导致断裂。每个短线代表关于靶序列的一个独特扩增子。底部的线代表靶 向靶核酸不同区域的扩增子。
[0033] 在一些实施方案中，用可检测的标记（例如，荧光标记探针或引物）检测各个扩增 子。在一些实施方案中，用于检测各个独特扩增子的标记为相同的。例如，在一些实施方案 中，使用具有荧光或其它标记的探针分析PCR过程（例如，实时PCR)。在图1中，示出了 10 个独特的扩增子，尽管本公开内容并不限于检测10个扩增子。
[0034] 在一些实施方案中，所有的反应在单个管或反应容器或体积（例如，孔、通道等） 中进行。在一些实施方案中，为给定启动子所选择的扩增子为连续的、重叠的或重叠与连续 的组合。在一些实施方案中，所述测定为自动化的（例如，使用机器人技术）。
[0035] 本公开内容不限于特定的甲基化检测或扩增方法。下文描述了示例性的甲基 化-特异性检测方法、扩增方法和检测方法。本文所述系统和方法中可利用额外的方法。
[0036] I.甲基化检测技术 在一些实施方案中，本公开内容提供用于检测甲基化DNA的系统和方法（例如，多重检 测）。示例性的甲基化-特异性检测和扩增方法在以下描述。
[0037] A.甲基化-特异性检测 在一些实施方案中，甲基化分析利用亚硫酸氢盐转化或甲基化敏感性限制酶（MSRE)。 亚硫酸氢盐转化方法利用测序、引物-探针、引物-凝胶或引物-阵列分析。
[0038] 用于分析DNA的5-甲基胞嘧啶的一个方法基于亚硫酸氢盐与胞嘧啶的特异反应， 其在随后的碱水解时转化为在其碱基配对行为中与胸腺嘧啶对应的尿嘧啶。5-甲基胞嘧啶 在这些条件下保持未被修饰。因此，原始DNA以这样的方式转化使得原本在其杂交行为中 不能与胞嘧啶区分的甲基胞嘧啶现在可被检测，例如，通过扩增和杂交或测序。这些技术基 于目前已充分利用的碱基配对。
[0039] 检测5-甲基胞嘧啶的方法的综述可从下列概论文章中获悉：Rein，T.， DePamphilisj M. L. , Zorbasj Η. , Nucleic Acids Res. 1998, 26, 2255. 亚硫酸氢盐技术涉及已知基因的短特异性片段，该片段在亚硫酸氢盐处理之后扩增并 经完全测序（Olek, A.和 Walter, J·，NatGenet. 1997，17，275-276)或通过引物延 伸反应（Gonzalgo, M. L.，和 Jones, P. A.，Nucl. Acids Res. 1997，25，2529-2531， TO 9500669)或通过酶消化（Xiong, Ζ·和 Laird, P. W.，Nucl. Acids. Res. 1997，25， 2532-2534)检测单个胞嘧啶的位置。此外，通过杂交检测也已经有描述（Olek等，WO 99 28498)。
[0040] 论述使用亚硫酸氢盐技术用于在个体基因中进行甲基化检测的其它出版物为： Xiong, Z.和 Laird, P. W. (1997)，Nucl. Acids Res. 25，2532; Gonzalgo, M. L.和 Jones, Ρ· A. (1997)，Nucl. Acids Res. 25，2529; Grigg，S.和 Clark, S. (1994)， Bioassays 16, 431; Zeschnik, M.等(1997), Human Molecular Genetics 6, 387; Teil, R.等（1994), Nucl. Acids Res. 22，695; Martin, V.等（1995)，Gene 157， 261; WO 97 46705; WO 95 15373和WO 45560,通过引用以其整体结合到本文中。使用亚 硫酸氢盐技术检测DNA样品中的胞嘧啶甲基化在7, 524, 629中描述，其通过引用以其整体 结合到本文中。
