一种结核分枝杆菌感染人体后细菌存活率的测定方法与流程

本发明属于结核分枝杆菌感染技术领域，尤其涉及一种结核分枝杆菌感染人体后细菌存活率的测定方法。

背景技术：

结核分枝杆菌(m.tuberculosis)，俗称结核杆菌，是引起结核病的病原菌。可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见。结核病至今仍为重要的传染病。据who报道，每年约有800万新病例发生，至少有300万人死于该病。我国建国前死亡率达200-300人/10万，居各种疾病死亡原因之首，建国后人民生活水平提高，卫生状态改善，特别是开展了群防群治，儿童普遍接种卡介苗，结核病的发病率和死亡率大为降低。但应注意，世界上有些地区因艾滋病、吸毒、免疫抑制剂的应用、酗酒和贫困等原因，发病率又有上升趋势。

临床上诊断结核的主要依据：标本切片、直接涂片镜检、集菌涂片、分离培养、x线检查、聚酶链反应(pcr)扩增技术

直接涂片镜检法操作如下：材料：结核病人痰液、载玻片、酒精灯、接种环；抗酸染色液：石炭酸复红液、3％盐酸酒精溶液、吕氏美蓝溶液。

1、涂片：

(1)取病患清晨痰液；

(2)取干酪样坏死或带血小块，涂成薄膜状；

(3)自然干燥，外焰固定，染色；

2、抗酸染色

(1)初染：夹住涂片一端，持平，滴加石碳酸复红染液，使之完全覆盖标本，(或在已固定的结核分枝杆菌痰标本涂片上放一小块滤纸片，之后滴加数滴石炭酸复红液后，)置酒精灯高处徐徐加热，待染液出现蒸汽时移开，蒸汽减少时再加热，反复操作3-5分钟。

(2)待玻片冷却后，用水缓慢冲洗，用吸水纸吸干。

(3)脱色：滴加3％盐酸酒精，轻晃玻片，直至无红色液体流下为止，一般作用1-3min，水洗，吸干。

(4)复染：用碱性美兰溶液复染1min，用水冲洗后吸干。

3、油镜观察

－：仔细观察至少300视野未发现抗酸菌；

±：300个视野内发现1-2个抗酸菌(全部涂膜镜检3遍)；

+：100个视野内发现1-9个抗酸菌(全部涂膜镜检1遍)；

2+：10个视野内发现1-9个抗酸菌；

3+：每个视野内发现1-9个抗酸菌；

4+：每个视野内发现9个以上的抗酸菌。

集菌涂片法操作如下：i、沉淀集菌法：取痰液2-3ml，40g/lnaoh1-2倍量混匀。经103.43pa高压灭菌20-25min(或煮30min)，3000r/min离心30min，弃上清液，取沉淀物涂片做抗酸染色或金胺“0”荧光染色镜检；

п、漂浮集菌法：取晨痰2-3ml放入100ml三角瓶内，加1-2倍量40g/lnaoh溶液，经103.43pa高压灭菌20-25min(或煮30min)。冷却后滴加汽油0.3ml，瓶口盖玻璃纸加塞，塞紧瓶口，置振荡器或手摇振荡10min，再加蒸馏水至满瓶口而又不外溢，静置10-15min，将已编号的洁净载玻片盖在瓶口上，静置15-20min，取下载玻片并迅速将载玻片翻转至浸膜向上，或用接种环取瓶口液面物涂于载玻片上，自然干燥，火焰固定后做抗酸染色或金胺“0”荧光染色，镜检。

