NFYB基因作为急性心肌梗死风险预测标记物中的用途的制作方法

技术领域：

本发明提供一种预测和诊疗急性心肌梗死的标记物，进一步讲是提供了nfyb基因作为标记物表达产物和生物制剂在制备急性心肌梗死预测和诊疗药物中用途，属于基因诊断和生物医药领域。

背景技术：
：

冠状动脉粥样硬化性心脏病（cad）是由环境因素与遗传因素共同作用而导致的最常见心血管疾病，是一种多基因相互作用的复杂疾病，其发生与发展是在环境因素和遗传因素共同作用的基础之上，多重危险因素作用的结果。已知的危险因素，如高血压、血脂异常、血糖升高、吸烟等长期积累，结合遗传背景最终将导致急性心血管事件（如，急性心肌梗死，ami）的发生，常常危及患者生命。因此，临床上需要有效的风险预测方法，对高危人群给予有效识别，从而更早的干预，来降低急性心血管事件的发生，改善病人预后。

基因组中编码的遗传信息是稳定的，大多数情况下是不可变的。然而研究表明，大约有25000个基因在rna水平的表达是高度可变的，可以反应机体短期内的生理和病例变化。近年来随着基因芯片技术的发展，基因表达分析已经广泛应用于疾病的研究。在其他医学领域的研究已经表明，外周全血或外周血单核细胞的基因表达对疾病具有显著的预测价值，外周全血或外周单个核细胞基因表达的改变已被证实对cad有显著的预测价值。基因表达分析可以为疾病近期风险预测提供新的生物标志物。

由nfyb基因编码的nfyb亚基是nfy的重要组成部分，在nfy的调控中起到必不可少的作用。既往研究表明，由nfy调控表达的基因广泛参与了甘油三酯、脂肪酸、酮体代谢和胆固醇合成等重要的脂类代谢相关通路，在现有研究中未见对nfyb与心肌梗死的相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供nfyb基因作为急性心肌梗死风险预测标记物中的用途，所述急性心肌梗死风险预测和诊断制剂检测nfyb基因和或基因的表达产物。进一步的，所述的nfyb基因和或基因的表达产物在急性心肌梗死外周血中低表达。进一步的，所述的nfyb基因和或基因的表达产物的表达水平荧光定量检测方法。

本发明的目的在于所述急性心肌梗死风险预测和诊断制剂检测nfyb基因和或基因的表达产物进一步的，采用荧光定量试剂盒、基因芯片、酶联免疫、抗体杂交方法外周血中基因的表达检测方法和相关的生物制剂。

本发明的目的在于所述急性心肌梗死风险预测和诊断制剂检测nfyb基因和或基因的表达产物进一步的，包含本nfyb基因和或表达产物用于急性心肌梗死风险预测和诊断的生物制剂。

本发明中荧光定量pcr检测中使用的引物对p，其序列如下：

上游引物序列：5’atgacaatggatggtgacagttc3’

下游引物序列：5’ctagccacgtttgctattgga3’。

本发明中荧光定量pcr检测体系及反应条件：

荧光定量pcr反应体系：20ul反应体系，每个反应包括:10ulsybrpremixextaqtm，上、下游引物各0.5ul(浓度为10umol/l)，无核酸酶的双蒸水8ul，cdna模板1ul。权利要求3中所述的荧光定量pcr反应条件：应用实时荧光定量pcr系统扩增。反应条件为95℃预变性10分钟；40个循环：95℃变性15秒,60℃退火20秒,72℃20延伸秒；溶解曲线和扩增曲线95℃1分钟，55℃30秒,95℃30秒。以gapdh基因为内参基因，所有样本至少重复测量三次，结果取均值。

本发明进行的外周血急性心肌梗死差异基因表达谱分析结果显示：在急性心肌梗死病人的外周血白细胞中存在着大量差异表达的基因。其中，nfyb基因在急性心肌梗死病人外周血中呈现显著低表达。发明人在前期研究成果的基础之上，通过扩大样本量，来进一步验证nfyb基因在急性心肌梗死发病过程中的差异表达，并分析nfyb基因促进急性心肌梗死发病的可能机制。

本发明的积极效果在于：

提供了以nfyb基因和或基因的表达产物一种新的急性心肌梗死风险预测和诊断治疗靶点，利用nfyb基因及其表达产物制备急性心肌梗死风险预测标记物和诊断制剂，具有重要的临床应用意义和开发价值。

附图说明

图1是nfyb基因荧光定量pcr的特异性引物的溶解曲线和nfyb基因荧光定量pcr扩增曲线；a是荧光定量特异性引物的溶解曲线，b是荧光定量pcr扩增曲线；

图2实施例2中nfyb基因rt-pcr扩增目的片段电泳图，其中，泳道1，2是rt-pcr产物，泳道3是dl500dnaladdermarker；

图3是nfyb基因mrna相对表达量；其中^**代表p<0.01。

具体实施方式

结合实例具体实例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解，在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型。