[0041] 额外的用于检测甲基化状态的方法在以下文献中描述，例如，Lombaerts，M.等 (2006) British Journal of Cancer. 94:661-671; Yoshiura， K.等（1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92:7416-7419; Lind, G. E.等（2004) Molecular Cancer 3:28; Kumagai, T.等（2007) Int. J. Cancer. 121:656-665; Hennig, G.等（1996)丄 Biol. Chem. 271(1):595-602; Marchevsky， A. M.等（2004). Journal of Molecular Diagnostics 6:28-36; Reinhold， W. C.等（2007). Mol. Cancer. Ther. 6:391-403; Hu, X-C.等（2002) Life Sciences 71:1397-1404;或 Nakata, S.等（2006) Cancer 106(10) :2190-2199,其各自通过引用以其整体结合到本文中。市售试剂盒也可用于测定肿 瘤细胞中的启动子甲基化状态（例如，Panomics, RedwoodCity, Calif的启动子甲基化 PCR试剂盒）。
[0042] 本领域已知多种甲基化测定程序并且根据本技术可与亚硫酸氢盐处理联合使用。 这些测定允许测定核酸序列内一个或多个CpG二核苷酸（例如，CpG岛）的甲基化状态。在 其它技术中，这样的测定涉及亚硫酸氢盐-处理的核酸的测序、PCR (用于序列-特异性扩 增）、DNA印迹分析和甲基化-敏感性限制酶的使用。
[0043] "HeavyMethyl ?"测定技术为用于基于亚硫酸氢盐-处理的DNA的甲基化-特异 性扩增而评估甲基化差异的定量方法。覆盖扩增引物之间的CpG位置的甲基化-特异性阻 断探针（阻断剂）或被扩增引物覆盖的甲基化-特异性阻断探针（阻断剂），使得能够进行 核酸样品的甲基化-特异性选择性扩增。
[0044] 术语 "HeavyMethyl ? MethyLight ?" 测定是指 MethyLight ? 测定的变型的 HeavyMethyl ? MethyLight ?测定，其中将MethyLight ?测定与覆盖扩增引物之间的CpG位 置的甲基化特异性阻断探针组合。HeavyMethyl ?测定还可与甲基化特异性扩增引物组合使 用。
[0045] 用于HeavyMethyl ?分析的典型试剂（例如，如可存在于典型的基于MethyLight ? 的试剂盒中）可包括，但不限于：特定位点（例如，特异性基因、标志、DMR、基因区、标志区、 亚硫酸氢盐处理的DNA序列、CpG岛或亚硫酸氢盐处理的DNA序列或CpG岛等）的PCR引 物、阻断寡核苷酸、优化的PCR缓冲液和脱氧核苷酸以及Taq聚合酶。
[0046] 术语 "MSP"（甲基化-特异性 PCR)是指 Herman 等（1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9821 - 9826和美国专利号5, 786, 146所描述的本领域所公认的甲基化测 定。
[0047] MSP (甲基化-特异性PCR)允许评估CpG岛内几乎任何CpG位点群的甲基化状 态，而不依赖于甲基化-敏感性限制酶的使用（Herman等Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826，1996;美国专利号5, 786, 146)。简言之，DNA通过亚硫酸氢钠修饰，这将未 甲基化的，而非甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，产物随后用相比未甲基化DNA针对甲基化 DNA特异的引物扩增。MSP仅需要少量DNA，对给定CpG岛位点的0. 1%甲基化等位基因敏 感，并且可在从石蜡包埋样品提取的DNA上进行。用于MSP分析的典型试剂（例如，如可存 在于典型的基于MSP的试剂盒中的）可包括，但不限于：特异性位点（例如，特异性基因、标 志、DMR、基因区、标志区、亚硫酸氢盐处理的DNA序列、CpG岛等）的甲基化和未甲基化PCR 引物、优化的PCR缓冲液和脱氧核苷酸以及特异性探针。
