珀酸钠的缓冲液的溶液，缓冲液浓度为约1mM-10mM，所述组合物的pH约为3.0-5.0，且其中所述制剂的离子强度不超过约60mM。
37.如权利要求36所述的组合物，其特征在于，所述IFN-β是重组人IFN-β(rhIFN-β)或其生物活性变体。
38.如权利要求37所述的组合物，其特征在于，所述rhIFN-β或其生物活性变体是非糖基化的。
39.如权利要求38所述的组合物，其特征在于，所述突变蛋白是hIFN-βser17。
40.如权利要求36所述的组合物，其特征在于，所述rhIFN-β以的0.01mg/ml-20.0mg/ml的浓度存在。
41.如权利要求36所述的组合物，其特征在于，所述缓冲液是甘氨酸，所述甘氨酸以约5mM的浓度存在，且其中所述组合物的pH约为3.0。
42.如权利要求41所述的组合物，其特征在于，它还含有以每体积重量计的9％海藻糖。
43.如权利要求36所述的组合物，其特征在于，所述缓冲液是天冬氨酸，所述天冬氨酸以约5mM的浓度存在，且其中所述组合物的pH约为4.0。
44.如权利要求43所述的组合物，其特征在于，它还含有以每体积重量计约9％海藻糖。
45.如权利要求36所述的组合物，其特征在于，所述缓冲液是琥珀酸钠，所述琥珀酸钠以约5mM的浓度存在，且其中所述组合物的pH约为5.0。
46.如权利要求45所述的组合物，其特征在于，它还含有以每体积重量计的9％海藻糖。
47.如权利要求36所述的组合物，其特征在于，所述组合物为液体或干燥形式，其中所述干燥形式选自冻干形式、空气干燥形式和喷雾干燥形式。
48.如权利要求36所述的组合物，其特征在于，所述组合物为含水或不含水的溶液、含水或不含水的悬液、或适合通过肺吸入输送到受试者的干粉形式。
49.如权利要求41所述的组合物，其特征在于，所述组合物为液体或干燥形式，其中所述干燥形式选自冻干形式、空气干燥形式和喷雾干燥形式。
50.如权利要求41所述的组合物，其特征在于，所述组合物为含水或不含水的溶液、含水或不含水的悬液、或适合通过肺吸入输送到受试者的干粉形式。
51.如权利要求43所述的组合物，其特征在于，所述组合物为液体或干燥形式，其中所述干燥形式选自冻干形式、空气干燥形式和喷雾干燥形式。
52.如权利要求43所述的组合物，其特征在于，所述组合物为含水或不含水的溶液、含水或不含水的悬液、或适合通过肺吸入输送到受试者的干粉形式。
53.如权利要求45所述的组合物，其特征在于，所述组合物为液体或干燥形式，其中所述干燥形式选自冻干形式、空气干燥形式和喷雾干燥形式。
54.如权利要求45所述的组合物，其特征在于，所述组合物为含水或不含水的溶液、含水或不含水的悬液、或适合通过肺吸入输送到受试者的干粉形式。
55.如权利要求42所述的组合物，其特征在于，所述组合物为液体或干燥形式，其中所述干燥形式选自冻干形式、空气干燥形式和喷雾干燥形式。
56.如权利要求42所述的组合物，其特征在于，所述组合物为含水或不含水的溶液、含水或不含水的悬液、或适合通过肺吸入输送到受试者的干粉形式。
57.如权利要求44所述的组合物，其特征在于，所述组合物为液体或干燥形式，其中所述干燥形式选自冻干形式、空气干燥形式和喷雾干燥形式。
58.如权利要求44所述的组合物，其特征在于，所述组合物为含水或不含水的溶液、含水或不含水的悬液、或适合通过肺吸入输送到受试者的干粉形式。
59.如权利要求46所述的组合物，其特征在于，所述组合物为液体或干燥形式，其中所述干燥形式选自冻干形式、空气干燥形式和喷雾干燥形式。
60.如权利要求46所述的组合物，其特征在于，所述组合物为含水或不含水的溶液、含水或不含水的悬液、或适合通过肺吸入输送到受试者的干粉形式。
