专利名称：鉴别小麦红粒和白粒的分子标记技术的制作方法
技术领域：
本发明是一种利用SSR分子标记，区分小麦红粒和白粒的技术，属于农业生物技 术工程领域。
背景技术：
小麦籽粒颜色是影响面粉质量和产量的重要性状，在磨粉过程中，红粒小麦影响 面粉的亮度(Flintham，2000 ;Warner et al. ， 2000 ;Himi et al. ， 2002)，世界上各个国家 的农民都喜欢种植白粒小麦品种。小麦籽粒颜色分别被小麦3A、3B、3D染色体长臂的红粒 基因(R-A1、R-B1、R-D1)控制，红粒基因都是显性遗传，具有加性效应，3个隐性位点纯和才 能表现白粒，且粒色的表现受环境影响，这就使用肉眼选择白粒具有一定难度，而且白粒选 择只能在种子收获后进行，周期长。 人工合成小麦由四倍体小麦和二倍体节节麦人工合成，蕴藏着丰富的优良基因， 也携带一些不利基因，红粒性状就是限制育种家利用人工合成小麦的重要因素。人工合 成小麦衍生品种川麦42高产、稳产、抗条锈，已经成为小麦高产、抗条锈育种的重要基因 源。然而，由于红粒性状的影响，限制了川麦42的使用。因此，利用容易选择的、快速有效 的方法，使川麦42由红粒到白粒的转变是非常有意义的。分子标记辅助选择白粒基因，可 以在苗期的时候进行选择，且不受环境影响，更快速、更容易、更准确。到目前为止，R-A1、 R-B1、 R-D1基因已经利用普通小麦通过RFLP、 STS、 EST和SSR分子标记作图(Flintham andH卿hrey， 1993 ;Gale et al. ， 1995 ;Nalam et al. ， 2006 ;Kuraparthy et al. ，2008， Sherman et al. ，2008)。
发明内容
针对白粒小麦品种使用肉眼选择难度大，且只能在种子收获后进行，周期长的问 题，本发明的目的在于提供一种鉴别小麦红粒和白粒的分子标记技术，利用SSR分子标记， 对人工合成小麦衍生品种川麦42携带的红粒基因进行作图，以期为用人工合成小麦和川 麦42作为基因资源的白粒小麦品种的选育提供快速、有效的分子标记。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案 本发明利用人工合成小麦衍生品种红粒小麦川麦42和四川栽培白粒小麦川W565 杂交，构建&群体用于红粒基因的遗传分析。川麦42、川W565、巳、&单株种植在成都试验 田。1015个&植株被收获用于鉴定籽粒颜色和川麦42红粒基因的遗传分析，其中，&群体 中241个白粒单株被选出，构建F2—3家系，用于验证&的结果。 (l)DNA提取和SSR标记苗期取双亲、F2和F2-3幼嫩叶片，利用CTAB法提取DNA ; 选用小麦3D长臂上SSR引物筛选双亲川麦42和川W565的遗传差异；
PCR反应条件、扩增体系如下15ul体系 1XPCR缓冲液，模板1.5ul，镁离子浓度1.5mM， dNTP浓度0. 2mM，引物浓度为 0. 2uM， rTaq酶1U，加无菌去离子水或ddH20水至15ul。
PCR程序为
1)94"预变性5min 2)降落PCR程序共11个循环每一循环降低1°C 94。C，45秒 65。C，45秒 72。C，45秒 3)常规PCR程序30个循环 94。C，45秒 55。C，45秒 72。C，45秒 4)最后一部扩增72°C ， 10min 电泳检测聚丙烯酰胺凝胶浓度为6%，其中，丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺=39 : l，每个点样孔内扩增产物的上样量为5-8ul。 220V恒压条件下预电泳20min后400V恒压条件下电泳lh后O. 1%硝酸银染色10分钟，2%的化011和1.5%甲醛显影至条带出现，最后照相保存； (2)性状鉴定小麦完全成熟时，收获Fl种子、F2单株和F2-3家系，每一株系取
30-40粒种子放在5% NaOH溶液里浸泡过夜，肉眼鉴定籽粒颜色，种子为黑红色的是红粒，
为稻草黄色的是白粒； (3)遗传距离计算和连锁图构建 利用双亲具有多态性的引物扫描F2群体中白粒单株，结合鉴定籽粒颜色的结果，通过卡方检验估算&群体观察值和预期值间分离比的适合度。遗传距离的估算用M即maker3. 0计算标记与抗病基因之间的遗传距离(Lincoln etal， 1992)，用Kosambi功能计算图距(Kosambi， 1944) ， LOD值为3. O，用M即draw绘制遗传图谱(Liu， Meng，2003)。