本发明主要采用荧光定量pcr筛选出急性心肌梗死相关基因，结合分子生物学实验和临床病例关联分析，证实了是急性心肌梗死诊治标志物。

病例的收集

选取2014年11月-2016年7月于吉林大学中日联谊医院心血管内科住院治疗，根据世界卫生组织发布的缺血性心脏病命名和诊断标准，明确诊断为冠心病的病人85例为冠心病组。并同时符合：冠状动脉造影术证实冠状动脉主要血管（左主干、前降支、回旋支和右冠状动脉）及其主要分支中至少一支狭窄大于或等于50%。根据冠状动脉造影结果，按照gensini评分系统对冠状动脉血管病变严重程度进行评分，分值越高病变约严重。对照为经冠状动脉造影术证实冠状动脉主要血管（左主干、前降支、回旋支和右冠状动脉）及其主要分支均无明显狭窄的非冠心病者84例（非冠心病组）。

本发明医疗效果的排除标准：

1.非心肌缺血相关的心肌损伤：心脏挫伤、手术、消融、起搏、或除颤仪除颤、伴心脏受累的横纹肌溶解症、心肌炎、心脏毒性药物等。

2.多因素或不确定的心肌损伤：严重心力衰竭、应激性心肌病、严重肺栓塞或肺动脉高压、败血症和危重病人、肾功能衰竭、严重的急性神经系统疾病，如卒中、蛛网膜下腔出血、浸润疾病，如淀粉样变、结节病、剧烈运动等。

3.合并有严重感染性疾病、恶性肿瘤。

4.正在患有的、慢性的或复发性的传染性疾病史。

5.（活动性或潜伏性）结核感染史或证据。

6.患有免疫系统疾病和（或）正在服用激素。怀疑或证实处于免疫缺陷状态的患者

7.临床资料或者冠脉造影资料不全者。

详细记录临床资料，包括：用药史、血脂水平、空腹血糖水平、坐位血压水平、体质指数（bmi）、冠状动脉造影资料、冠心病家族史、吸烟史，以及合并其它临床疾病情况（如高血压、糖尿病）等。

二、急性心肌梗死患者组及对照组外周血中nfyb基因表达情况：

外周血采集、总rna提取及cdna合成

留取各研究对象晨起空腹外周静脉血4ml，利用血液总rna提取试剂盒（rnasimpletotalrnakit，天根生化科技有限公司，北京），依据试剂盒说明书对已获取的外周血进行总rna提取，并利用1.5%琼脂糖电泳及紫外分光光度计（nanodrop2000）对rna的质量及浓度进行检测。合格的rna样本a260/a280值在1.9和2.1之间，且a260/a230值大于2。琼脂糖凝胶电泳可见明亮的28s和18srrna条带，且28srrna条带亮度约为18srrna的两倍。采用反转录试剂盒（toyoborevertraaceqprcrtkit，上海），取总量为1ug合格的总rna进行反转录，得到cdna样品保存于-20℃以便下一步进行实时荧光定量pcr。

实时荧光定量pcr检测

利用sybr荧光定量试剂盒(sybrpremixextaqtm，takara,大连)进行pcr扩增。采用20ul反应体系，每个反应包括:10ulsybrpremixextaqtm，上、下游引物各0.5ul(浓度为10umol/l)，无核酸酶的双蒸水8ul，cdna模板1ul。应用mx3005p实时荧光定量pcr系统（stratagene）扩增。反应条件为95℃10分钟；40个循环：95℃15秒,60℃20秒,72℃20秒；95℃1分钟，55℃30秒,95℃30秒。以gapdh基因为内参基因，所有样本至少重复测量三次，结果取均值。每个样本所得循环阈值（ct）以相对表达量2-△ct表示（△ct=目的基因ct-内参基因ct），并进行比较。急性心肌梗死组对于对照组的相对表达量以2-^△△ct法进行统计分析，△△ct=急性心肌梗死组△ct-对照组△ct。所用pcr引物根据ncbi数据库提供的nfyb基因序列进行设计，并由上海生工生物技术有限公司合成，引物序列见表1，扩增片段长度为153bp。收集实时荧光定量pcr产物，用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。rt-pcr引物序列如下：

nfyb

上游引物5’-atgacaatggatggtgacagttc-3’

下游引物5’-ctagccacgtttgctattgga-3’

gapdh

上游引物5’-acggatttggtcgtattgggcg-3’

下游引物5’-ctcctggaagatggtgatgg-3’

三、nfyb基因相对表达量与急性心肌梗死患者血脂，血糖等性状的相关性分析

统计学分析

数据使用spss22.0软件进行统计学分析，计量资料服从正态分布的采用±s进行统计描述，组间差异比较采用独立t检验分析，不服从正态分布的采用四分位数间距进行统计描述，组间差异比较采用秩和检验；计数资料采用频数进行统计描述，组间差异采用检验分析；冠心病相关危险因素采用二元logistic回归分析；nfyb基因相对表达量与冠状动脉狭窄病变严重程度相关性采用双变量相关分析。结果以双侧p<0.05认为有统计学差异。