[0048] MethyLight ?测定为利用基于荧光的实时PCR (例如，TaqMan?)的高通量定量甲 基化测定（Eads等，CancerRes. 59:2302-2306，1999)，所述实时PCR步骤后无需进一步 处理。简言之，MethyLight ?过程开始于基因组DNA的混合样品，所述样品根据标准程序在 亚硫酸氢钠反应中转化为甲基化-依赖性序列差异的混合池（亚硫酸氢盐过程将未甲基化 的胞嘧啶残基转化为尿嘧啶）。然后在"偏倚（biased) "反应中例如，用与已知CpG二核苷 酸重叠的PCR引物进行基于荧光的PCR。序列区分在扩增过程水平和荧光检测过程水平二 者进行。
[0049] MethyLight ?测定被用作核酸，例如基因组DNA样品中甲基化模式的定量检验，其 中序列区分在探针杂交水平进行。在一种定量形式中，PCR反应在存在与特定的推定甲基 化位点重叠的荧光探针时提供甲基化特异性扩增。通过其中既无引物也无探针覆盖在任何 CpG二核苷酸上的反应提供输入DNA量的无偏（unbiased)对照。或者，通过用不覆盖已知 甲基化位点的对照寡核苷酸（例如，基于焚光形式的HeavyMethyl ?和MSP技术）或用覆盖 潜在甲基化位点的寡核苷酸探测偏倚的PCR池，实现基因组甲基化的定量试验。
[0050] MethyLight ?方法与任何合适的探针（例如，"TaqMan?"探针、Lightcycler?探 针，等）一起使用。例如，在一些应用中用亚硫酸氢钠处理双链基因组DNA并使其经受使用 TaqMan?探针的两组PCR反应之一，例如，用MSP引物和/或HeavyMethyl阻断剂寡核苷酸 以及TaqMan?探针。TaqMan?探针用荧光"报告"和"猝灭剂"分子双重标记并设计为对相对 高GC含量的区域具有特异性以便其在PCR循环中在约比正向或反向引物高KTC的温度时 熔解。这允许TaqMan?探针在PCR退火/延伸步骤保持完全杂交。由于Taq聚合酶在PCR 期间酶促合成新链，其将最终到达退火的TaqMan?探针。然后Taq聚合酶的5'到3'外切 核酸酶活性将通过消化TaqMan?探针将其置换以释放荧光报告分子用于使用实时荧光检 测系统定量检测其此刻未猝灭的信号。
[0051] 用于MethyLight?分析的典型试剂（例如，如可能存在于典型的基于MethyLight? 的试剂盒中的）可包括，但不限于：特异性位点（例如，特异性基因、标志、DMR、基因区、标志 区、亚硫酸氢盐处理的DNA序列、CpG岛等）的PCR引物、TaqMan?或Lightcycler?探针、优 化的PCR缓冲液和脱氧核苷酸以及Taq聚合酶。
[0052] Β·扩增 在一些实施方案中，甲基化特异性检测之后或与其同时地，扩增核酸。核酸扩增技术的 说明性非-限制实例包括，但不限于，聚合酶链反应（PCR)、反转录聚合酶链反应（RT-PCR)、 转录-介导的扩增（TM)、连接酶链反应（LCR)、链置换扩增（SDA)和基于核酸序列的扩增 (NASBA)。本领域普通技术人员将认识到某些扩增技术（例如，PCR)需要在扩增前将RNA反 转录为DNA (例如，RT-PCR)，而其它扩增技术直接扩增RNA (例如，TMA和NASBA)。
[0053] 聚合酶链反应（美国专利号 4, 683, 195、4, 683, 202、4, 800, 159 和 4, 965, 188,其 各自通过引用以其整体结合到本文中），通常称为PCR，使用多个变性、引物对与相反链的 退火和引物延伸的循环，从而以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数。在称为RT-PCR的变型 中，使用反转录酶（RT)从mRNA制备互补DNA (cDNA)，然后通过PCR扩增cDNA以产生DNA 的多个拷贝。对于PCR的其它不同变换，参见，例如，美国专利号4, 683, 195、4, 683, 202和 4,800,159; Mullis等，ifeiA 办幻鹽155: 335 (1987);和Murakawa等，ZW4 7: 287 (1988)