(4)结果 1)根据籽粒颜色鉴定，川麦42红粒基因R-D1是显性遗传的，1015个F2植株中有774株红粒、241株白粒，分离比为3 : 1，表明川麦42携带的红粒基因受单基因控制；
2)8个3D染色体长臂上的SSR引物被用于扫描F2群体中241个隐性单株，根据241个隐性单株SSR基因型和籽粒颜色的表型，构建连锁图，5个SSR引物和红粒基因R-D1紧密连锁，R-D1基因位于Xgwm3和Xgwm314两个SSR标记之间，遗传距离分别是2. 1、2. 5CM。
本发明使用的聚合酶链式扩增反应体系为常规PCR体系，电泳和染色都用普通仪器和试剂，不需要任何特殊的仪器和特殊的试剂，任何公司的生产的PCR反应仪、电泳槽和电泳仪，任何生物试剂公司生产的试剂均可使用而达到本发明的目的。
本发明筛选出两个SSR引物Xgwm3和Xgwm314，位于红粒基因R-D1的两侧，遗传距离分别是2. 1、2.5CM。本发明试验过程中不需要任何特殊的仪器和试剂，试验方便、价格便宜。用这两个引物辅助选择红粒基因，从而更快速、准确、有效的选择白粒品种、淘汰红粒品种，加快了白粒小麦育种进程。
图1是本发明技术路线图
图2是SSR引物Xgwm3，Xgwm314，Xwmc552，Xbarc270检测川麦42、川W565和川麦42亲本即人工合成小麦Syn769多态性差异的电泳图。 图2中1为川麦42亲本即人工合成小麦Syn769，2为川麦42，3为川W565。 图3是SSR引物Xgwm3扫描川麦42/川W565 F2群体的电泳图。 图4是SSR引物Xgwm314扫描川麦42/川W565F2群体的电泳图。 图5是川麦42红粒基因R-D1的连锁图。图的右边是引物名称，图的左边是遗传
足巨离(Kosambi， CM)。
具体实施例方式( — )试验材料 人工合成小麦衍生品种红粒小麦川麦42和四川栽培白粒小麦川W565，及其川麦
42/川W565F2群体(1015个)和F2-3家系。川麦42、川W565、 Fl、 F2群体和F2-3家系种
植于成都试验田。
( 二 )性状鉴定 小麦完全成熟时，收获Fl种子、F2单株和F2-3家系，每一株系取30_40粒种子放在5% NaOH溶液里浸泡过夜，肉眼鉴定籽粒颜色，种子为黑红色的是红粒，为稻草黄色的是白粒。 (三)DNA提取和SSR标记 苗期取双亲、F2和F2-3幼嫩叶片，利用CTAB法提取DNA。选用小麦3D染色体长臂上SSR引物筛选双亲川麦42和川W565的遗传差异。
PCR反应条件、扩增体系如下(15ul体系) 1XPCR缓冲液，模板1.5ul，镁离子浓度1.5mM， dNTP浓度0. 2mM，引物浓度为0. 2uM， rTaq酶1U，加无菌去离子水或ddH20水至15ul。
PCR程序为
1)94。C预变性5min 2)降落PCR程序共11个循环每一循环降低1°C 94。C，45秒 65。C，45秒 72。C，45秒 3)常规PCR程序30个循环 94。C，45秒 55。C，45秒 72。C，45秒 4)最后一步扩增72。C，10min 电泳检测聚丙烯酰胺凝胶浓度为6% (丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺=39 : 1)，每个点样孔内扩增产物的上样量为5-8ul。 220V恒压条件下预电泳20min后400V恒压条件下电泳lh后O. 1%硝酸银染色10分钟，2X的NaOH和1. 5%甲醛显影至条带出现，最后照相保存。(四)遗传距离计算和连锁图构建
利用双亲具有多态性的引物扫描F2群体中白粒单株，结合鉴定籽粒颜色的结果，通过卡方检验估算F2群体观察值和预期值间分离比的适合度。用M即maker3. 0计算标记与抗病基因之间的遗传距离(Lincoln et al， 1992)，用Kosambi功能计算图距(Kosambi，1944) ， L0D值为3. O，用M即draw绘制遗传图谱(Liu， Meng，2003)。
(五)结果 1、根据籽粒颜色鉴定，川麦42红粒基因R-D1是显性遗传的，1015个F2植株中有774株红粒、241株白粒，分离比为3 : 1，表明川麦42携带的红粒基因受单基因控制。