61.一种稳定的无HSA的药物组合物，所述组合物基本上含有溶于低离子强度制剂的单体β-干扰素(IFN-β)或其生物活性变体，其特征在于，所述低离子强度的制剂是含有甘氨酸作为缓冲液的溶液，其特征在于，所述缓冲液以约2mM-5mM的浓度存在，所述组合物的pH约为3.0-4.0，且其中所述制剂的离子强度不超过40mM。
62.如权利要求61所述的组合物，其特征在于，所述rhIFN-β或其生物活性变体是非糖基化的。
63.如权利要求62所述的组合物，其特征在于，所述突变蛋白是hIFN-βser17。
64.如权利要求63所述的组合物，其特征在于，所述缓冲液以约5mM的浓度存在，所述pH约为3.0，且所述离子强度不超过约20mM。
65.如权利要求61所述的组合物，其特征在于，所述组合物为液体或干燥形式，其中所述干燥形式选自冻干形式、空气干燥形式和喷雾干燥形式。
66.如权利要求61所述的组合物，其特征在于，所述组合物为含水或不含水的溶液、含水或不含水的悬液、或适合通过肺吸入输送到受试者的干粉形式。
67.如权利要求61所述的组合物，其特征在于，它还含有以每体积重量计约9％海藻糖。
68.一种稳定的无HSA的药物组合物，所述组合物基本上含有溶于低离子强度制剂的单体β-干扰素(IFN-β)或其生物活性变体，其特征在于，所述低离子强度的制剂是含有天冬氨酸作为缓冲液的溶液，其特征在于，所述缓冲液以约2mM-5mM的浓度存在，所述组合物的pH约为3.5-4.5，且其中所述制剂的离子强度不超过约40mM。
69.如权利要求68所述的组合物，其特征在于，所述rhIFN-β或其生物活性变体是非糖基化的。
70.如权利要求69所述的组合物，其特征在于，所述突变蛋白是hIFN-βserl7。
71.如权利要求68所述的组合物，其特征在于，所述缓冲液以约5mM的浓度存在，所述pH约为4.0，且所述离子强度不超过约20mM。
72.如权利要求68所述的组合物，其特征在于，所述组合物为液体或干燥形式，其中所述干燥形式选自冻干形式、空气干燥形式和喷雾干燥形式。
73.如权利要求68所述的组合物，其特征在于，所述组合物为含水或不含水的溶液、含水或不含水的悬液、或适合通过肺吸入输送到受试者的干粉形式。
74.如权利要求68所述的组合物，其特征在于，它还含有以每体积重量计约9％海藻糖。
75.一种稳定的无HSA的药物组合物，所述组合物基本上含有溶于低离子强度制剂的单体β-干扰素(IFN-β)或其生物活性变体，其特征在于，所述低离子强度的制剂是含有琥珀酸钠作为缓冲液的溶液，其特征在于，所述缓冲液以约2mM-5mM的浓度存在，所述组合物的pH约为4.5-5.0，且其中所述制剂的离子强度不超过约40mM。
76.如权利要求75所述的组合物，其特征在于，所述rhIFN-β或其生物活性变体是非糖基化的。
77.如权利要求76所述的组合物，其特征在于，所述突变蛋白是hIFN-βser17。
78.如权利要求75所述的组合物，其特征在于，所述缓冲液以约5mM的浓度存在，所述pH约为5.0，且所述离子强度不超过约20mM。
79.如权利要求75所述的组合物，其特征在于，所述组合物为液体或干燥形式，其中所述干燥形式选自冻干形式、空气干燥形式和喷雾干燥形式。
80.如权利要求75所述的组合物，其特征在于，所述组合物为含水或不含水的溶液、含水或不含水的悬液、或适合通过肺吸入输送到受试者的干粉形式。
81.如权利要求75所述的组合物，其特征在于，它还含有以每体积重量计约9％海藻糖。