集菌涂片结果：按“发现抗酸染色阳性细菌”或“未发现抗酸染色阳性细菌”报告。

现有方法检测结果误差比较大，结果不准确，容易出现假阴性问题。

申请号为cn201010522800.1的中国专利申请公开了一种结核分枝杆菌复合群的荧光定量rt-pcr检测方法。该申请包括如下步骤：结核分枝杆菌复合群特异性定量rt-pcr引物和探针设计；标准分子的构建；细菌样本rna与dna的共同提取；对同一份样本分别进行rt-pcr和pcr；荧光定量pcr检测方法的建立和优化。如果将该专利应用到测定结核分枝杆菌存活率中，缺点是构建重组质粒过程复杂；该专利检测样品为痰液，但大多数患者痰液中不含有结核杆菌(结核杆菌检出率低)，因此以痰液作为检测样品实际应用意义不大；没有引入内参基因，因此不能很好的剔除人为操作带来的实验误差，其次也无法对结核菌的存活率及感染严重程度提供一个科学的量化指标。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明提供一种结核分枝杆菌感染人体后细菌存活率的测定方法。所述测定方法用于衡量经结核分枝杆菌感染后，细胞/组织中结核分枝杆菌的存活率。

本发明的技术方案如下：一种结核分枝杆菌感染人体后细菌存活率的测定方法，所述测定方法包括以下步骤：

步骤(1)收集结核分支杆菌感染后的细胞/组织，提取细胞/组织内结核分枝杆菌的总dna和总rna；

步骤(2)将提取的总rna进行反转录，得到总cdna；

步骤(3)采用结核分枝杆菌的cdna引物和人的内参基因dna引物分别对同一个体的总cdna、总dna进行real-timeqpcr绝对定量得到结核分枝杆菌cdna拷贝数，人的内参基因的dna拷贝数；

步骤(4)根据结核分枝杆菌cdna拷贝数/人的内参基因的dna拷贝数得到结核分枝杆菌的存活率。

所述人的内参基因为β-actin或gapdh。

所述总cdna采用real-timeqpcr绝对定量时以结核分枝杆菌16srna基因的rt-pcr产物作为标准品；总dna采用real-timeqpcr绝对定量时以人内参基因β-actin的pcr产物作为标准品。

所述结核分枝杆菌感染后的检测样本来源于肺外结核病人病灶组织或血液。

所述real-timeqpcr绝对定量方法如下：

步骤(1)标准品的建立以结核分枝杆菌16srna基因的rt-pcr产物作为标准品，所述标准品碱基数已知，使用微量核酸蛋白测定仪检测标准品的cdna浓度；以人的内参基因β-actin的pcr产物作为标准品，所述标准品碱基数已知，使用微量核酸蛋白测定仪检测标准品的dna浓度；根据以下公式计算出结核分枝杆菌16srna标准品的cdna拷贝数和人内参基因β-actin标准品的dna拷贝数：

拷贝数(copies/μl)＝(浓度/相对分子质量)×6.02×10²³×10^-9；

步骤(2)制作标准曲线对标准品进行10倍系列倍比稀释，至少选择5个稀释度，涵盖待测样本中目的基因可能出现的全部浓度范围；以系列稀释的标准品为模板进行real-timeqpcr，以标准品拷贝数的对数为横坐标，以ct值为纵坐标，绘制标准曲线；

步骤(3)待测样品定量通过待测样品的ct值和标准曲线公式，计算出待测样品中目的基因的拷贝数。

所述结核分枝杆菌16srna基因序列扩增过程中的cdna引物及探针如下：

前引物tctcggattgacggtaggtg；

后引物gcccagtaattccggacaac；

探针cggtaatacgtagggtgcga。

所述内参基因β-actin扩增过程中的dna引物及探针如下：

前引物actaacactggctcgtgtga；

后引物cttgggatggggagtctgtt；

探针catgaggctggtgtaaagcg。

关于结核病，临床上一般通过对痰、支气管灌洗液、尿、粪、脑脊液或胸、腹水标本进行诊断。由于取材比较方便，大部分现有临床检测方法都会选择痰液进行检测。本发明研究前期在检测结核病人的痰液过程中并没发现结核杆菌，检测结果呈现阴性(60份样本中绝大多数检测出来阴性)，但是在病理组织标本中检测出结核杆菌却是阳性，故如果只依靠结核病人的痰液检测结果，很容易在肺外结核病人检测中出现假阴性的问题，另外，现有方法的检测中只能定性分析是否感染结核杆菌，但是不能定量分析结核杆菌的感染程度。