2、8个3D长臂上的SSR引物被用于扫描F2群体中241个隐性单株(白粒)，根据241个隐性单株SSR基因型(如表1)和籽粒颜色的表型，构建连锁图。5个SSR引物和红粒基因R-D1紧密连锁，R-D1基因位于Xgwm3和Xgwm314两个SSR标记之间，遗传距离分别是2. 1、2. 5CM(如图5所示)。 表1.用5个SSR标记对F2群体的241个隐性单株的红粒基因R-D1连锁分析结果
SSR makerNo. of plantsABHC
Xgwm3-3D241123280
Xgwm314-3D241323260
Xwmc552匿3D2418216170
Xgwm664-3D2419201301
Xbarc270-3D2415226100 注A.川麦42纯和基因型；B.川W565纯和基因型；H.杂合类型；C.变异类型。
3、川麦42红粒基因来源于人工合成小麦二倍体亲本节节麦。
权利要求
一种鉴别川麦42红粒和白粒的分子标记技术，利用人工合成小麦衍生品种红粒小麦川麦42和四川栽培白粒小麦川W565杂交，构建F2群体用于红粒基因的遗传分析，1015个F2植株被收获用于鉴定籽粒颜色和川麦42红粒基因的遗传分析与分子标记，其中，F2群体中241个白粒单株被选出，构建F2-3家系，用于验证F2的结果；其特征在于该分子标记技术具体步骤如下(1)DNA提取和SSR标记苗期取双亲、F2和F2-3幼嫩叶片，利用CTAB法提取DNA；选用小麦3D染色体长臂上SSR引物筛选双亲川麦42和川W565的遗传差异；PCR反应条件、扩增体系如下15ul体系1×PCR缓冲液，模板1.5ul，镁离子浓度1.5mM，dNTP浓度0.2mM，引物浓度为0.2uM，rTaq酶1U，加无菌去离子水或ddH2O水至15ul；PCR程序为1)94℃预变性5min2)降落PCR程序共11个循环每一循环降低1℃94℃，45秒65℃，45秒72℃，45秒3)常规PCR程序30个循环94℃，45秒55℃，45秒72℃，45秒4)最后一步扩增72℃，10min电泳检测聚丙烯酰胺凝胶浓度为6％，其中，丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺＝39∶1，每个点样孔内扩增产物的上样量为5-8ul，220V恒压条件下预电泳20min后400V恒压条件下电泳1h后0.1％硝酸银染色10分钟，2％的NaOH和1.5％甲醛显影至条带出现，最后照相保存；(2)性状鉴定小麦完全成熟时，收获F1种子、F2单株和F2-3家系种子，每一株系取30-40粒种子放在5％NaOH溶液里浸泡过夜，肉眼鉴定籽粒颜色，种子为黑红色的是红粒，为稻草黄色的是白粒；(3)遗传距离计算和连锁图构建利用双亲具有多态性的引物扫描F2群体中白粒单株，结合鉴定籽粒颜色的结果，通过卡方检验估算F2群体观察值和预期值间分离比的适合度，用Mapmaker3.0计算标记与抗病基因之间的遗传距离，用Kosambi功能计算图距，LOD值为3.0，用Mapdraw绘制遗传图谱；(4)结果1)根据籽粒颜色鉴定，川麦42红粒基因R-D1是显性遗传的，1015个F2植株中有774株红粒、241株白粒，分离比为3∶1，表明川麦42携带的红粒基因受单基因控制；2)8个3D染色体长臂上的SSR引物被用于扫描F2群体中241个隐性单株，根据241个隐性单株SSR基因型和籽粒颜色的表型，构建连锁图，5个SSR引物和红粒基因R-D1紧密连锁，R-D1基因位于Xgwm3和Xgwm314两个SSR标记之间，遗传距离分别是2.1、2.5CM。
全文摘要
本发明公开了一种鉴别小麦红粒和白粒的分子标记技术，利用人工合成小麦衍生品种红粒小麦川麦42和四川栽培白粒小麦川W565杂交，构建F2群体用于红粒基因的遗传分析，1015个F2植株被收获用于鉴定籽粒颜色和川麦42红粒基因的遗传分析与分子标记，其中，F2群体中241个白粒单株被选出，构建F2-3家系，用于验证F2的结果；本发明利用SSR分子标记，对人工合成小麦衍生品种川麦42携带的红粒基因进行作图，从而更快速、准确、有效的选择白粒品种、淘汰红粒品种，加快了白粒小麦育种进程。
文档编号C12Q1/68GK101760556SQ20101010786
公开日2010年6月30日 申请日期2010年2月10日 优先权日2010年2月10日
发明者李俊, 杨武云, 胡晓蓉 申请人:四川省农业科学院作物研究所