NP)、4, 5,-二甲氧-2-硝基肉桂酰胺（硝基肉桂酰胺， NCA)、2-(3, 4-二甲氧基苯基）-喹啉-4-脲（苯基喹诺酮，DPQ)、2, 1，3-苯并噁二唑-5-脲 (苯并呋咱，BF)、3_羟基-2-喹喔啉脲（羟基喹喔啉，HQ)、4-(二甲氨基）偶氮苯-4' -磺 酰胺（DABSYL)、鱼藤酮异噁唑啉（Rot)、（E)-2-(2-(2-氧代-2, 3-二氢-IH-苯并[b][l，4] 二氮杂.暴_4_基）苯氧基）乙酰胺（苯并二氮杂藥::，130)、7-(二乙氨基）-2-氧代-2!1-色 烯-3-羧酸（香豆素343,⑶0)、2-乙酰氨基-4-甲基-5-噻唑磺酰胺（噻唑磺酰胺，TS) 和对甲氧基苯基吡唑基鬼白酰胺（pHVIehtoxyphenylpyrazopodophyllamide) (Podo)。
[0071] 在一些实施方案中，核酸通过使用质谱分析（例如，Abbott PLEX-ID系统， Abbot Ibis Biosciences, Abbott Park, Illinois)鉴定独特的喊基组成标记（base composition signature，BCS)而检测和表征，如美国专利 7, 108, 974、8, 017, 743 和 8, 017, 322中所描述的，其各自通过引用以其整体结合到本文中。
[0072] 在一些实施方案中，利用核酸测序方法来检测。在一些实施方案中，本文所提供 的技术可用于第二代（又称下一代或Next-Gen)、第三代（又称下下代）或第四代（又称 N3_Gen)测序技术，包括但不限于，焦磷酸测序、连接法测序（sequencing-by-ligation)、 单分子测序、合成法测序（sequence-by-synthesis) (SBS)、大规模并行克隆、大规模并行 单分子SBS、大规模并行单分子实时、大规模并行单分子实时纳米孔技术等。Morozova和 Marra在92: 255 (2008)中提供了一些此种技术的综述，通过引用以其整体结 合到本文中。本领域普通技术人员将认识到由于RNA在细胞中不太稳定并且实验中更易被 核酸酶攻击，因此测序前通常将RNA反转录为DNA。
[0073] 本领域已知多种DNA测序技术，包括基于荧光的测序方法（参见，例如，Birren等， Genome Analysis: Analyzing DNA (基因组分析：分析 DNA), 1，Cold Spring Harbor, N.Y.;通过引用以其整体结合到本文中）。在一些实施方案中，所述技术可用于该领域所 理解的自动化测序技术。在一些实施方案中，本技术可用于分段扩增子的并行测序（Kevin McKernan等的PCT公布号W02006084132,通过引用以其整体结合到本文中）。在一些实施 方案中，所述技术可用于通过并行寡核苷酸延伸的DNA测序（参见，例如，Macevicz等的 美国专利号5, 750, 341和Macevicz等的美国专利号6, 306, 597,二者通过引用以其整体结 合到本文中）。可使用所述技术的测序技术的额外实例包括Church polony技术（Mitra 等，2003， Analytical Biochemistry 320， 55-65; Shendure 等，2005 Science 309， 1728-1732;美国专利号6, 432, 360，美国专利号6, 485, 944，美国专利号6, 511，803;通 过引用以其整体结合到本文中）、454 picotiter焦磷酸测序技术（Margulies等，2005 Nature 437，376-380; US 20050130173;通过引用以其整体结合到本文中）、Solexa 单喊基添加技术（Bennett 等，2005，Pharmacogenomics, 6，373-382;美国专利号 6,787,308;美国专利号6, 833, 246;通过引用以其整体结合到本文中）、Lynx大规模 并行标记测序技术（Brenner等（2000). Nat. Biotechnol. 18:630-634;美国专利号 5, 695, 934;美国专利号5, 714, 330;通过引用以其整体结合到本文中）和Adessi PCR集 落技术（Adessi 等（2000). NucleicAcidRes. 28，E87; WO 00018957;通过引用以其 整体结合到本文中）。