82.一种在没有人血清白蛋白时增加β-干扰素(IFN-β)或其生物活性变体在药物组合物中的溶解度的方法，所述方法包括用低离子强度制剂制备所述组合物，其特征在于。其中所述低离子强度制剂是含有缓冲液的溶液，缓冲液的量足以使所述组合物保持在特定pH±0.5个单位内，其中特定pH约为3.0-5.0，所述制剂的离子强度不超过约60mM，并将所述IFN-β或其生物活性变体加到所述组合物中。
83.如权利要求82所述的方法，其特征在于，所述缓冲液以约1mM-30mM的浓度存在。
84.如权利要求83所述的方法，其特征在于，所述缓冲液以约2mM-5mM的浓度存在。
85.如权利要求84所述的方法，其特征在于，所述特定pH约为3.0，且其中所述缓冲液是甘氨酸。
86.如权利要求84所述的方法，其特征在于，所述特定pH约为4.0，且其中所述缓冲液是天冬氨酸。
87.如权利要求84所述的方法，其特征在于，所述特定pH约为5.0，且其中所述缓冲液是琥珀酸钠。
88.如权利要求82所述的组合物，其特征在于，它还含有足以使所述组合物等渗的非离子渗透剂的量，其中所述非离子渗透剂是海藻糖。
89.如权利要求82所述的组合物，其特征在于，还包含制备所述组合物的干燥形式的步骤，其中所述干燥形式选自冻干形式、空气干燥形式和喷雾干燥形式。
90.如权利要求82所述的组合物，其特征在于，所述组合物为含水或不含水的溶液、含水或不含水的悬液、或适合通过肺吸入输送到受试者的干粉形式。
91.一种用权利要求82所述方法制得的药物组合物。
92.一种制备基本上含单体β-干扰素(IFN-β)的无HSA的药物组合物的方法，所述方法包括用低离子强度制剂制备所述组合物，其特征在于，所述低离子强度制剂是含有缓冲液的溶液，缓冲液的量足以使所述组合物保持在特定pH±0.5个单位内，其中特定pH约为3.0-5.0，所述制剂的离子强度不超过约60mM，并将所述IFN-β或其生物活性变体加到所述组合物中。
93.如权利要求92所述的方法，其特征在于，所述缓冲液以约1mM-30mM的浓度存在。
94.如权利要求93所述的方法，其特征在于，所述缓冲液以约2mM-5mM的浓度存在。
95.如权利要求94所述的方法，其特征在于，所述特定pH约为3.0，且其中所述缓冲液是甘氨酸。
96.如权利要求94所述的方法，其特征在于，所述特定pH约为4.0，且其中所述缓冲液是天冬氨酸。
97.如权利要求94所述的方法，其特征在于，所述特定pH约为5.0，且其中所述缓冲液是琥珀酸钠。
98.如权利要求92所述的组合物，其特征在于，它还含有足以使所述组合物等渗的非离子渗透剂的量，其中所述非离子渗透剂是海藻糖。
99.如权利要求92所述的组合物，其特征在于，还包含制备所述组合物的干燥形式的步骤，其中所述干燥形式选自冻干形式、空气干燥形式和喷雾干燥形式。
100.如权利要求92所述的组合物，其特征在于，所述组合物为含水或不含水的溶液、含水或不含水的悬液、或适合通过肺吸入输送到受试者的干粉形式。
101.一种用权利要求92所述方法制得的药物组合物。
102.一种用于诊断、预防或治疗对β-扰素(IFN-β)治疗有响应的疾病的制剂，其特征在于，所述制剂含有如权利要求1、36、61、68或75所述的药物组合物。
全文摘要
提供了基本上含有单体β－干扰素(IFN－β)的稳定的药物组合物及其制备方法。提供了含有IFN－β的组合物，其中IFN－β溶于使所述组合物保持在pH约5的低离子强度制剂中，制备这些组合物的方法以及增加IFN－β在药物组合物中的溶解度的方法。
文档编号A61P25/28GK1511053SQ01823122
公开日2004年7月7日 申请日期2001年10月26日 优先权日2001年4月9日
发明者B·A·雪莉, B A 雪莉, M·乔伊, 账, M·特勒斯, 伎, S·巴布卡 申请人:希龙公司