伦理声明

本研究涉及医学伦理学范畴的内容由吉林大学中日联谊医院伦理委员会批准。所有受试者的样本及信息采集均通过受试者同意，并签署知情同意书。

实验结果

1临床资料分析

研究对象的临床资料分析结果表明：在年龄、性别、bmi、高血压病史、冠心病家族史、吸烟史、收缩压、舒张压等方面，两组未见明显统计学差异。而两组在血糖和血脂等指标上差别显著。与非冠心病组相比冠心病组合并糖尿病情况及空腹血糖（fbg）水平明显高于非冠心病组；血总胆固醇水平（tc）、甘油三酯水平（tg）和低密度脂蛋白胆固醇水平（ldl-c）明显高于非冠心病组；相反，高密度脂蛋白胆固醇水平（hdl-c）明显低于非冠心病组，差别均有统计学意义。详见表1。

2外周血实时荧光定量pcr扩增产物鉴定

实时荧光定量pcr检测结果显示，nfyb基因扩增曲线为显著平滑的“s型”，溶解曲线呈现单一的溶解峰，表明扩增产物特异性较高，结果如图1。收集扩增产物，取8ul用于1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。结果如图2。电泳结果显示，pcr扩增产物呈现单一明亮条带，片段大小约197bp，与预期片段大小相一致。说明pcr扩增反应成功，产物特异性较好。

3nfyb基因mrna在冠心病组和非冠心病组的表达量

rt-pcr所得每个样本的δct值均为单个样品重复3次测量所得均值。nfyb基因的相对表达量统计采用2^-δδct方法。结果显示，冠心病组2^-△ct为0.04（0.03-0.07），非冠心病组2^-△ct为0.05（0.03-0.16），两组差别有显著统计学差异（z=-2.3，p=0.02）。在mrna水平冠心病组外周血中nfyb基因表达明显低于非冠心病组，其相对表达量为非冠心病组的0.40±0.34倍，见图3。

4采用logistic回归分析nfyb基因相对表达量及其它因素与冠心病的关系

为进一步分析nfyb基因表达量降低是否为冠心病的危险因素，采用逐步logistic回归分析nfyb基因的相对表达量、年龄、性别、bmi、冠心病家族史、吸烟史、高血压、糖尿病、空腹血糖及血脂等因素与冠心病的相关性。结果显示nfyb基因的低表达以及血甘油三酯水平升高是冠心病的独立危险因素，详见表2。

5nfyb基因相对表达量与空腹血糖及血脂等指标的关系

将所有纳入的研究对象分别按空腹血糖水平和血脂水平分为：空腹血糖正常组和空腹血糖升高组、tc正常组和tc升高组、tg正常组和tg升高组、ldl-c正常组和ldl-c升高组、hdl-c正常组和hdl-c降低组。分别比较组间nfyb基因的表达量。每个研究对象nfyb基因的相对表达量以2^-△ct表示。结果显示：nfyb基因表达量在血糖正常组与血糖升高组之间、tc正常组和tc升高组之间、ldl-c正常组与ldl-c升高组之间、hdl-c正常组和hdl-c降低组之间差别均无统计学意义；而在tg正常组与tg升高组之间有显著差别。详见表3。

6nfyb基因相对表达量与冠状动脉病变严重程度的相关性

根据冠状动脉造影结果，按照gensini评分系统对冠心病组研究对象的冠状动脉病变严重程度进行评估。冠心病组gensini评分结果为33.50（20.00-60.00），分值越高代表冠状动脉狭窄越重。对nfyb基因相对表达量和gensini分值进行双变量相关分析，结果显示：nfyb基因的相对表达量与gensini分值呈显著负相关（rs=-0.61，p=0.00）。表明外周血中nfyb基因的表达量越低，冠状动脉粥样硬化病变可能越严重。

总结：nfyb基因在冠心病病人外周血中表达显著降低；nfyb基因可能通过调控脂类代谢相关基因的转录进而促进冠心病的发生；nfyb基因表达量降低是冠心病的独立危险因素；外周血中nfyb基因的低表达将可能作为冠心病风险评估的生物标志物，并对冠状动脉病变严重程度的评估具有一定的参考价值。

表1为冠心病组与非冠心病组临床资料比较[(±s)/n(%)]；

表2为冠心病独立危险因素logistic回归分析结果；

表3为不同组别间chd9基因相对表达量比较；

sequencelisting

<110>吉林大学

<120>nfyb基因作为急性心肌梗死风险预测标记物中的用途

<160>5

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>197

<212>mrna

<213>人（homo）

<400>1

atgacaatggatggtgacagttctacaacagatgcttctcaactaggaatctctgcagac60

tatattggaggaagtcattatgttatacagcctcatgatgatactgaggacagcatgaat120

gatcatgaagacacaaatggttcaaaagaaagtttcagagaacaagatatatatcttcca180

atagcaaacgtggctag197

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

atgacaatggatggtgacagttc23

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

ctagccacgtttgctattgga21

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

acggatttggtcgtattgggcg22

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

ctcctggaagatggtgatgg20