[0074] 下一代测序（NGS)方法具有大规模并行、高通量策略这一共同特征，目标是比先 前测序方法的成本更低（参见，例如，Voelkerding等，CAeva，641-658， 2009; MacLean等，#iCiOAioJ.，7.· 287-296;各自通过引用以其整体结合 到本文中）。NGS方法可大致分为通常使用模板扩增的那些和不使用模板扩增的那些。需 要扩增的方法包括作为454技术平台（例如，GS20和GS FLX)由Roche商业化的焦磷酸 测序、由Illumina商业化的Solexa平台和由Applied Biosystems商业化的Supported Oligonucleotide Ligation and Detection (SOLiD)平台。非扩增方法，也称为单分子 测序，例如Helicos BioSciences商业化的HeliScope平台以及分别由VisiGen、Oxford Nanopore Technologies Ltd., Life Technologies/Ion Torrent和Pacific Biosciences 商业化的新兴平台。
[0075] 在焦磷酸测序中（Voelkerding 等，CAeva，641-658，2009; 1&^1^&11等，他加1^你^.#_/^1'〇以〇2，7.，287-296 ;美国专利号6,210,891;美国专利 号6, 258, 568;各自通过引用以其整体结合到本文中），将模板DNA片段化、末端-修复、 与接头连接并通过用含有与接头互补的寡核苷酸的珠子捕获单个模板分子的原位克隆扩 增。将含有单个模板类型的各珠划分为油包水微泡，并使用称作乳液PCR的技术克隆扩增 模板。扩增后使乳液破裂并将珠子沉积到测序反应期间充当流动池的Picotitre板的单个 孔中。在测序酶和发光报告物例如荧光素酶存在下，在流动池中，将4种dNTP试剂的每种 进行有序反复引入。如果适当的dNTP被加至测序引物的3'末端，结果产生的ATP导致孔 内发光的爆发，这使用CCD照相机记录。达到大于或等于400个碱基的阅读长度是可能的， 并且可达到IO 6个序列阅读，结果是多达5亿个碱基对（Mb)的序列。
[0076] 在 Solexa/Illumina 平台中（Voelkerding 等，CAeva，5^·· 641-658， 2009; MacLean 等，yVaiyre WeK. ificiOhW·，7..287-296;美国专利号 6, 833, 246;美 国专利号7, 115, 400;美国专利号6, 969, 488;各自通过引用以其整体结合到本文中），测 序数据以较短长度阅读的形式产生。在该方法中，末端修复单链片段化的DNA以产生5'-磷 酸化钝末端，接着为Klenow-介导的单个A碱基至片段3'末端的添加。A-添加促进T-突 出接头寡核苷酸的添加，其随后用于捕获布满寡核苷酸锚的流动池表面的模板-接头分 子。所述锚用作PCR引物，但由于模板的长度以及其与其它附近锚寡核苷酸的接近度，PCR 延伸导致该分子"拱悬（arching over) "与邻近锚寡核苷酸杂交以在流动池表面上形成桥 状结构。将这些DNA环变性和切割。然后用可逆染料终止剂对正向链测序。所掺入核苷酸 的序列通过检测掺入后荧光而测定，去除各荧光剂（fluor)和阻断（block)，然后进行下一 个dNTP添加循环。序列阅读长度范围为36个核苷酸到超过50个核苷酸，每个分析运行的 总体输出超过十亿个核苷酸对。