为解决上述问题，本发明在real-timeqpcr绝对定量中加入内参基因，通过测定结核病人病灶组织中的结核杆菌16srna，并与内参基因做比较，定量化结核杆菌的存活率。将结核杆菌16srna进行扩增，如果只比较各样品(模板)间结核杆菌16srna拷贝数的差异，会由于样品本身的质量或者样品间的差异以及操作手法的问题对结果造成一定的误差，若用样品各自的结核菌拷贝数/内参β-actin(来源于结核菌人的)，后进行样品间的比较，得出的结果真实可靠。本发明采用的内参基因β-actin在所有生物的组织器官中均稳定表达，且表达量高，所以常被用于分子生物学实验中的参照基因。因此用结核分枝杆菌16srna拷贝数与内参基因dna拷贝数进行比较，就可以量化经结核菌感染后，细胞/组织中结核分枝杆菌的存活率，并以此作为衡量结核分枝杆菌生存能力的指标、评价感染的严重程度及临床药物治疗效果。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明提供的方法操作简单，测得结果准确度高，实验误差小，避免临床上对结核病人，尤其是肺外结核患者检测的假阴性问题；评估细胞/组织内结核分枝杆菌的存活率；评价结核杆菌感染的严重程度及临床药物治疗效果。

附图说明

图1为实施例1纯结核分枝杆菌绝对定量标准曲线图；

图2为实施例1结核分枝杆菌刺激感染巨噬细胞48h后扩增实验图像；

图3为实施例1人的内参基因β-actin绝对定量标准曲线图；

图4为实施例1人的内参基因β-actin扩增实验图像；

图5为实施例2纯结核分枝杆菌绝对定量标准曲线图；

图6为实施例2脊柱结核病人病灶组织中结核分枝杆菌扩增实验图像；

图7为实施例2人的内参基因β-actin绝对定量标准曲线图；

图8为实施例2人的内参基因β-actin扩增实验图像；

图中坐标含义如下：standardcurve：标准曲线；logstartingquantity起始拷贝数的对数；standard：标准品；x:待测样品；fam:羟基荧光素；e：扩增效率；r^2：相关系数；slope:斜率；y-int:y轴截距；cq：循环量；amplification:扩增；rfu：相对荧光单位；cycles：循环数。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明，但本发明并不局限于以下技术方案。

实施例1模拟结核杆菌侵染体内人体免疫细胞(巨噬细胞)，然后定量检测感染程度。

步骤(1)将人的thp-1细胞株用pma(佛波酯)诱导成巨噬细胞。

thp-1铺板浓度：6×10⁵cells/ml(24孔培养板)

pma(佛波酯)浓度：1.2ng/μl

步骤(2)用活的结核菌感染巨噬细胞48h，收集细胞，提取细胞dna(此时的dna中既含有thp-1诱导的巨噬细胞细胞的dna，又含有结核分枝杆菌dna)及rna(死亡的结核分枝杆菌不体现rna水平)。

提取细胞dna方法如下：

(1)在样品中加入trizol对细胞进行裂解，每200ul样品加入1mltrizol；

(2)在加入过trizol的样品中加入300ul氯仿。混匀，室温沉淀8分钟。12000rpm，离心10min；

(3)抽取上层水相，用于提取rna，剩余溶液用乙醇沉淀中间层和有机相中的dna。每使用1mltrizol加0.3ml无水乙醇混匀，室温放置3分钟，2～8℃12000rpm离心5分钟；

(4)移去上清，(如需分离蛋白质，可保留，进一步操作见后)用含10％乙醇的0.1m柠檬酸钠洗涤dna沉淀。每用1mltrizol加入1ml柠檬酸钠，室温放置30分钟，2-8℃12000rpm离心5分钟，弃上清，重复一次。

(5)用75％乙醇再洗一遍dna沉淀，每用1mltrizol加入1.5-2ml75％乙醇，室温放置10-20分钟(不时颠倒混合)2-8℃、12000rpm离心5分钟，弃上清。