[0077] 使用SOLiD技术对核酸分子测序（Voelkerding等， Cl ini cal Chem. , 55: 641-658，2009; MacLean 等，yVaiyreWeK. ificiOhW·，7·· 287-296;美国专利号 5,912，148;美国专利号6，130,073;各自通过引用以其整体结合到本文中）也涉及模板 的片段化、与寡核苷酸接头连接、连接至珠和通过乳液PCR克隆扩增。这之后，将含有模板 的珠子固定化在玻璃流动池的衍生表面，并使与接头寡核苷酸互补的引物退火。然而，不是 利用该引物进行3'延伸，而是用于提供5'磷酸基团与包含两个探针-特异性碱基接着6 个简并碱基和4种焚光标记之一的检查探针（interrogation probe)连接。在SOLiD系统 中，检查探针在每个探针的3'末端具有16种可能的两个碱基组合并且在5'末端具有4种 荧光剂之一。荧光剂颜色，以及因此各个探针的身份，对应于指定的颜色-空间编码方案。 多轮（通常7)探针退火、连接和荧光剂检测之后是变性，然后使用相对于最初的引物具有 1个碱基偏移的引物第二轮测序。以这种方式，可以计算方式重构模板序列，并且模板碱基 被检查两次，使得准确度增加。序列阅读长度平均35个核苷酸，并且每次测序运行的总体 输出超过40亿碱基。
[0078] 在某些实施方案中，所述技术可用于纳米孔测序（参见，例如，Astier等，J. Am. Chem. Soc. 2006 Feb 8; 128(5):1705 - 10,通过引用结合到本文中）。纳米孔测序的理 论与当将纳米孔浸在电导液中并在跨过纳米孔而施加电势（电压）时所发生的有关。在这 些条件下，可观察到由于通过纳米孔的离子传导所致的轻微电流，并且电流的量对纳米孔 的大小极度敏感。随着核酸的各个碱基穿过纳米孔，这导致通过纳米孔的电流强度变化，该 变化对于四个碱基中的每个是不同的，从而允许确定DNA分子的序列。
[0079] 在某些实施方案中，所述技术可用于Helicos BioSciences的HeliScope (Voelkerding 等，CAeva，5^·· 641-658，2009; MacLean 等，TfeK. ificiOAioA, 7.· 287-296;美国专利号7, 169, 560;美国专利号7, 282, 337;美国专利号 7,482，120;美国专利号7, 501，245;美国专利号6, 818, 395;美国专利号6, 911，345;美 国专利号7,501，245;各自通过引用以其整体结合到本文中）。将模板DNA片段化并在3' 末端多聚腺苷化，最后的腺苷含有荧光标记。将变性的多聚腺苷化模板片段连接至流动池 表面上的多聚（dT)寡核苷酸。用CCD照相机记录所捕获模板分子的最初物理位置，然后切 割标记并洗去。测序通过添加聚合酶和系列添加荧光标记的dNTP试剂完成。掺入事件导 致与dNTP对应的荧光剂信号，并且在每轮dNTP添加前用CCD照相机捕获信号。序列阅读 长度范围为25-50个核苷酸，每次分析运行的总体输出超过10亿核苷酸对。
[0080] 离子激流技术（Ion Torrent technology)为基于对DNA聚合期间所释放氢 离子的检测的DNA测序方法（参见，例如，327(5970): 1190 (2010);美国专 利申请公布号 20090026082、20090127589、20100301398、20100197507、20100188073 和 20100137143,通过引用以其整体结合用于所有目的）。微孔包含待测序的模板DNA链。微 孔层之下为高灵敏度的ISFET离子传感器。所有层均被包含在CMOS半导体芯片内，与电子 工业中所使用的类似。当将dNTP掺入到生长的互补链中时释放氢离子，这触发高灵敏度的 离子传感器。若模板序列中存在均聚物重复，单个循环中将掺入多个dNTP分子。这导致相 应数目的氢释放以及按比例增高的电子信号。该技术与其它测序技术的不同之处在于不 使用修饰的核苷酸或光学。对于50个碱基阅读，离子激流测序仪的每个碱基的准确度为 ~99. 6%，每次运行产生~100 Mb。阅读长度为100个碱基对。长度为5个重复的均聚物重 复的准确度为~98%。离子激流测序的