(6)加50ul水或te溶液，溶解dna备用。

提取细胞rna方法如下：

(1)在样品中加入trizol对细胞进行裂解，每200ul样品加入1mltrizol。

(2)在加入过trizol的样品中加入300ul氯仿。混匀，室温沉淀8分钟。4℃，12000rpm，离心10min。

(3)抽取上层水相，加等体积异丙醇，室温静置30min或4℃过夜。4℃，12000rpm，离心10min，弃上清。

(4)加300-400ul75％乙醇，4℃，7000rpm，离心3min，弃上清。

(5)加30ul水或te溶液，溶解rna备用。

步骤(3)用takara逆转录试剂盒rr047a对rna进行反转录，得cdna。

步骤(4)用结核分枝杆菌16srna的引物、人的内参基因β-actin的dna引物分别对同一样本的cdna及dna模板进行qpcr绝对定量(目的是为了检测出模板中活的结核分枝杆菌特异基因的拷贝数和人的内参基因β-actin的dna拷贝数)。

1.real-timeqpcr绝对定量方法

1)标准品的建立

①以结核分枝杆菌16srna基因的rt-pcr产物为标准品，并已知该rt-pcr产物的碱基数；以人的内参基因β-actin的pcr产物作为标准品，所述标准品碱基数已知；

②使用微量核酸蛋白测定仪检测rt-pcr及pcr产物的cdna、dna浓度；

③根据以下公式计算出结核分枝杆菌16srna标准品的cdna拷贝数和人内参基因β-actin标准品的dna拷贝数：

拷贝数(copies/μl)＝(浓度ng/μl/相对分子质量)×6.02×1023×10^-9

(注：相对分子质量＝碱基对数目×660)

2)制作标准曲线

①对标准品进行1倍、10倍、100倍、1000倍、10000倍稀释，选择5个稀释度，涵盖待测样本中目的基因可能出现的全部浓度范围；

②以系列稀释的标准品为模板进行real-timeqpcr，以标准品拷贝数的对数为横坐标，以ct值(达到阈值的循环数)为纵坐标，绘制标准曲线；

③拷贝数与ct值应有良好的线性关系，r²为0.99或以上。

3)待测样本定量通过待测样本的ct值和标准曲线公式，可计算出样品中待测基因的拷贝数。

步骤(4)用结核分枝杆菌的cdna拷贝数/人的内参基因β-actin的dna拷贝数，得到thp-1细胞诱导的巨噬细胞中结核分枝杆菌的存活率。

结果分析：

1)纯结核分支杆菌绝对定量标准曲线见图1；

2)tb组结核分枝杆菌扩增实验图像见图2；

3)人的内参基因β-actin绝对定量标准曲线见图3；

4)人的内参基因β-actin扩增实验图像见图4；

5)结核分枝杆菌刺激感染巨噬细胞48h后细胞内细菌的存活率计算结果见表1。

表1结核分枝杆菌刺激感染巨噬细胞48h后的细菌存活率

实施例2采用脊柱结核病灶组织进行实验

实验操作同实施例1，脊柱结核病灶组织中结核杆菌的存活率见表2。

1)纯结核分枝杆菌绝对定量标准曲线见图5；

2)tb组结核分枝杆菌扩增实验图像见图6；

3)人的内参基因β-actin绝对定量标准曲线见图7；

4)人的内参基因β-actin扩增实验图像见图8；

表2结核分枝杆菌感染的患者组织中细菌的存活率

若将tb1、tb2、tb3病人的痰液采用直接涂片镜检方法进行检测结核杆菌，均出现阴性，由于病灶出现在脊柱，病人诊断为骨癌，手术过程中发现诊断失误，取出脊柱病灶组织，通过实施例2提供的方法可检测出脊柱中存在存活的结核杆菌，定量分析出病灶组织中结核杆菌的存活率，故本发明提供的方法检测结果更准确。